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基于微閥的雙檢測微流控芯片及糖尿病模型構(gòu)建方法

文檔序號:11011123閱讀:779來源:國知局
基于微閥的雙檢測微流控芯片及糖尿病模型構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明主要涉及微流控芯片和糖尿病研究,基于微閥的雙檢測微流控芯片及糖尿病模型構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)有技術(shù)中,微流控芯片(microfluidic chip)又稱芯片實驗室(lab on achip),指的是把生物和化學(xué)等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上,由微通道形成網(wǎng)絡(luò),以可控流體貫穿整個系統(tǒng),用以取代常規(guī)生物或化學(xué)實驗室的各種功能的一種技術(shù)。它的基本特征和最大優(yōu)勢是多種單元技術(shù)在微小平臺上的靈活組合和規(guī)模集成。發(fā)展至今,微流控芯片技術(shù)已經(jīng)開始在生命科學(xué)的不同領(lǐng)域得到應(yīng)用,并已成為系統(tǒng)生物學(xué)研究中的重要技術(shù)平臺之一。同時,秀麗隱桿線蟲以其生命周期和壽命短、全身透明、全基因組測序等特征,成為生物學(xué)研究領(lǐng)域中常用的一種重要模式生物。最近,微流控芯片因其與秀麗隱桿線蟲尺寸匹配、環(huán)境可控、通量高、易于實現(xiàn)自動化、集成化等特征而成為線蟲相關(guān)研究的重要平臺。
[0003]糖尿病作為一種危及人類健康的疾病,越來越受到廣泛關(guān)注,而秀麗隱桿線蟲作為一種模式生物,并且由于胰島素信號通路基因的保守性,成為了糖尿病研究的熱點,但是現(xiàn)有的技術(shù)難以實現(xiàn)對單線蟲進行相關(guān)的糖尿病研究。人們期待一種單個線蟲長期培養(yǎng)及觀察的簡易平臺用于研究糖尿病等疾病并對相關(guān)的藥物進行高通量的篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、通量高的微流控芯片平臺并用于構(gòu)建秀麗隱桿線蟲的糖尿病模型,具體說是一種基于微閥的運動成雙像檢測的用于構(gòu)建秀麗隱桿線蟲的糖尿病模型的PDMS(聚二甲基硅氧烷)微流控芯片平臺。
[0005]本發(fā)明基于微閥的雙檢測微流控芯片,所述芯片由三層組成,上層為用于線蟲培養(yǎng)及固定的液路層,中間層為可形變PDMS膜,下層為氣路控制層;
[0006]所述液路層由20?50個線蟲分析功能單元組成,所有功能單元共用一個中心廢液池;每個分析功能單元由蟲及藥品入口、進樣通道、線蟲固定及培養(yǎng)室、廢液通道組成;蟲及藥品入口通過進樣通道與線蟲固定及培養(yǎng)室連接,然后通過廢液通道連接到與其它分析功能單元共用的中心廢液池;
[0007]氣路控制層的氣路通道中設(shè)有閥,控制氣路通道,氣路通道在線蟲固定及培養(yǎng)室下方,由氣體正壓驅(qū)動,用于進行線蟲固定;
[0008]所述液路層為基于SU8模板所得的PDMS模塊,氣路層是在制作成功的氣路SU8模板上甩一層高于模板20 μπι的PDMS膜,所述液路層的PDMS模板有結(jié)構(gòu)一側(cè)封接到氣路層PDMS膜無結(jié)構(gòu)一側(cè),然后將其有氣路閥結(jié)構(gòu)一側(cè)等離子鍵合到潔凈的玻璃或平整的PDMS塊上;
[0009]該芯片可作為施加高濃度葡萄糖條件誘使線蟲產(chǎn)生糖尿病相關(guān)特性,并對該條件下的線蟲生命狀態(tài)進行研究。
[0010]所述線蟲固定及培養(yǎng)室的尺寸為2mmX ImmX 80 μ mD
[0011]所述進樣通道為楔形通道,最寬處的寬度為250 μ m,最窄處的寬度為35 μ m,長度為 1.2mmο
[0012]所述廢液通道與培養(yǎng)室連接處由一系列小通道組成,第一排的通道寬度為25 μπι,共有三個;第二排的通道寬度為30 μm,共有兩個;兩排分別交錯居中分布。
[0013]所述閥由氣體正壓驅(qū)動。
[0014]所述閥寬度為2.1mm0
[0015]所述芯片的材料均為PDMS聚合物,采用PDMS軟刻蝕及PDMS模塊之間的可逆封接和PDMS與玻璃基底之間的不可逆封接技術(shù)構(gòu)建。
[0016]一種基于微閥的雙檢測微流控芯片的糖尿病模型構(gòu)建方法,采用上述基于微閥的雙檢測微流控芯片,按照以下步驟進行:
[0017]將單個線蟲加入蟲及藥品入口處,利用負(fù)壓驅(qū)動的方式,將單個蟲引入線蟲固定及培養(yǎng)室,培養(yǎng)室的尺寸可使其自由游動;
[0018]熒光成像時利用氣壓使PDMS膜形變,將蟲體壓在進樣通道側(cè)壁上使其固定并成像;
[0019]每天進行三次物質(zhì)交換,為添加新鮮食物并施加葡萄糖或者藥物刺激,排出線蟲代謝廢物,方式為負(fù)壓抽取。
[0020]通過對培養(yǎng)室中的線蟲進行高濃度葡萄糖刺激,使線蟲體內(nèi)糖濃度達到與人類糖尿病患者相似的糖濃度,并研究在該條件下線蟲的壽命和氧化應(yīng)激變化。
[0021]通過對培養(yǎng)室中的線蟲進行加藥刺激,可以對治療糖尿病的藥物進行高通量篩選。
[0022]本發(fā)明基于微閥的秀麗隱桿線蟲長期培養(yǎng)及雙檢測微流控芯片,其閥的操控方法如下:成像時利用正壓將閥控制下的PDMS膜壓下,使蟲體被壓在通道側(cè)壁上,實現(xiàn)蟲的固定并進行熒光成像,成像后釋放線蟲,使其恢復(fù)自由運動狀態(tài)。
[0023]本發(fā)明采用通道設(shè)計,操作簡單,且易于實現(xiàn)物質(zhì)交換,有利于線蟲的長期培養(yǎng);線蟲固定方法采用膜形變的方式,對蟲體安全無害,可對單個線蟲進行長期培養(yǎng)及運動、成像雙檢測。
[0024]本發(fā)明有以下優(yōu)點:
[0025](I)采用通道灌流的方式進行食物添加及廢液排出,操作簡單,效率高,有利于線蟲的長期培養(yǎng)。
[0026](2)培養(yǎng)室同樣作為線蟲固定成像通道,且蟲的固定方式對蟲體無損傷,方法簡單,通量高。
[0027](3)單個培養(yǎng)室中培養(yǎng)單個線蟲的設(shè)計使得每只蟲的壽命、運動行為及熒光特征得到實時及長期追蹤,可滿足生物研究的需要。
[0028](4)單閥控制,簡化芯片結(jié)構(gòu),并使操作更簡單。
【附圖說明】
:
[0029]圖1芯片結(jié)構(gòu)示意圖;(a)為液路層結(jié)構(gòu),(b)為氣路層結(jié)構(gòu),
[0030]圖2每個分析功能單元放大圖,
[0031]其中:1為蟲及藥品入口,2為進樣通道,3為線蟲固定及培養(yǎng)室,4為線蟲分選處,5為廢液通道,6為廢液池,7為氣路控制閥,8為氣路通道,9為防塌陷小柱;
[0032]圖3不同糖濃度對野生型線蟲N2壽命的影響圖;(a)圖為糖對線蟲存活率的影響,(b)圖為糖對線蟲平均壽命的影響;
[0033]圖4不同糖濃度對突變型蟲株CL2166氧化應(yīng)激表達的影響圖。
【具體實施方式】
[0034]實施例1
[0035]實驗室自行設(shè)計并制作的微流控芯片:制備基于微閥的雙檢測微流控芯片的材料為PDMS聚合物,液路和氣路之間的封接采用可逆封接,而氣路與玻璃片之間的封接采用等離子體不可逆封接。
[0036]該芯片由三層組成,上層為液路層,中間層PDMS膜,下層氣路控制層。
[0037]其中液路層由30個線蟲分析功能單元組成,所有功能單元共用一個中心廢液池6 ;每個分析功能單元由蟲及藥品入口 1、進樣通道2、線蟲固定及培養(yǎng)室3(尺寸為2mmX ImmX80 μπι)、廢液通道4組成(圖2);蟲及藥品入口 I通過進樣通道2與線蟲固定及培養(yǎng)室3連接,然后通過廢液通道4通向與其它分析功能單元共用的中心廢液池6 ;
[0038]氣路控制層的氣路通道8中設(shè)有閥7 (寬度為2_),控制氣路通道8,氣路通道8在線蟲固定及培養(yǎng)室3下方,由氣體正壓驅(qū)動,用于進行線蟲固定。
[0039]所述液路層為基于SU8模板所得的PDMS模塊,氣路層是在制作成功的氣路SU8模板上甩一層高于模板20 μπι的PDMS膜,所述液路層的PDMS模板有結(jié)構(gòu)一側(cè)封接到氣路層PDMS膜無結(jié)構(gòu)一側(cè),然后將其有氣路閥結(jié)構(gòu)一側(cè)等離子鍵合到潔凈的玻璃或平整的PDMS塊上;
[0040]該芯片可作為施加高濃度葡萄糖條件誘使線蟲產(chǎn)生糖尿病相關(guān)特性,并對該條件下的線蟲生命狀態(tài)進行研究。
[0041]所述線蟲固定及培養(yǎng)室3的尺寸為2mmX ImmX 80 μ m0
[0042]所述進樣通道2為楔形通道,最寬處的寬度為250 μ m,最窄處的寬度為35 μπι,長度為1.2mm。
[0043]所述廢液通道5與培養(yǎng)室3連接處由一系列小通道組成,第一排的通道寬度為25 μm,共有三個;第二排的通道寬度為30 μm,共有兩個;兩排分別交錯居中分布。
[0044]所述閥7由氣體正壓驅(qū)動。
[0045]所述閥7寬度為2.1mm。
[0046]所述芯片的材料均為PDMS聚合物,采用PDMS軟刻蝕及PDMS模塊之間的可逆封接和PDMS與玻璃基底之間的不可逆封接技術(shù)構(gòu)建。
[0047]使用前事先灌好線蟲培養(yǎng)液K Medium。秀麗隱桿線蟲野生型蟲株N2及突變型蟲株CL2166瓊脂板上培養(yǎng)至大蟲后,進行bleach操作將大量卵取出,并使其孵化,長至L4期。將L4期線蟲進樣到入口,芯片共30個單元,利用負(fù)壓將蟲子進樣到培養(yǎng)室中。各個單元相互獨立,進樣互不干擾,可達到單個培養(yǎng)室都只有單條蟲。
[0048]利用實驗室自行設(shè)計并制作的微流控芯片系統(tǒng),將線蟲野生型N2擬合至幼蟲L4期后引入芯片中進行長期培養(yǎng),施加不同濃度的葡萄糖,對線蟲的壽命進行記錄,如圖3所示,在高糖條件的培養(yǎng)下線蟲的壽命縮短5天左右。
[0049]利用實驗室自行設(shè)計并制作的微流控芯片系統(tǒng),研究不同糖濃度對線蟲氧化應(yīng)激的表達強度影響:
[0050]采用帶有氧化應(yīng)激綠色熒光蛋白(GFP)表達的線蟲突變型蟲株CL2166進行相關(guān)實驗,當(dāng)外界因素致氧化應(yīng)激產(chǎn)生時,GFP表達增強。在本實驗新型中,外界因素為不同濃度的葡萄糖溶液,觀察在不同糖濃度下線蟲的氧化應(yīng)激表達情況,如圖4所示,在高糖條件下,線蟲的GFP熒光強度明顯增強,說明高糖會增強氧化應(yīng)激。
[0051]本發(fā)明采用了單閥控制,使線蟲的操縱更加簡單;對進樣通道的寬度和長度進行了調(diào)整,使線蟲在固定成像時不會從入口處進入到培養(yǎng)室外;對閥的寬度進行了調(diào)整,避免了由于PDMS形變引起的無法固定線蟲的情況;對廢液通道與培養(yǎng)室的連接處進行了改進,足以使剛孵化的幼蟲從廢液通道被抽離培養(yǎng)室,保證了培養(yǎng)室的單線蟲培養(yǎng),無需外界加藥;并針對該單線蟲的培養(yǎng)平臺進行了糖尿病模型的構(gòu)建;設(shè)計簡單并且具有實用價值。
【主權(quán)項】
1.一種基于微閥的雙檢測微流控芯片,其特征在于:所述芯片由三層組成,上層為用于線蟲培養(yǎng)及固定的液路層,中間層為可形變PDMS膜,下層為氣路控制層, 所述液路層由20?50個線蟲分析功能單元組成,所有功能單元共用一個中心廢液池;每個分析功能單元由蟲及藥品入口、進樣通道、線蟲固定及培養(yǎng)室、廢液通道組成;蟲及藥品入口通過進樣通道與線蟲固定及培養(yǎng)室連接,然后通過廢液通道連接到與其它分析功能單元共用的中心廢液池; 所述氣路控制層的氣路通道中設(shè)有閥,控制氣路通道,氣路通道在線蟲固定及培養(yǎng)室下方,由氣體正壓驅(qū)動,用于進行線蟲固定; 所述液路層為基于SU8模板所得的PDMS模塊,氣路層是在制作成功的氣路SU8模板上甩一層高于模板20 μ m的PDMS膜,所述液路層的PDMS模板有結(jié)構(gòu)一側(cè)封接到氣路層PDMS膜無結(jié)構(gòu)一側(cè),有氣路閥結(jié)構(gòu)一側(cè)等離子鍵合到潔凈的玻璃或平整的PDMS塊上; 該芯片可作為施加高濃度葡萄糖條件誘使線蟲產(chǎn)生糖尿病相關(guān)特性,并對該條件下的線蟲生命狀態(tài)進行研究。2.按照權(quán)利要求1所述的基于微閥的雙檢測微流控芯片,其特征在于:所述線蟲固定及培養(yǎng)室的尺寸為2mmX ImmX 80 μ m。3.按照權(quán)利要求1所述的基于微閥的雙檢測微流控芯片,其特征在于:進樣通道為楔形通道,最寬處的寬度為250 μ m,最窄處的寬度為35 μ m,長度為1.2mm。4.按照權(quán)利要求1所述的基于微閥的雙檢測微流控芯片,其特征在于:廢液通道與培養(yǎng)室連接處由一系列小通道組成,第一排的通道寬度為25 μ m,共有三個;第二排的通道寬度為30 μm,共有兩個;兩排分別交錯居中分布。5.按照權(quán)利要求1所述的基于微閥的雙檢測微流控芯片,其特征在于:所述閥由氣體壓驅(qū)動。6.按照權(quán)利要求1所述的基于微閥的雙檢測微流控芯片,其特征在于:所述閥寬度為2.1mm07.按照權(quán)利要求1所述的基于微閥的雙檢測微流控芯片,其特征在于:在氣路層增加了防塌陷小柱結(jié)構(gòu),防止在封接時導(dǎo)致氣路層無法連通。8.按照權(quán)利要求1所述的基于微閥的雙檢測微流控芯片,其特征在于:所述芯片的材料均為PDMS聚合物,采用PDMS軟刻蝕及PDMS模塊之間的可逆封接和PDMS與玻璃基底之間的不可逆封接技術(shù)構(gòu)建。9.按照權(quán)利要求1所述的基于微閥的雙檢測微流控芯片的糖尿病模型構(gòu)建方法,采用上述基于微閥的雙檢測微流控芯片,其特征在于按照以下步驟進行: 將單個線蟲加入蟲及藥品入口處,利用負(fù)壓驅(qū)動的方式,將單個蟲引入線蟲固定及培養(yǎng)室,培養(yǎng)室的尺寸可使其自由游動; 熒光成像時利用氣壓使PDMS膜形變,將蟲體壓在進樣通道側(cè)壁上使其固定并成像; 每天進行三次物質(zhì)交換,為添加新鮮食物并施加葡萄糖或者藥物刺激,排出線蟲代謝廢物,方式為負(fù)壓抽取。10.按照權(quán)利要求9所述的基于微閥的雙檢測微流控芯片的糖尿病模型構(gòu)建方法,其特征在于:通過對培養(yǎng)室中的線蟲進行高濃度葡萄糖刺激,使線蟲體內(nèi)糖濃度達到與人類糖尿病患者相似的糖濃度,并研究在該條件下線蟲的壽命和氧化應(yīng)激變化; 所述孔板培養(yǎng)中使用糖濃度為100mM-200mM。11.按照權(quán)利要求9所述的基于微閥的雙檢測微流控芯片的糖尿病模型構(gòu)建方法,其特征在于:通過對培養(yǎng)室中的線蟲進行加藥刺激,可以對治療糖尿病的藥物進行高通量篩選。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種基于微閥的雙檢測微流控芯片及糖尿病模型構(gòu)建方法。該芯片由三層PDMS組成,上層為液路層,下層為氣路控制層,上下兩層中間為PDMS膜,膜在氣壓作用下發(fā)生形變以實現(xiàn)線蟲固定?;谖㈤y的雙檢測微流控芯片的糖尿病模型構(gòu)建方法,將單個線蟲加入蟲及藥品入口處,將單個蟲引入線蟲固定及培養(yǎng)室;熒光成像時利用氣壓使PDMS膜形變,將蟲體壓在進樣通道側(cè)壁上使其固定并成像;每天進行三次物質(zhì)交換,為添加新鮮食物并施加葡萄糖或者藥物刺激,排出線蟲代謝廢物。本發(fā)明采用通道設(shè)計,操作簡單,且易于實現(xiàn)物質(zhì)交換,有利于線蟲的長期培養(yǎng);線蟲固定方法采用膜形變的方式,對蟲體安全無害,可對單個線蟲進行長期培養(yǎng)及運動、成像雙檢測。
【IPC分類】A01K67/033
【公開號】CN105707010
【申請?zhí)枴緾N201410736591
【發(fā)明人】秦建華, 朱國麗, 尹方超
【申請人】中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
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