一種線蟲物理損傷的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種線蟲物理損傷的方法，包括以下步驟：將玻璃碎片均勻分布于NGM平板表面，取一塊帶有線蟲的NGM瓊脂塊，倒置于上述NGM平板上，按壓后放置25-35分鐘，然后將瓊脂塊轉(zhuǎn)移至新NGM平板上。應(yīng)用本發(fā)明的方法對(duì)線蟲樣本進(jìn)行物理損傷，造成的傷口淺，存活率高。同時(shí)對(duì)線蟲造成的傷口較多，損傷效果均一，重復(fù)性好，便于收集樣本。本方法中使用的材料簡(jiǎn)單，不需使用大型儀器設(shè)備，節(jié)約時(shí)間和使用成本，簡(jiǎn)便易行，便于進(jìn)行批量損傷，大批量損傷的線蟲適于應(yīng)用于傷口愈合的新藥篩選，具有廣闊應(yīng)用前景。
【專利說明】一種線蟲物理損傷的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及線蟲領(lǐng)域，特別涉及一種對(duì)線蟲進(jìn)行物理損傷的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]線蟲為線蟲動(dòng)物門(Aschelminthes)線蟲綱(Nematoda)所有婦蟲的通稱，系動(dòng)物界中數(shù)量最豐者之一，寄生于動(dòng)、植物，或自由生活于土壤、淡水和海水環(huán)境中。這里所說的線蟲特指秀麗隱桿線蟲(C.elegans)，是一種常見的、自由生活的小型土壤線蟲，以細(xì)菌為食。因其遺傳背景清楚、個(gè)體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生活史短、基因組測(cè)序完成等，秀麗隱桿線蟲作為模式生物在遺傳與發(fā)育生物學(xué)、行為與神經(jīng)生物學(xué)、衰老與壽命、人類遺傳性疾病、病原體與生物機(jī)體的相互作用、藥物篩選、動(dòng)物的應(yīng)急反應(yīng)、環(huán)境生物學(xué)和信號(hào)傳導(dǎo)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
[0003]在大多數(shù)動(dòng)物中，表皮是與外界環(huán)境接觸、抵御外界病原體和損傷的第一道屏障。目前的研宄表明，對(duì)秀麗隱桿線蟲表皮進(jìn)行物理損傷可以引起線蟲固有免疫應(yīng)答以及傷口愈合反應(yīng)，因此研宄秀麗隱桿線蟲的物理損傷有重大意義。目前對(duì)線蟲進(jìn)行物理損傷的研宄通常采用激光照射或顯微針刺的方法，由于秀麗隱桿線蟲成蟲體長(zhǎng)約1mm，肉眼難以辨另IJ，對(duì)其進(jìn)行激光照射或顯微針刺難度較大，若需要批量損傷，操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，損傷程度無法均一，樣本收集不方便，結(jié)果重復(fù)性較差，容易導(dǎo)致樣本死亡，且傷口數(shù)量少(見圖4)，無法滿足研宄的需要。之前的研宄證實(shí)，批量處理的線蟲可用于新藥篩選，將其分布于小分子化合物庫(kù)中，利用染料染色等方法可篩選得到目的化合物，因此我們需要一種可以簡(jiǎn)便的對(duì)大批量線蟲進(jìn)行物理損傷的方法，以用于進(jìn)行促進(jìn)傷口愈合的新藥篩選。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種簡(jiǎn)便易行的線蟲物理損傷新方法，利用玻璃碎片對(duì)線蟲進(jìn)行物理損傷，傷口多，存活率高，重復(fù)性好，可以滿足批量損傷的需要。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
[0006]本發(fā)明提供一種利用玻璃碎片對(duì)線蟲進(jìn)行物理損傷的方法，具體步驟為:于NGM平板表面鋪一層玻璃碎片，將帶有線蟲的NGM瓊脂塊帶有所述線蟲一面置于所述NGM平板的玻璃碎片上，適當(dāng)按壓所述NGM瓊脂塊讓瓊脂塊緊貼平板，放置25-35分鐘，然后將所述NGM瓊脂塊轉(zhuǎn)移至一新NGM平板上，得到損傷效果均一的線蟲樣本。
[0007]其中，所述玻璃碎片由毛細(xì)玻璃管研磨得到。優(yōu)選的，所述毛細(xì)玻璃管壁厚0.25mm。玻璃碎片依靠重力作用在水或乙醇中進(jìn)行分離，優(yōu)選75%乙醇溶液，達(dá)到去除過大或過小的碎片。由imagej進(jìn)行測(cè)量并分析每個(gè)玻璃碎片的最長(zhǎng)軸線，由此得到的所述玻璃碎片的最長(zhǎng)軸線為10-100um。將玻璃碎片用75%乙醇洗滌并儲(chǔ)存在M9緩沖液中，保持玻璃碎片的清潔和完整。
[0008]作為優(yōu)選的，所述線蟲為秀麗隱桿線蟲。
[0009]本發(fā)明中對(duì)線蟲樣本進(jìn)行物理損傷，造成的傷口較淺，不會(huì)對(duì)線蟲造成明顯的死亡，存活率高。同時(shí)對(duì)線蟲造成的傷口較多，損傷效果均一，重復(fù)性好，易得到損傷效果一致的樣本。另外，此方法便于收集樣本，所得到損傷效果一致的線蟲樣本直接收集到瓊脂塊上，減少了轉(zhuǎn)移環(huán)節(jié)，既節(jié)省程序，又減少了線蟲在轉(zhuǎn)移過程中的其它損傷和死亡。本方法中使用的材料簡(jiǎn)單，毛細(xì)玻璃管和NGM培養(yǎng)基均為常見常用實(shí)驗(yàn)材料；本方法不需使用大型儀器設(shè)備，一般實(shí)驗(yàn)室不具備激光共聚焦和顯微注射系統(tǒng)；本方法節(jié)約時(shí)間和使用成本，簡(jiǎn)便易行，適于進(jìn)行批量損傷。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明:
[0011]圖1是本發(fā)明物理損傷的方法示意圖；
[0012]圖2是研磨得到的玻璃碎片照片；
[0013]圖3是使用imagej進(jìn)行測(cè)量的玻璃碎片的最長(zhǎng)軸線；
[0014]圖4是正常線蟲表皮的照片；
[0015]圖5是顯微針刺對(duì)線蟲進(jìn)行物理損傷的傷口照片；
[0016]圖6是本發(fā)明方法線蟲進(jìn)行物理損傷的傷口照片；
[0017]圖7是不同方法對(duì)線蟲進(jìn)行物理損傷的存活率；
[0018]圖8是不同方法對(duì)線蟲進(jìn)行物理損傷的傷口數(shù)量；
[0019]圖9是使用本發(fā)明方法進(jìn)行物理損傷的線蟲結(jié)果均一性統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；
[0020]其中:1為玻璃碎片；2為瓊脂塊；3為線蟲；4為傷口。

【具體實(shí)施方式】
[0021]下面將結(jié)合本發(fā)明中的實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0022]實(shí)施例:
[0023]取一根0.25mm厚的毛細(xì)玻璃管，折斷成小段放入研缽中進(jìn)行研磨，直到玻璃碎片最長(zhǎng)軸線為10um以下。將研磨得到的玻璃碎片放入75%乙醇溶液中，依靠不同大小的碎片在溶液中靠重力的沉降時(shí)間的差異，除去過大或過小的碎片，得到的玻璃碎片用imagej進(jìn)行測(cè)量并分析，測(cè)得玻璃碎片的最長(zhǎng)軸線為1-1OOum(見圖3)。得到的玻璃碎片(見圖2)用于對(duì)線蟲進(jìn)行物理損傷。將得到的玻璃碎片用75%乙醇洗滌并儲(chǔ)存在M9緩沖液中待用。
[0024]制作一個(gè)秀麗隱桿線蟲生長(zhǎng)的NGM平板，將上述玻璃碎片均勻平鋪于NGM平板表面上，取一塊帶有數(shù)百條秀麗隱桿線蟲的NGM瓊脂塊，倒置于放有玻璃碎片的平板上，使秀麗隱桿線蟲與玻璃碎片充分接觸，輕壓瓊脂塊并放置25-35分鐘，以使玻璃碎片的尖銳邊緣對(duì)秀麗隱桿線蟲造成物理損傷。然后將瓊脂塊轉(zhuǎn)移至新NGM平板上，完成對(duì)秀麗隱桿線蟲的物理損傷。壓力不得過大，以免造成秀麗隱桿線蟲損傷過大，同時(shí)也要保持瓊脂塊的完整，便于后期的轉(zhuǎn)移。此過程示意圖見圖1。
[0025]對(duì)比例:
[0026]運(yùn)用顯微注射針刺線蟲的方法:將線蟲用Halocarbon oil (聚三氟氯乙稀)固定在agrose (瓊脂糖)蓋玻片上，在倒置顯微鏡下，使用顯微注射儀，對(duì)線蟲進(jìn)行針刺損傷，一次造成一個(gè)傷口，一般一次處理1-5條線蟲。
[0027]本發(fā)明中對(duì)線蟲樣本進(jìn)行物理損傷，造成的傷口較淺，存活率高。用玻璃碎片對(duì)線蟲進(jìn)行物理損傷，線蟲存活率為98%，針刺損傷存活率為53% (見圖7)。同時(shí)本發(fā)明的方法對(duì)線蟲造成的傷口較多，對(duì)線蟲進(jìn)行玻璃損傷的傷口數(shù)量與針刺方法的傷口數(shù)量比為6:I (見圖8)。使用本發(fā)明的方法對(duì)線蟲損傷效果均一，重復(fù)性好，易得到損傷效果一致的樣本。使用本方法物理損傷的線蟲進(jìn)行QPCR實(shí)驗(yàn)，結(jié)果重復(fù)性好，抗菌肽上調(diào)倍數(shù)在5.8至7.2之間(見圖9)。另外，此方法便于收集樣本，所得到損傷效果一致的線蟲樣本直接收集到瓊脂塊上，減少了轉(zhuǎn)移環(huán)節(jié)，既節(jié)省程序，又減少了線蟲在轉(zhuǎn)移過程中的其它損傷和死亡。本方法中使用的材料簡(jiǎn)單，不需使用大型儀器設(shè)備，節(jié)約時(shí)間和使用成本，簡(jiǎn)便易行，適于批量損傷。使用本方法大批量對(duì)線蟲進(jìn)行物理損傷后收集的樣本可進(jìn)行促進(jìn)傷口愈合的新藥篩選。
[0028]上述實(shí)施方式旨在舉例說明本發(fā)明可為本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員實(shí)現(xiàn)或使用，對(duì)上述實(shí)施方式進(jìn)行修改對(duì)本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，故本發(fā)明包括但不限于上述實(shí)施方式，任何符合本權(quán)利要求書或說明書描述，符合與本文所公開的原理和新穎性、創(chuàng)造性特點(diǎn)的方法、工藝、產(chǎn)品，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種線蟲物理損傷的方法，其特征在于，包括以下步驟:于風(fēng)通平板表面鋪一層玻璃碎片，將帶有線蟲的風(fēng)通瓊脂塊帶所述線蟲一面置于上述風(fēng)通平板的玻璃碎片上，適當(dāng)按壓所述風(fēng)通瓊脂塊讓瓊脂塊緊貼平板，放置25-35分鐘，然后將所述風(fēng)通瓊脂塊轉(zhuǎn)移至一新風(fēng)通平板上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的線蟲物理損傷的方法，其特征在于，所述玻璃碎片的最長(zhǎng)軸線為10-100亂
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的線蟲物理損傷的方法，其特征在于，所述玻璃碎片由毛細(xì)玻璃管研磨得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的線蟲物理損傷的方法，其特征在于，所述毛細(xì)玻璃管厚0.25臟0
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的線蟲物理損傷的方法，其特征在于，所述玻璃碎片依靠重力作用在水或乙醇中進(jìn)行分離，得到所述最長(zhǎng)軸線為10-100110的碎片。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的線蟲物理損傷的方法，其特征在于，鋪設(shè)與所述風(fēng)通平板之前將所述玻璃碎片用75%乙醇洗滌并儲(chǔ)存在19緩沖液中。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的線蟲物理損傷的方法，其特征在于，所述線蟲為秀麗隱桿線蟲。
【文檔編號(hào)】A01K67/033GK104472438SQ201410675207
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月21日
【發(fā)明者】張惠敏, 朱怡, 張?jiān)? 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)