一種馬藺游離花粉培養(yǎng)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種馬藺游離花粉培養(yǎng)方法，包括：外植體的選擇與消毒，接種培養(yǎng)，培養(yǎng)獲得愈傷組織；繼代增殖培養(yǎng)，生根培養(yǎng)，煉苗移栽等步驟。本發(fā)明首次采用馬藺花藥作為外植體對(duì)馬藺進(jìn)行快速繁殖，并且繁殖效率高，在繼代增殖過(guò)程中，將未污染的愈傷組織轉(zhuǎn)入第一繼代培養(yǎng)基中使芽增殖，繼代5次，轉(zhuǎn)入第二繼代培養(yǎng)基或不添加任何激素的空白培養(yǎng)基中繼代一次，然后再轉(zhuǎn)入第一繼代培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，這種操作大大降低了繼代培養(yǎng)過(guò)程中的變異率，提高了繁殖效率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種馬藺游罔花粉培養(yǎng)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種馬藺游離花粉培養(yǎng)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 馬藺，多年生密叢草本。根狀莖粗壯，木質(zhì)，斜伸，外包有大量致密的紅紫色折斷的 老葉殘留葉鞘及毛發(fā)狀的纖維。生于荒地、路旁、山坡草地，尤以過(guò)度放牧的鹽堿化草場(chǎng)上 生長(zhǎng)較多。耐鹽堿、耐踐踏，根系發(fā)達(dá)，可用于水土保持和改良鹽堿土。
[0003] 馬藺還具有重要的藥用、飼用和工業(yè)價(jià)值。馬藺利用年限長(zhǎng)，產(chǎn)草量高，營(yíng)養(yǎng)成分 豐富，為各類(lèi)牲畜尤其是綿羊喜食。馬藺的花、種子、根均可人藥?；〞窀煞每衫蛲ū悖?種子和根可除濕熱、止血、解毒種子有退燒、解毒、驅(qū)蟲(chóng)的功效。作為纖維植物，可以代替麻 生產(chǎn)紙、繩，葉是編制工藝品的原料，根可以制作刷子。真可謂"馬藺全身是寶"。
[0004] 為克服利用馬藺種子發(fā)芽進(jìn)行有性繁殖的局限性，北京草業(yè)與環(huán)境研究發(fā)展中心 與北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心于2002年開(kāi)展合作研究，篩選出了"成熟種胚----誘導(dǎo)愈傷 組織一一綠苗分化一一繼代增殖一一生根一一試管苗移栽"等全過(guò)程中各環(huán)節(jié)的最佳 培養(yǎng)基和操作程序，從而建立起一套行之有效的馬藺組織培養(yǎng)快繁體系，為實(shí)現(xiàn)馬藺快速 無(wú)性繁殖，大幅度降低馬藺建植成本，奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，也為今后開(kāi)展馬藺體細(xì)胞無(wú)性系 變異體篩選乃至基因工程改良等生物技術(shù)育種工作奠定了可靠的技術(shù)基礎(chǔ)。
[0005] "馬藺組織培養(yǎng)快速繁殖體系的研究"（肖闊，中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)，碩士論文，2003) -文 中，同樣公開(kāi)了采用成熟種胚進(jìn)行馬藺組織培養(yǎng)快速繁殖的，并且系統(tǒng)公開(kāi)了其快速繁殖 體系的建立。
[0006]目前，馬藺的無(wú)性繁殖一般采用的是成熟種胚，但是種子采集比較困難，并且不易 采收到成熟種子，因此在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中會(huì)受到限制。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)目前存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種馬藺游離花粉培養(yǎng)方法，可以快速有效的 繁殖馬藺，成活率較高，打破種子繁殖受限制的問(wèn)題，并且不受季節(jié)的影響，大幅度降低增 殖成本，滿足規(guī)?；a(chǎn)需要。
[0008] 為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0009] -種馬藺游離花粉培養(yǎng)方法，包括：
[0010] 1)外植體的選擇與消毒：取單核靠邊期的花藥進(jìn)行消毒處理；
[0011] 2)接種培養(yǎng)：接種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)獲得愈傷組織；
[0012] 3)繼代增殖培養(yǎng)：將未污染的愈傷組織轉(zhuǎn)入第一繼代培養(yǎng)基中使芽增殖，繼代5 次，轉(zhuǎn)入第二繼代培養(yǎng)基或不添加任何激素的空白培養(yǎng)基中繼代一次，然后再轉(zhuǎn)入第一繼 代培養(yǎng)基中繼續(xù)增殖，根據(jù)需苗量重復(fù)上述步驟；
[0013] 4)生根培養(yǎng)：接種生根培養(yǎng)基，篩選獲得單體植株；
[0014] 5)煉苗移栽：先將培養(yǎng)瓶移至溫室，自然條件下煉苗3?5d，待馬藺苗健壯且有 5-7片真葉、6-8cm高時(shí)，然后解開(kāi)封口膜，煉苗6?7d，煉苗完成后取出小苗洗凈根部附著 的培養(yǎng)基，移栽到經(jīng)消毒的基質(zhì)中，溫度控制在24-26°C，前7d濕度控制在70%左右，以后 逐漸降低濕度，直至將移栽苗置于自然條件下，煉苗移栽期間適當(dāng)遮光，使光照強(qiáng)度為自然 光的40%。
[0015] 所述的消毒處理是將花藥用無(wú)菌紗布包裹浸入70-75 %濃度的酒精中消毒 l〇-16s，快速取出立即浸入漂白粉中浸泡lOmin，最后用無(wú)菌水沖洗4?6次。
[0016]所述的接種培養(yǎng)基為：MS+6-BA 1. Omg/L+NAA 0? 2mg/L;
[0017] 所述接種培養(yǎng)基的PH為6.0,培養(yǎng)溫度為25±l°C，12h/d的光周期，光照強(qiáng)度 600Lx〇
[0018]所述的第一繼代培養(yǎng)基為 1/2MS+6-BA1. 0mg/L+2,4-D 0? lmg/L+NAA 0? 2mg/L+瓊 脂 5g/L+ 蔗糖 20g/L ;
[0019] 所述第二繼代培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA0?3mg/L+NAA0?lmg/L+白砂糖24g/L+瓊脂 8g/L ；
[0020] 所述空白培養(yǎng)基為1/2MS+蔗糖30g/L;
[0021] 所述繼代培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基的PH為6. 0,培養(yǎng)溫度為25±l°C，24h/d的光周期， 光照強(qiáng)度lOOOLx。
[0022] 所述的生根培養(yǎng)基為：1/2MS+IAA 0? lmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L+活性炭質(zhì)量 比 0? 1%?0? 3% ;
[0023]所述生根培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)基的PH為6. 0,培養(yǎng)溫度為25± 1°C，24h/d的光周期， 光照強(qiáng)度1200LX。
[0024] 有益效果：
[0025] (1)將花藥作為馬藺快速繁殖的外植體，還屬于首創(chuàng)，發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量長(zhǎng)期實(shí)踐 操作，發(fā)現(xiàn)將花藥作為外植體可以長(zhǎng)期保持其優(yōu)良的性狀，并且出愈率高。將花藥作為外 植體，具有花粉萌發(fā)成胚時(shí)間短、加倍效率高、產(chǎn)量大及較容易獲得優(yōu)良育種中間材料等優(yōu) 點(diǎn)，在育種材料提純復(fù)壯、種質(zhì)資源創(chuàng)新、多倍體育種及花粉發(fā)育進(jìn)程研究等方面內(nèi)容，具 有較大的實(shí)用價(jià)值；
[0026] (2)發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在工廠化育苗過(guò)程中，繼代超過(guò)5代左右，開(kāi)始出現(xiàn)變異，經(jīng)研究 發(fā)現(xiàn)，上述原因是激素累積導(dǎo)致，因此，在繼代培養(yǎng)過(guò)程中，采用了轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基的方法，減少 激素的累積給馬藺苗的影響；
[0027] (3)本發(fā)明培養(yǎng)過(guò)程速度快，再生頻率較高，變異率較低，周期相對(duì)較短，能較好地 保持馬藺的遺傳穩(wěn)定性。

【具體實(shí)施方式】
[0028](一）外植體的選擇
[0029] 將采收的花藥、成熟的種胚、莖尖、花瓣、莖節(jié)、葉片、未成熟種子分別作為外植體 進(jìn)行對(duì)比，分別在合適的季節(jié)進(jìn)行采收，采收后馬上進(jìn)行操作，其余條件相同，并且按照本 發(fā)明的步驟進(jìn)行，見(jiàn)表1，從對(duì)比可以看出，葉片、未成熟種子不適于做馬藺組織培養(yǎng)的材 料，莖節(jié)雖然出現(xiàn)了愈傷組織，但是在繼代過(guò)程中生長(zhǎng)緩慢，生根質(zhì)量較差。莖尖和成熟的 種胚都可以作為馬藺組織培養(yǎng)的材料，但是其愈傷組織的誘導(dǎo)率和生根率相對(duì)較低，并且 變異率相對(duì)較高，采用花藥作為外植體，不僅愈傷組織的誘導(dǎo)率和生根率最高，分別可以達(dá) 到82 %、92 %，而且經(jīng)過(guò)5代繼代培養(yǎng)沒(méi)有產(chǎn)生變異，可以解決馬藺繁殖過(guò)程中容易出現(xiàn)變 異的難題。
[0030]表1
[0031]

【權(quán)利要求】
1. 一種馬藺游離花粉培養(yǎng)方法，其特征在于，包括： 1) 外植體的選擇與消毒：取單核靠邊期的花藥進(jìn)行消毒處理； 2) 接種培養(yǎng)：接種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，培養(yǎng)獲得愈傷組織； 3) 繼代增殖培養(yǎng)：將未污染的愈傷組織轉(zhuǎn)入第一繼代培養(yǎng)基中使芽增殖，繼代5次，轉(zhuǎn) 入第二繼代培養(yǎng)基或不添加任何激素的空白培養(yǎng)基中繼代一次，然后再轉(zhuǎn)入第一繼代培養(yǎng) 基中繼續(xù)增殖，根據(jù)需苗量重復(fù)上述步驟； 4) 生根培養(yǎng)：接種生根培養(yǎng)基，篩選獲得單體植株； 5) 煉苗移栽：先將培養(yǎng)瓶移至溫室，自然條件下煉苗3?5d，待馬藺苗健壯且有5-7片 真葉、6-8cm高時(shí)，然后解開(kāi)封口膜，煉苗6?7d，煉苗完成后取出小苗洗凈根部附著的培 養(yǎng)基，移栽到經(jīng)消毒的基質(zhì)中，溫度控制在24-26°C，前7d濕度控制在70%左右，以后逐漸 降低濕度，直至將移栽苗置于自然條件下，煉苗移栽期間適當(dāng)遮光，使光照強(qiáng)度為自然光的 40%。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的馬藺游離花粉培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的消毒處理是將 花藥用無(wú)菌紗布包裹浸入70-75%濃度的酒精中消毒10-16S，快速取出立即浸入漂白粉中 浸泡lOmin，最后用無(wú)菌水沖洗4?6次。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的馬藺游離花粉培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的接種培養(yǎng)基 為：MS+6-BA 1. Omg/L+NAA 0? 2mg/L ;培養(yǎng)基的 PH 為 6. 0,培養(yǎng)溫度為 25± 1°C，12h/d 的光 周期，光照強(qiáng)度600Lx。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的馬藺游離花粉培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的第一繼代 培養(yǎng)基為 1/2MS+6-BA1. 0mg/L+2,4-D0. lmg/L+NAA 0? 2mg/L+ 瓊脂 5g/L+ 蔗糖 20g/L ;所述 第二繼代培養(yǎng)基為1/2MS+6-BA 0. 3mg/L+NAA 0. lmg/L+白砂糖24g/L+瓊脂8g/L ;所述空 白培養(yǎng)基為1/2MS+蔗糖30g/L，繼代培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)基的PH為6. 0,培養(yǎng)溫度為25 ± 1 °C， 24h/d的光周期，光照強(qiáng)度lOOOLx。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的馬藺游離花粉培養(yǎng)方法，其特征在于，所述的生根培養(yǎng)基 為：1/2MS+IAA 0? lmg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L+活性炭質(zhì)量比0? 1%?0? 3% ;培養(yǎng)條件 為：培養(yǎng)基的PH為6. 0,培養(yǎng)溫度為25±l°C，24h/d的光周期，光照強(qiáng)度1200Lx。
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104429963SQ201410746088
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月8日
【發(fā)明者】邱林 申請(qǐng)人:邱林