植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeZFP2及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeZFP2及其編碼基因和應(yīng)用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明的抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白及其編碼基因?qū)Ω牧?、增?qiáng)煙草抗逆性，提高產(chǎn)量、加速抗逆分子育種進(jìn)程，以及有效節(jié)省水資源具有十分重要的理論和實(shí)際意義。
【專利說(shuō)明】植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeZFP2及其編碼基因和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeZFP2 及其編碼基因和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 小麥作為我國(guó)重要的糧食作物之一，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有非常重要的地位。然而，在 我國(guó)干旱地區(qū)的耕地面積約為5. 7億畝，鹽堿地約為5. 54億畝，每年因干旱、鹽堿等逆境我 國(guó)對(duì)小麥造成的減產(chǎn)達(dá)700-800億公斤，嚴(yán)重影響著小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)，制約著我國(guó)小麥 糧食生產(chǎn)的快速發(fā)展。
[0003] 隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，利用基因工程技術(shù)從分子水平上深入研宄植物與非 生物逆境之間的關(guān)系，揭示植物對(duì)逆境脅迫信號(hào)傳導(dǎo)及基因表達(dá)調(diào)控分子機(jī)理，為培育作 物抗逆新種質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor, TF)，又稱反式作用因 子，是指能夠與基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件（cis-acting element)發(fā)生特異性相互 作用的結(jié)合蛋白，該蛋白通過(guò)它們之間以及與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用激活或抑制 特定基因的轉(zhuǎn)錄，在抗逆基因表達(dá)調(diào)控中起著重要作用。近年來(lái)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與 功能分析來(lái)鑒定、闡明各種條件下基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理得到了廣泛關(guān)注（劉強(qiáng)等，2000)。 Yamaguchi-Shinozaki等人的研宄表明：利用rd29A啟動(dòng)子啟動(dòng)AtDREBlA基因的表達(dá)， 能夠有效提高小麥對(duì)干旱、高鹽和低溫的抗性（Yamaguchi-Shinozaki et al.，2002)。 GmDREB3基因的超量表達(dá)能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草植株對(duì)干旱和低溫脅迫的耐性（Chen et al.，2007)。將棉花GhDREB基因轉(zhuǎn)化小麥品種揚(yáng)麥10號(hào)，轉(zhuǎn)基因小麥的耐旱、耐鹽性得 到明顯提尚(Gao et al. , 2009) 〇
[0004] 研宄表明：鋅指蛋白作為一類轉(zhuǎn)錄因子而廣泛地參與基因表達(dá)的調(diào)控。鋅指蛋白 最初于1983年在非洲爪蟾卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子TF III A中被發(fā)現(xiàn)（Miller et al.，1985)， 是迄今在真核生物基因組中分布最廣的一類蛋白。它的得名是由于其結(jié)構(gòu)特征，幾個(gè)保守 的氨基酸（一般為Cys和His)與一個(gè)或多個(gè)鋅離子結(jié)合，形成一個(gè)在蛋白質(zhì)中相對(duì)獨(dú)立 的區(qū)域。鋅指基序無(wú)論在結(jié)構(gòu)還是功能上都是多樣的，它不僅可以結(jié)合DNA和RNA，還能與 DNA-RNA雜交雙鏈分子以及其他鋅指蛋白或自身結(jié)合，也可以通過(guò)和膜的結(jié)合來(lái)起作用。根 據(jù)鋅指的保守基序的特點(diǎn)，可以將鋅指蛋白分成9類：C2H2型、C8型、C6型、RING型、C2HC 型、LIM 型（C2HC5)、C4 型、C3H 型和 C4HC3 型（Berg et al.，1996)。
[0005] RING型鋅指大約在19年前被界定為一種新的鋅指結(jié)構(gòu)域，分離得到的第一 個(gè)RING型鋅指蛋白基因?yàn)槿祟怰eally Interesting New Genes I(RINGl)，它參與多 種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和調(diào)控途徑（Zeba et al.，2009)。RING型鋅指蛋白又分為兩個(gè)亞類： RING-HC (C3HC4)和 RING-H2(C3H2C3) (Kam et al.，2007)。RING-HC 本身含有 40-60 個(gè) 氨基酸殘基，它的保守序列為 Cys-X2-Cys-X (9 - 39) -Cys-X (I - 3) -His-X (2 - 3) -Cys/ His-X-Cys-X-Cys-X-Cys，其中 X 代表任意氨基酸（Borden et al·，1996)。RING-H2 基序 與RING-HC的不同在于第四個(gè)半胱氨酸殘基變?yōu)榻M氨酸殘基（Freemont et al·，2000) 〇 目前，在動(dòng)物、植物和微生物等各種生物體中已經(jīng)分離得到了許多RING型鋅指蛋白。一些 RING型鋅指蛋白被認(rèn)為參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的某些過(guò)程和蛋白與蛋白的相互作用，之后的研宄顯 示，許多RING型鋅指具有泛素連接酶E3活性，可以和泛素結(jié)合酶E2特異性反應(yīng)，從而促進(jìn) 泛素化。為了保護(hù)自身的結(jié)構(gòu)不被破壞，細(xì)胞內(nèi)的蛋白降解必須具有高度的選擇性，所以現(xiàn) 在普遍認(rèn)為，RING型鋅指的泛素連接酶E3活性介導(dǎo)的泛素化對(duì)于細(xì)胞具有至關(guān)重要的作 用。
[0006] 不同來(lái)源的同一類型鋅指蛋白的功能也具有多樣性，例如C3HC4型鋅指蛋白在病 毒、酵母、動(dòng)植物具有各種不同功能，如腫瘤形成、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、過(guò)氧化物酶的產(chǎn)生、發(fā)育、轉(zhuǎn)錄 調(diào)節(jié)等（Borden et al.，2000)。此外，不同類型的鋅指蛋白的功能具有多樣性，例如C2H2 型、RING型鋅指蛋白可能在逆境脅迫中發(fā)揮重要作用，而C2HC型、C4HC3型鋅指蛋白可能在 發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
[0007] 本發(fā)明利用RT-PCR的方法，從長(zhǎng)穗偃麥草cDNA中克隆到了一個(gè)新的C2H2型鋅指 蛋白基因 EeZFP2,并對(duì)其進(jìn)行了亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄激活及表達(dá)特性分析。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo) 法將該基因轉(zhuǎn)入了煙草中，對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草在培養(yǎng)基上進(jìn)行了耐旱和耐鹽鑒定。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn) 入EeZFP2基因的表達(dá)提高了煙草對(duì)干旱和鹽脅迫的耐受性，過(guò)量表達(dá)EeZFP2轉(zhuǎn)錄因子基 因一定程度上提高了煙草的抗逆能力，轉(zhuǎn)基因植株發(fā)育不產(chǎn)生任何負(fù)面作用，這對(duì)抗逆分 子育種改良和提高作物的抗逆性及抗旱、節(jié)水農(nóng)業(yè)生產(chǎn)會(huì)產(chǎn)生巨大推動(dòng)作用和經(jīng)濟(jì)效益， 具有重要理論和實(shí)踐意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeZFP2。
[0009] 本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋EeZFP2的編碼基因。
[0010] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
[0011] 本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
[0012] 本發(fā)明的另一目的提供上述植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeZFP2的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明所提供的抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeZFP2,來(lái)源于長(zhǎng)穗偃麥草，其氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。
[0014] 本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子由239個(gè)氨基酸殘基組成，是Zinc-finger類轉(zhuǎn)錄因子，長(zhǎng)為 720bp的DNA序列，命名為EeZFP2。自SEQ ID NO. 1的氨基末端第85?107位之間和第 147?169位之間各含有一個(gè)C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域，每個(gè)鋅指基序中都含有一段保守的氨基 酸序列QALGGH，表明EeZFP2基因編碼一個(gè)典型的植物C 2H2型雙鋅指蛋白。
[0015] SEQ ID NO. 1 ：
[0016] I MAVEAVLEAA TMVPSPPSKE MEASSSTSEE ASALLGQAEG WSKRKRSRRQ RALDPSEEEY 61 LALCLLMLAH GHRDSSPAAA PEQQHGCSVC GKVFASYQAL GGHKASHRKP TAAPTGAEDQ 121 KPQAAVAAAS SSGSGEAAAG AGGGKVHECN VCRKTFPTGQ ALGGHKRCHY DGTIGSAASG 181 PTQKLAAKAA AASATAASRG FDLNLPALPD 工PERCTVTEE) GSEVLSPVSF KKPRLMIPA
[0017] 為了使蛋白EeZFP2便于純化，可在由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白 質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[0018] 表1標(biāo)簽的序列
[0019]

【權(quán)利要求】
1. 一種植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeZFP2,其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所 不〇
2. -種植物抗旱、耐鹽相關(guān)基因，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的植物抗旱、耐鹽 相關(guān)蛋白EeZFP2。
3. 如權(quán)利要求2所述的植物抗旱、耐鹽相關(guān)基因，其特征在于，其堿基序列如SEQ ID NO. 2所示。
4. 包含權(quán)利要求2或3所述植物抗旱、耐鹽相關(guān)基因的重組表達(dá)載體。
5. 包含權(quán)利要求2或3所述植物抗旱、耐鹽相關(guān)基因的重組表達(dá)載體35S-EeZFP2。
6. 包含權(quán)利要求2或3所述植物抗旱、耐鹽相關(guān)基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。
7. 權(quán)利要求1所述植物抗旱、耐鹽相關(guān)蛋白EeZFP2的應(yīng)用。
8. 權(quán)利要求2或3所述植物抗旱、耐鹽相關(guān)基因的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A01H5/00GK104497113SQ201410718162
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月1日
【發(fā)明者】高世慶, 趙昌平, 唐益苗, 郭麗香 申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院