用于trv介導的基因沉默體系中的指示基因及其載體的構(gòu)建方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于TRV介導的基因沉默體系中的指示基因，其堿基序列如SEQ ID NO：1所示。本發(fā)明病毒誘導基因沉默是一種用反向遺傳學研究植物基因功能的優(yōu)良工具，本發(fā)明為煙草脆裂病毒誘導的基因沉默技術提供了一個非常優(yōu)良的指示基因載體，本發(fā)明的指示基因載體構(gòu)建簡易，沉默表型顯著，性狀表現(xiàn)持久，為快速的基因功能研究起到良好的指示作用。
【專利說明】用于TRV介導的基因沉默體系中的指示基因及其載體的構(gòu)建方法與應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體涉及一種指示基因載體、構(gòu)建方法和用途。

【背景技術】
[0002]病毒介導的基因沉默(virus-1nduced gene silencing, VIGS)是研究植物基因功能的一種重要方法，具有簡便、快速高效、不需要對植物進行復雜遺傳轉(zhuǎn)化和可以對致死基因進行功能研究等特點。近年來，多種VIGS載體相繼得到開發(fā)并在多種植物中得到廣泛的應用。其中，煙草脆裂病毒(TRV)是目前應用最廣泛的VIGS載體，它是由TRVl與TRV2兩條RNA病毒鏈組成，TRVl用于輔助載有靶基因片段的TRV2在植物體內(nèi)移動。TRV作為病毒載體有諸多優(yōu)點，比如病毒癥狀較輕、沉默效率高且持久、各種組織均可產(chǎn)生沉默等，因而被廣泛應用。尤其是Liu等人改進后的煙草脆裂病毒載體TRV2 (pYL156和pYL279)，在載體中插入了雙倍CaMV35S啟動子，在C端插入了 I個核酶，可導致更有效的病毒RNA產(chǎn)生；而且也拓展了應用范圍，除了應用在本氏煙和茄屬的2個種外，還適用于番茄、煙草、辣椒等作物。
[0003]類胡蘿卜素是一類由異戊二烯組成的萜類化合物，在動植物中都有重要的生理功能和生物活性。類胡蘿卜素在植物光合作用中擔負著光吸收的輔助色素的重要功能，主要存在于植物葉片的葉綠體以及許多花和果實的有色體中，具有吸收和傳遞電子的能力，并在清除光合作用中產(chǎn)生的葉綠素三線態(tài)和單線態(tài)及超氧陰離子等自由基方面起著重要的作用。通常的，在TRV-VIGS實驗中，TRV1-TRV2 (TRV)菌液混合注射作為陰性對照，TRV1-TRV2-PDS (TRV-PDS)菌液混合注射作為陽性對照。八氫番茄紅素脫氫酶(/--)是類胡蘿卜素合成通路上一個關鍵基因，具有保護葉綠素免受光漂白的作用。/--基因發(fā)生沉默后，mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，導致類胡蘿卜素合成途徑被阻斷，從而使被侵染植物新生葉片表現(xiàn)出白化效應，可以直觀的用肉眼觀察，常被作為各種病毒VIGS體系的指示基因，來驗證VIGS體系在植物中沉默成功。
[0004]ζ_胡蘿卜素脫氫酶(勿5)基因是類胡蘿卜素生物合成途徑中又一重要基因，緊鄰/--基因下游，主要參與線狀類胡蘿卜素的生物合成，催化胡蘿卜素向番茄紅素的轉(zhuǎn)化，促進分支途徑其他類胡蘿卜素的合成?；蜃鳛門RV介導的VIGS體系的指示基因在國際上還未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種可用于TRV病毒介導基因沉默體系中的指示基因載體及其應用，并公開了該指示基因載體的構(gòu)建方法。
[0006]本發(fā)明的技術方案是:用于TRV介導的基因沉默體系中的指示基因，其堿基序列如 SEQ ID NO:1 所示。
[0007]用于TRV介導的基因沉默體系中的指示基因載體的構(gòu)建方法，它的步驟如下: (1)以普通煙草紅花大金元旺長期幼葉CDNA為模板進行PCR擴增，測序得到普通煙草Zi?編碼區(qū)全長序列1785 bp，共編碼594個氨基酸；
(2)分別以ZDS-F和ZDS-R為引物，以紅花大金元旺長期幼葉片cDNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠提取試劑盒從瓊脂糖凝膠上純化目標ZDS DNA片段，純化的ZDS DNA片段與pMD19-T載體連接，在42 V的條件下熱激轉(zhuǎn)化90s入大腸桿菌DH5a，從得到的克隆轉(zhuǎn)化子中用菌落PCR鑒定陽性克隆，提取陽性克隆質(zhì)粒ZDS-T ；
(3)以ΖΛ5基因5'端782-1414的633bp的基因片段作為VIGS體系特異性核酸沉默片段，選取ΚρηΙ和Xhol限制性酶切位點設計引物，以ZDS-T質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，回收純化PCR產(chǎn)物，使用ΚρηΙ和Xhol酶切PCR回收片段和TRV2病毒載體，回收目的片段并連接，連接液轉(zhuǎn)化細菌，構(gòu)建TRV2-ZDS VIGS載體。
[0008]3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于TRV介導的基因沉默體系中的指示基因載體的構(gòu)建方法，其特征在于:所述步驟(2)中ZDS-F和ZDS-R引物序列如下:
ZDS-F: 5' -ATGGCTACTTCTTCAGCTTATCTTTG-3'
ZDS-R:5/ -TCAGACAAGACTCAACTCATCAGATAC-3'。
[0009]所述的用于TRV介導的基因沉默體系中的指示基因載體的構(gòu)建方法，所述步驟
(3)中ΚρηΙ和Xhol限制性酶切位點引物序列如下:
ΚρηΙ 限制性酶切位點:5, -ATGGATCC ATCCTGTCGCATATGCTCTTGGA-3'；
Xhol 限制性酶切位點:5, -CACTCGAG GAGGCATGTAAGGGTCACCAGGT -3'。
[0010]用于TRV介導的基因沉默體系中的指示基因在本氏煙中的應用。
[0011]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明病毒誘導基因沉默是一種用反向遺傳學研究植物基因功能的優(yōu)良工具，本發(fā)明為煙草脆裂病毒誘導的基因沉默技術提供了一個非常優(yōu)良的指示基因載體，本發(fā)明的指示基因載體構(gòu)建簡易，沉默表型顯著，性狀表現(xiàn)持久，為快速的基因功能研究起到良好的指示作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1:TRV2_ZDS載體構(gòu)建示意圖；
圖2:指示基因ΖΛ5沉默表型圖，WT，未注射煙草對照植株；TRV，注射TRV空載體對照植株；TRV-ZDS，注射指示基因片段菌液植株；
圖3:指示基因/--沉默表型圖，TRV-PDS，注射指示基因片段/^5菌液植株；
圖4:指示基因ΖΛ5在本氏煙TRV介導的病毒誘導基因沉默體系中基因表達量。WT，未注射煙草對照植株；TRV，注射TRV空載體對照植株；TRV-ZDS，注射指示基因片段ZDS菌液植株。

【具體實施方式】
[0013]1.ΖΛ5基因的同源克隆及ZDS-TRV VIGS載體構(gòu)建
通過NCBI搜索ΖΛ5基因序列，在ATG和TGA處設計保守引物。以普通煙草紅花大金元cDNA為模板進行PCR擴增，回收目的片段，T-A連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DH5a )感受態(tài)，37 V過夜培養(yǎng)，菌落PCR鑒定得到陽性克隆。陽性質(zhì)粒提取，最后測序得到普通煙草ΖΛ5編碼區(qū)全長序列。獲得編碼區(qū)(⑶S)全長序列1785 bp，共編碼594個氨基酸。ΖΛ5編碼區(qū)堿基序列如SEQ ID N0:1所示。將測序正確的ΖΛ5基因序列與其他植物ΖΛ5基因序列進行比對，找到保守區(qū)域，本發(fā)明選取基因5'端782-1414的633 bp的基因片段作為VIGS體系特異性核酸沉默片段，VIGS體系特異性核酸沉默片段的堿基序列如SEQ ID N0:2所示，考慮TRV病毒載體PYL156酶切位點和ΖΛ5基因序列分析結(jié)果，選取KpnI和XhoI限制性酶切位點設計引物，進行PCR擴增，通過酶切，連接反應，構(gòu)建TRV2-ZDS VIGS載體，其構(gòu)建示意圖見圖1。
[0014]具體方法如下所述:
分別以 ZDS-F 和 ZDS-R (5，-ATGGCTACTTCTTCAGCTTATCTTTG-3’ 和 5’ -TCAGACAAGACTCAACTCATCAGATAC-3’ )為引物，以紅花大金元旺長期幼葉片cDNA (RNA提取按照QIAGEN公司RNA提取試劑盒說明書進行,并按照TaKaRa公司Reverse transcript1n system試劑盒說明書，以Oligo (dT) 18為引物合成cDNA第一鏈)為模板進行PCR擴增，PCR反應條件為94 °C, 3 min ；94 °C, 30 S，58 °C, 30 S，72 °C, I min 45 S，35 cycles ；72 °C, 10 min ；4°C，pause。反應體系 50 yL:cDNA 模板 2 yL，上下游引物各 2.5 μ L (10 yM),dNTPs 4μ L(10 μ Μ), 10 XBuffer 5 μ L，HiFi酶(北京全式金生物技術有限公司)0.5 yL，無菌水33.5 UL0 PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠提取試劑盒(Gel Extract1n KIT，購自QIAGENE)從瓊脂糖凝膠上純化目標ZDS DNA片段(方法參照試劑盒說明書)，用Eppendorf公司B1Photometer測定濃度后用于連接或存-20 ° C備用。純化的ΖΛ? DNA片段與PMD19-T載體(TaKaRa公司，氨芐霉素抗性)連接(Solut1n I，TaKaRa公司，按照試劑盒說明書操作)，熱激轉(zhuǎn)化(42 V 90s)入大腸桿菌DH5a (TaKaRa公司)。從得到的克隆轉(zhuǎn)化子中用菌落PCR (引物為上述擴增引物)鑒定陽性克隆，提取陽性克隆質(zhì)粒ZDS-T (小提質(zhì)粒試劑盒，QIAGENE,方法參照試劑盒說明書進行)。
[0015]構(gòu)建TRV2-ZDS 載體:所用弓 I物為 5' -ATGGATCC ATCCTGTCGCATATGCTCTTGGA-3'(包含 KpnI 酶切位點)和 5' -CACTCGAG GAGGCATGTAAGGGTCACCAGGT -3'(包含XhoI 酶切位點);以上述測序正確的ZDS-T質(zhì)粒為模板進行擴增，PCR反應條件為:94 °C, 3 min ；94 °C，30 s，60 °C, 30 s，72 °C, 35 s，35 cycles ；72 °C, 10 min ；4 °C，pause。反應體系 50 μ L:ZDS-T 質(zhì)粒 2 μ L，上下游引物(10 μ Μ)各 2.5 μ L, dNTPs (10 μ Μ) 4 μ L, 1XBuffer 5μ L，HiFi酶(北京全式金生物技術有限公司)0.5 μ L，無菌水33.5 μ L?；厥占兓疨CR產(chǎn)物。使用KpnI和XhoI酶切PCR回收片段和TRV2(pYL156)病毒載體，酶切體系(50 yL體系)為:ZDS-VIGS 回收片段(或 TRV2 載體，約 100 ng/μ L)25 μ L ；ΚρηΙ (10 U/μ L7TaKaRa公司)2.5 μ L ；XhoI (10 U/μ L, TaKaRa 公司)2.5 μ L ；Μ Buffer 5 μ L ；ddH20 15 μ L。酶切條件:37 °C酶切4h?；厥漳康钠尾⑦B接，連接體系(10 μ L體系)為:ZDS-VIGS酶切回收片段4 yL;TRV2酶切回收片段I μ L ;Solut1n I連接試劑(TaKaRa) 5 μ L。連接條件:16 °C連接4 h。連接液轉(zhuǎn)化細菌(DH5a，TaKaRa公司)，菌落PCR鑒定陽性克隆，提質(zhì)粒得到目的載體，酶切驗證并測序，得到測序正確的TRV2-ZDS載體。
[0016]2.ZDS-TRV-VIGS指示體系在本氏煙中的應用
病毒誘導的基因沉默具有簡便、快速、高效的優(yōu)點，是研究植物基因功能的一種重要的方法。本發(fā)明利用煙草脆裂病毒介導的基因沉默，在本氏煙中下調(diào)了基因的表達，在Zi?基因部分沉默的情況下，本氏煙草表型發(fā)生了顯著變化。
[0017]煙草脆裂病毒載體感染能力較強，病毒癥狀輕，空載體(TRV1-TRV2)侵染與對照植株生長發(fā)育無明顯差異(圖1)。TRV-Zds (TRV1-TRV2-ZDS)混合陽性菌株接種本氏煙草后，煙株中ΖΛ5基因表達被抑制，新生葉片都顯現(xiàn)出嚴重白化現(xiàn)象，株高明顯變矮，長勢不強，但不致死，與/--基因沉默后表型極其相似(圖2)。注射的20棵煙株中，侵染發(fā)病率100%，表型一致，定量PCR檢測ΖΛ5轉(zhuǎn)錄表達水平僅有對照植株的10% (甚至更低)(圖3)，ZDSm因作為TRV VIGS沉默體系指示基因效果非常顯著，為TRV介導的病毒誘導基因沉默體系提供了一個良好的可選指示基因，說明本發(fā)明所開發(fā)的ZDS-TRV-VIGS體系的指示作用與國際通用的H)S-TRV-VIGS指示體系達到同等效果。
[0018]具體方法如下所述:
(1)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌:取TRV1、TRV2、TRV-ZDS、TRV-PDS質(zhì)粒1 μ L，加入含0.1 mL的GV3101農(nóng)桿菌感受態(tài)的EP管中，冰上放置30min ;將含有該質(zhì)粒的農(nóng)桿菌感受態(tài)放入液氮速凍lmin，然后37°C溫育5min ;加入1 mL LB液體培養(yǎng)基，28°C震蕩培養(yǎng)3 h ;5，000 rpm離心lmin，棄去上清，加入200 μ L LB液體培養(yǎng)基，重懸沉淀；取200 μ L重懸液(即轉(zhuǎn)化產(chǎn)物)均勻地涂于含25 mg / mL利福平(Rif, Sigma)和50 mg / mL卡那霉素(kana, Sigma)的LB平板上，28°C培養(yǎng)2-3天；挑取適量的轉(zhuǎn)化菌斑PCR鑒定無誤后，搖菌注射本氏煙煙苗。
[0019](2)煙草準備:本氏煙草于溫室中栽培。培養(yǎng)條件為(23 ±1)°C，光照16 h，黑暗8 h，(60±2) %的相對濕度；長到5-6片展開葉時用于農(nóng)桿菌注射。
[0020](3)煙草注射:挑取轉(zhuǎn)化成功的克隆，劃線28°C培養(yǎng)過夜(LB培養(yǎng)基，50 mg / mLRif, 50 mg / mL Kana ;挑取上述過夜菌接種到 5 mL LB (25 mg / mL Rif, 50 mg / mLKana)中28°C培養(yǎng)過夜；將上述過夜的菌液吸取200 mL轉(zhuǎn)接到20 mL LB (10 mM 2_(N_嗎琳代)乙橫酸(MES) + 20 μ Μ 乙酸丁香麗(Sigma) + 25mg / mL Rif +50 mg / mL Kana)中，28°C培養(yǎng)過夜；離心收集上述菌液，然后重懸在LB (10 mM MgCl2 +10 mM MES + 200μΜ乙酰丁香酮)中，調(diào)0D600 = 1.0，在室溫下靜置3小時；按TRV1:TRV2 (或TRV-ZDS或TRV-PDS) = 1:1注射煙草，注射時要注射近軸端的嫩葉；注射后觀察表型，進行檢測。
[0021]ZDS沉默后定量PCR檢測引物序列為:ZDS-Q-R:5' -TGAAATAGGGGAGCTTGATTTCCGC-3' ；ZDS-Q-F:5/ -GAGCATATGCGACAGGATCCCAC-3'。
【權(quán)利要求】
1.用于TRV介導的基因沉默體系中的指示基因，其堿基序列如SEQID NO:1所示。
2.用于TRV介導的基因沉默體系中的指示基因載體的構(gòu)建方法，其特征在于，它的步驟如下: Cl)以普通煙草紅花大金元旺長期幼葉cDNA為模板進行PCR擴增，測序得到普通煙草Zi?編碼區(qū)全長序列1785 bp，共編碼594個氨基酸； (2)分別以ZDS-F和ZDS-R為引物，以紅花大金元旺長期幼葉片cDNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠提取試劑盒從瓊脂糖凝膠上純化目標ZDS DNA片段，純化的ZDS DNA片段與pMD19-T載體連接，在42 V的條件下熱激轉(zhuǎn)化90s入大腸桿菌DH5a，從得到的克隆轉(zhuǎn)化子中用菌落PCR鑒定陽性克隆，提取陽性克隆質(zhì)粒ZDS-T ； (3)以ΖΛ5基因5'端782-1414的633bp的基因片段作為VIGS體系特異性核酸沉默片段，選取KpnI和XhoI限制性酶切位點設計引物，以ZDS-T質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，回收純化PCR產(chǎn)物，使用KpnI和XhoI酶切PCR回收片段和TRV2病毒載體，回收目的片段并連接，連接液轉(zhuǎn)化細菌，構(gòu)建TRV2-ZDS VIGS載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于TRV介導的基因沉默體系中的指示基因載體的構(gòu)建方法，其特征在于:所述步驟(2)中ZDS-F和ZDS-R引物序列如下:
ZDS-F: 5' -ATGGCTACTTCTTCAGCTTATCTTTG-3' ZDS-R:5/ -TCAGACAAGACTCAACTCATCAGATAC-3'。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于TRV介導的基因沉默體系中的指示基因載體的構(gòu)建方法，其特征在于:所述步驟(3)中KpnI和XhoI限制性酶切位點引物序列如下: KpnI 限制性酶切位點:5' -ATGGATCC ATCCTGTCGCATATGCTCTTGGA-3'； XhoI 限制性酶切位點:5' -CACTCGAG GAGGCATGTAAGGGTCACCAGGT -3'。
5.用于TRV介導的基因沉默體系中的指示基因在本氏煙中的應用。
【文檔編號】A01H5/00GK104480124SQ201410691491
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月27日
【發(fā)明者】楊冉, 史艷梅, 王燃, 屈凌波, 林福呈, 羅朝鵬, 李鋒, 魏春陽, 楊軍 申請人:鄭州大學