酸棗內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌新菌株sz23及發(fā)酵液的制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】酸棗內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌新菌株SZ23及發(fā)酵液的制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明公開(kāi)了一株解淀粉芽孢桿菌（ Bacillus amyloliquefaciens ）新菌株SZ23，于2014年7月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.9481。本發(fā)明詳細(xì)描述了解淀粉芽孢桿菌新菌株SZ23的形態(tài)特征、生理生化指標(biāo)及16S rDNA序列測(cè)定結(jié)果等。經(jīng)抑菌試驗(yàn)表明，本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌新菌株SZ23的發(fā)酵液對(duì)梨黑斑病菌、西瓜枯萎病菌、辣椒枯萎病菌、番茄早疫病菌、黃瓜枯萎病菌、棉花立枯病菌、小麥赤霉病菌和番茄灰霉病菌等8種病菌均具有較好的抑菌活性，抑菌率在55.6%～92.2%，說(shuō)明酸棗內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌新菌株SZ23具有較好的廣譜性抑菌作用。經(jīng)生產(chǎn)性試驗(yàn)，本發(fā)明新菌株SZ23的發(fā)酵液對(duì)梨黑斑病的防治效果在75%以上。
CGMCC No.9481
20140725
【專利說(shuō)明】酸棗內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌新菌株SZ23及發(fā)酵液的制備方 法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物內(nèi)生細(xì)菌的利用領(lǐng)域，具體地說(shuō)是涉及一種酸棗內(nèi)生解淀粉芽孢 桿菌（ifeciBiAs 新菌株SZ23及發(fā)酵液的制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 植物內(nèi)生細(xì)菌（endophytic bacteria)是生存在植物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間隙的細(xì) 菌，它能夠與其建立和諧關(guān)系。植物內(nèi)生細(xì)菌不會(huì)引起植物的表型特征或功能發(fā)生變化。 Paestur在1876年從葡萄中獲得內(nèi)生細(xì)菌后人們才真正開(kāi)始了植物內(nèi)生細(xì)菌的研宄。1992 年Kleopper第一次提出"植物內(nèi)生細(xì)菌"（endophytic bacteria)的概念，使得植物學(xué)家、 微生物學(xué)家和微生態(tài)學(xué)家對(duì)其進(jìn)行了大量的研宄。目前研宄已經(jīng)證實(shí)內(nèi)生細(xì)菌存在于健康 植物體內(nèi)，還具有各種生物學(xué)作用，如促生、固氮、防治病蟲(chóng)害和降解重金屬等。利用內(nèi)生細(xì) 菌防治植物病害的研宄也是生物防治的熱點(diǎn)之一。
[0003] 內(nèi)生細(xì)菌已成為植物微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分之一，內(nèi)生細(xì)菌能夠增強(qiáng)植物 對(duì)惡劣環(huán)境的適應(yīng)能力，改善系統(tǒng)生態(tài)平衡，保持寄主植物健康生長(zhǎng)。利用內(nèi)生細(xì)菌作為生 防因子具有很大優(yōu)勢(shì)，體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：（1)植物內(nèi)生細(xì)菌在植物組織中不僅獲得充 足營(yíng)養(yǎng)，而且通過(guò)植物組織保護(hù)，不會(huì)受外界環(huán)境如高溫、干旱、強(qiáng)光等影響，具有穩(wěn)定的生 存環(huán)境，易于發(fā)揮其生物防治作用。（2)在植物被病原因子侵入后，無(wú)論易感植株或抗病植 株，都會(huì)產(chǎn)生抗生素、植保素等抗菌物質(zhì)提高自身免疫，這些抗菌物質(zhì)會(huì)對(duì)土壤或植物根際 的細(xì)菌有拮抗作用。而內(nèi)生細(xì)菌長(zhǎng)期寄生在植物體內(nèi)，導(dǎo)致其細(xì)胞特性與腐生類細(xì)菌不同， 會(huì)對(duì)植物抗菌毒性物質(zhì)產(chǎn)生抗性，使植物的自身防衛(wèi)系統(tǒng)不會(huì)對(duì)其造成影響，因而作為生 防菌更具有優(yōu)勢(shì)。（3)植物內(nèi)生細(xì)菌分布在植物根、莖、葉等各種器官中，方便病菌侵入后直 接作用于病菌等致病因子，或產(chǎn)生拮抗物質(zhì)運(yùn)輸?shù)交疾〔课唬蚴辜闹髦参锂a(chǎn)生誘導(dǎo)抗性。
[4] 將內(nèi)生細(xì)菌的某些抗病或抗菌基因?qū)肫渌こ碳?xì)菌中，通過(guò)高產(chǎn)代謝物作為生物農(nóng) 藥防治病蟲(chóng)害，不僅對(duì)環(huán)境友好，還可避免病原菌產(chǎn)生抗藥性。如將棉花內(nèi)生細(xì)菌抗蟲(chóng)基因 導(dǎo)入Bt工程菌中，通過(guò)有效發(fā)酵液制成生物農(nóng)藥來(lái)防治玉米莖蛀螟和棉花的蚜蟲(chóng)。
[0004] 植物內(nèi)生細(xì)菌生防作用機(jī)制主要包括產(chǎn)生次生代謝物、競(jìng)爭(zhēng)生態(tài)位、誘導(dǎo)寄主產(chǎn) 生系統(tǒng)抗性及產(chǎn)生胞外溶菌酶降解病原菌細(xì)胞壁等方式。其中，產(chǎn)生次生代謝物抑制植物 病原菌生長(zhǎng)是植物內(nèi)生細(xì)菌生防機(jī)制中一個(gè)重要組成部分，目前發(fā)現(xiàn)內(nèi)生芽孢桿菌屬所產(chǎn) 生的拮抗物質(zhì)主要有三大類：（1)蛋白類。包括多肽類、幾丁質(zhì)酶、抗菌蛋白，已報(bào)道的部 分抗菌蛋白對(duì)蛋白酶、肽酶等多種酶不敏感。（2)抗菌肽?？咕姆肿咏Y(jié)構(gòu)一般為環(huán)狀或 線狀，具有分子量低、水溶性好、熱穩(wěn)定、耐強(qiáng)堿性和廣譜抗菌等特點(diǎn)，如plipastatinBl、 FungicinM-4和bacillomycinD等。（3)脂肽類。脂肽類物質(zhì)易溶于水，有良好的表面活性， 但易被降解。另外有些芽孢桿菌還可產(chǎn)生多烯類、香豆素、大環(huán)內(nèi)酯類、酚類物質(zhì)、含有雙糖 的氨基糖苷類抗生素等抗菌物質(zhì)。
[0005] 內(nèi)生細(xì)菌的篩選須考慮植物的種植年齡、生長(zhǎng)環(huán)境、抗病蟲(chóng)、食用和藥用價(jià)值等。 種植年代越久的植物，其內(nèi)生細(xì)菌的種類可能更豐富，抗病蟲(chóng)性強(qiáng)的植物內(nèi)生細(xì)菌也常會(huì) 分泌與寄主相似的抗菌和殺蟲(chóng)活性物質(zhì)。
[0006] 酸賽acit/oj'wj'wAa C. Y ChengetM. J. Liu)是鼠李科（Rhamnaceae 賽屬 Mill.)植物。酸棗的環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，可在低洼鹽堿及干旱裂縫中上生長(zhǎng)，也可 在高溫多雨及風(fēng)沙寒冷中生長(zhǎng)。酸棗果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分豐富，果仁可以入藥，使用價(jià)值高，是一 種綠色的健康果品。酸棗中富含糖類、有機(jī)酸及多種的維生素，其中的維生素 P具有健腦 功能及維生素 E可以促進(jìn)血液循環(huán)和組織生長(zhǎng)。酸棗仁具有靜心、補(bǔ)肝、生津等藥用價(jià)值。 另外酸棗中還含有皂苷、黃酮、三萜類、生物堿類、多種脂肪酸和氨基酸等對(duì)人體有益的化 學(xué)成分。因此，根據(jù)酸棗藥用性及較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性和抗病能力，以內(nèi)生細(xì)菌的研宄技術(shù)為 基礎(chǔ)，對(duì)酸棗的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離、篩選、鑒定，并對(duì)其抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)生條件及抗菌物質(zhì) 分離純化等方面進(jìn)行研宄。該研宄對(duì)利用植物內(nèi)生細(xì)菌開(kāi)發(fā)新生物農(nóng)藥提供了理論和物質(zhì) 基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供酸棗內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌新菌株SZ23及發(fā)酵液的制備方 法。
[0008] 本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0009] 酸賽內(nèi)生解淀粉芽抱桿菌（ifeciBws 新菌株SZ23于2014 年7月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 9481，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研宄所。
[0010] 所述的酸賽內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌新菌株SZ23是 從山西省太谷地區(qū)的酸棗植株根組織為材料分離得到的內(nèi)生細(xì)菌。
[0011] 將酸棗內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌新菌株SZ23在NA培養(yǎng)基上30°C恒溫培養(yǎng)，初期菌落 呈乳白色、圓形、膿狀、邊緣整齊、菌落隆起，表面粘稠；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落變干，出 現(xiàn)褶皺，顏色變?yōu)闇\黃色（圖1)。經(jīng)掃描電鏡觀察（圖2)，菌株SZ23菌體呈桿狀，周生鞭毛， 大?。?. 87?1. 3) μπιΧ (1. 5?2. 8) μπι。該菌革蘭氏染色陽(yáng)性，產(chǎn)芽孢。根據(jù)《常見(jiàn)細(xì) 菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株SZ23進(jìn)行了生理生化鑒定，結(jié)果見(jiàn)表1。
[0012] 表1菌株SZ23的生理生化特征 π=,................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................' ^

【權(quán)利要求】
1. 一株解淀粉芽抱桿菌（新菌株SZ23,于2014年7月 25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 9481。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌（新菌株 SZ23,其特征在于，解淀粉芽孢桿菌（ifeciBys 新菌株SZ23是從山 西省太谷地區(qū)的酸棗植株根組織為材料分離得到的內(nèi)生細(xì)菌；將解淀粉芽孢桿菌新菌株 SZ23在NA培養(yǎng)基上30°C恒溫培養(yǎng)，初期菌落呈乳白色、圓形、膿狀、邊緣整齊、菌落隆起，表 面粘稠；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌落變干，出現(xiàn)褶皺，顏色變?yōu)闇\黃色，經(jīng)掃描電鏡觀察，菌 株SZ23菌體呈桿狀，周生鞭毛，大?。?.87?1.3) ymX (1.5?2.8) ym，該菌革蘭氏染 色陽(yáng)性，產(chǎn)芽孢，根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株SZ23進(jìn)行了生理生化鑒定，結(jié)果如 下表所示： 菌株SZ23的生理生化特征
注：+表示呈陽(yáng)性反應(yīng)；一表示呈陰性反應(yīng). 提取新菌株SZ23的DNA，經(jīng)PCR反應(yīng)后得到一條約為1500bp左右的DNA片段，測(cè) 序后獲得序列1451bp，將其上傳至GenBank獲取登錄號(hào)為KF483660,序列在NCBI網(wǎng)站 Blast 比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與 (GU125620)和 (GQ199598)相似度都達(dá)到100% ;構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示菌株SZ23與Bacillusamyloliquefaciens熱Bacillussubtilisl%一類，在系統(tǒng)發(fā)育上親緣關(guān) 系較近；結(jié)合形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)，確定新菌株SZ23為解淀粉芽孢桿菌 amyloliquefaciens)BadIlusamyloliquefaciens〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌（新菌株 SZ23發(fā)酵液的制備方法如下： (1) 種子液制備從試管斜面上用接種針挑取菌株SZ23到斜面培養(yǎng)基上，恒溫25°C培 養(yǎng)24h后接種到裝有IOOmL的LB培養(yǎng)液的三角瓶中，180r/min振蕩培養(yǎng)12h，制得解淀粉 芽孢桿菌新菌株SZ23的種子液； (2) 發(fā)酵液制備將解淀粉芽孢桿菌新菌株SZ23的種子液按照1%的比例接入由質(zhì)量 體積份的可溶性淀粉20份、酵母浸膏5份、蛋白胨10份、K2HPO4 *3H20 2份、蒸餾水1000份 制成的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件是：25 - 35°C、初始pH為9. 0、搖床轉(zhuǎn)速180 - 200r/min 震蕩培養(yǎng)30h，制得解淀粉芽孢桿菌新菌株SZ23的發(fā)酵液。
4. 用解淀粉芽孢桿菌（新菌株SZ23發(fā)酵液防治梨黑斑 病的方法是： 在梨果采收前3?5天用噴霧器在果實(shí)表面噴灑解淀粉芽孢桿菌新菌株SZ23的發(fā)酵 液的50倍稀釋液，選擇天氣晴朗、日照充足的時(shí)間段實(shí)施防治； 或 將解淀粉芽孢桿菌新菌株SZ23發(fā)酵液用水稀釋50倍，梨果采摘后立即用該稀釋液浸 泡2 min?3 min，置于塑料周轉(zhuǎn)箱，待果實(shí)自然晾干后再入保鮮庫(kù)預(yù)冷、貯藏，注意在自然 晾干過(guò)程中，避免將梨果與土壤等其他可能攜帶病原菌的物質(zhì)接觸。
【文檔編號(hào)】A01N63/02GK104498386SQ201410683826
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月25日
【發(fā)明者】劉慧平, 劉 東, 劉慧芹, 張寶俊, 韓巨才, 張曉宇, 任璐 申請(qǐng)人:山西農(nóng)業(yè)大學(xué)