一株降解四種除草劑的紅球菌及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株降解除草劑的細(xì)菌及其用途。該降解除草劑的細(xì)菌是紅球菌(Rhodococcus sp.)198-R-56，在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏編號為CGMCC No.9868。本發(fā)明提供的紅球菌(Rhodococcus sp.)198-R-56CGMCCNo.9868在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中7天對100mg/L普施特的降解率達(dá)到84.63％，對50mg/L乙草胺降解率達(dá)到69.15％，對100mg/L氯嘧磺隆降解率達(dá)到52.20％，對100mg/L雜草焚的降解率達(dá)到20.16％，表明該菌株能降解除草劑普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚；同時該菌株具有產(chǎn)生植物激素吲哚乙酸的能力，產(chǎn)量為62.35±3.76μg/ml，說明該菌株具有促進(jìn)植物生長的能力。CGMCC No.986820141028
【專利說明】一株降解四種除草劑的紅球菌及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域中一株可以降解除草劑的細(xì)菌及其用途，特別涉及一株降 解四種除草劑的紅球菌及其用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 普施特，又名咪草煙，英文名稱Pursuit (imazethapyr-ammonium)，化學(xué)名稱 (RS)-5-乙基-2-(4-異丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基）煙酸。普施特是咪唑啉 酮類除草劑，是側(cè)鏈氨基酸合成抑制劑，芽前或芽后均可施用，對大豆和其他豆科植物農(nóng)田 的禾本科雜草和某些闊葉雜草如莧菜、寥、藜、龍葵、蒼耳、稗草、狗尾草、馬唐、黍等有優(yōu)異 的防治效果。
[0003] 乙草胺，英文通用名稱acetochlor，化學(xué)名稱是2-乙基-6甲基-N-乙氧基甲 基-α-氯代乙酰替苯胺。乙草胺是內(nèi)吸性酰胺類除草劑，是選擇性的芽前除草劑。能被雜 草的幼芽和幼根吸收，抑制雜草蛋白質(zhì)合成，而使雜草死亡。主要用于大豆、花生、玉米、棉 花等作物防除一年生禾本科雜草和部分闊葉雜草，對大豆菟絲子有良好防效，對多年生雜 草無效。
[0004] 氯喃磺隆，英文通用名稱chlorimuron-ethyl，化學(xué)名稱2-(4-氯-6-甲氧基喃 啶-2-基氨基甲酰氨基磺酰基）苯甲酸甲酯。氯嘧磺隆是超高效的磺酰脲類除草劑，作用靶 標(biāo)為植物體內(nèi)的ALS (乙酰乳酸合成酶），抑制支鏈氨基酸纈氨酸、異亮氨酸的生物合成，導(dǎo) 致底物α -丁酮積累，阻礙細(xì)胞分裂間期DNA合成，使有絲分裂停止，細(xì)胞不能正常生長。氯 嘧磺隆可被植物的根、莖、葉吸收，在植物體內(nèi)進(jìn)行上下傳導(dǎo)，是選擇性芽前、芽后除草劑， 主要用于大豆等農(nóng)田，防除闊葉雜草和某些莎草科及禾本科雜草。
[0005] 雜草焚，又名三氟羧草醚，英文名稱acifluorfen，化學(xué)名稱5-(2-氯-α，α， α -三氟對甲苯氧基）2-硝基苯甲酸。雜草焚是二苯醚類除草劑，屬接觸性除草劑，是原卟 啉氧化酶抑制劑。通常采用25%水劑進(jìn)行大豆苗前表土處理及苗后經(jīng)葉噴霧，可有效防 除大豆田闊葉雜草如蒼耳、苘麻、龍葵、莧、藜、寥、牽牛、豚草、曼陀羅、馬齒莧、鐵莧菜、鬼針 草、鼬瓣花、鴨跖草等，苗后早期處理也可防除包括狗尾草在內(nèi)的一年生禾本科雜草。噴藥 后，大豆會不同程度受害，表現(xiàn)為葉片黃化、皺縮、褐變等，但6?7天后恢復(fù)正常。
[0006] 普施特和氯嘧磺隆為長殘效除草劑，優(yōu)點(diǎn)是除草效果好、殺草譜寬、用藥量少、使 用方便、用藥成本低，但它們在土壤中殘留時間長，一般可達(dá)2 - 3年，對后茬作物如甜菜、 馬鈴薯、瓜類、高梁、油菜、玉米等都會產(chǎn)生不同程度的藥害，使植物生長緩慢、生長點(diǎn)壞死、 分枝及莖基部老化、節(jié)間縮短、植株矮化、成熟期推遲，甚至導(dǎo)致作物死亡。主要表現(xiàn)為：一 是在黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古一些地方把大豆田改為水田，種植水稻受害嚴(yán)重，甚至絕產(chǎn)；二是 除草劑施后3 - 4年仍有藥害，導(dǎo)致甜菜種植業(yè)下滑；三是經(jīng)濟(jì)作物發(fā)展受影響，白瓜籽、向 日葵、馬鈴薯、亞麻和蔬菜等受到傷害，嚴(yán)重者基地受毀；四是在使用過氯嘧磺隆的大豆田 中再種植向日葵，將會導(dǎo)致后茬向日葵大面積受害絕產(chǎn)。
[0007] 乙草胺和雜草焚半衰期較短，一直被認(rèn)為是一種低毒的環(huán)境友好型農(nóng)藥，但近年 來頻繁、過量或使用不當(dāng)，對農(nóng)田土壤和地下水等造成了不同程度的污染，對后茬作物的危 害也越來越嚴(yán)重。研宄表明，在環(huán)境中大量施用乙草胺和雜草焚造成一定的殘留毒性，其在 地下水、地表水中可以殘留數(shù)年，進(jìn)入到環(huán)境中通過食物鏈在生物體內(nèi)不斷富集，對魚類有 較強(qiáng)的毒性，對環(huán)境污染很大。尤其乙草胺可以引起生物體的內(nèi)分泌紊亂，造成不育、不正 常的性別差異甚至致癌，已被美國環(huán)保局定為致癌物。
[0008] 卩引噪-3-乙酸（indole-3-acetic acid)是最早發(fā)現(xiàn)的植物激素，亦稱卩引噪乙酸， 縮寫IAA。吲哚乙酸在植物體內(nèi)生物合成的前體是色氨酸，基本作用在于調(diào)節(jié)植物的生長。 在光和空氣中易分解，不耐IC存。
[0009] 自然界除草劑殘留的降解主要依靠土壤中微生物來完成，但自然降解十分緩慢。 因此，有針對性地篩選高效微生物菌株，研制微生物修復(fù)劑，通過人工接種加速土壤除草劑 殘留的降解消除農(nóng)田除草劑殘留藥害是一項(xiàng)十分必要的工作和切實(shí)可行的途徑。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何降解除草劑和生產(chǎn)吲哚乙酸，所述除草劑可為 普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚中的至少一種。
[0011] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一株可以降解除草劑和產(chǎn)生吲哚乙酸的細(xì) 菌，所述除草劑可為普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚中的至少一種。
[0012] 本發(fā)明提供的細(xì)菌是紅球菌（Rhodococcus sp.) 198-R-56,該菌株已于2014年10 月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：北 京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號），保藏編號為CGMCC No. 9868。
[0013] 本發(fā)明的另一個目的是提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為所述的紅球菌 (Rhodococcus sp.)198-R-56 CGMCC No. 9868〇
[0014] 上述菌劑可為下述1)或2)或3)所述菌劑：
[0015] 1)用于降解除草劑普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚中至少一種的菌劑；
[0016] 2)用于修復(fù)土壤除草劑普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚中至少一種污染的菌 劑；
[0017] 3)用于產(chǎn)生吲哚乙酸的菌劑。
[0018] 所述菌劑還可以包括載體。所述載體可為固體載體或液體載體。所述固體載體可 為礦物材料、植物材料或高分子化合物；所述礦物材料可為粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白 碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一種；所述植物材料可為玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一 種；所述高分子化合物可為聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液體載體可為有機(jī)溶劑、植物油、 礦物油或水；所述有機(jī)溶劑可為癸烷和/或十二烷。所述菌劑中，所述活性成分可以以被培 養(yǎng)的活細(xì)胞、活細(xì)胞的發(fā)酵液、細(xì)胞培養(yǎng)物的濾液或細(xì)胞與濾液的混合物的形式存在。所述 組合物的劑型可為多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可濕性粉劑或水分散粒 劑。
[0019] 根據(jù)需要，所述菌劑中還可添加表面活性劑（如吐溫20、吐溫80等）、粘合劑、穩(wěn) 定劑（如抗氧化劑）、pH調(diào)節(jié)劑等。
[0020] 所述的紅球菌（Rhodococcus sp.) 198-R-56 CGMCC No. 9868 或以紅球菌 (Rhodococcus sp.)198-R-56 CGMCC No. 9868為活性成分的菌劑在降解除草劑普施特、乙 草胺、氯嘧磺隆和雜草焚中至少一種的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0021] 所述的紅球菌（Rhodococcus sp.) 198-R-56 CGMCC No. 9868 或以紅球菌 (Rhodococcus sp.)198-R-56 CGMCC No. 9868為活性成分的菌劑在修復(fù)土壤除草劑普施 特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚中至少一種污染中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0022] 所述的紅球菌（Rhodococcus sp.) 198-R-56 CGMCC No. 9868 或以紅球菌 (Rhodococcus sp.)198-R-56 CGMCC No. 9868為活性成分的菌劑在促進(jìn)植物生長中的應(yīng)用 也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0023] 所述的紅球菌（Rhodococcus sp.) 198-R-56 CGMCC No. 9868 或以紅球菌 (Rhodococcus sp.)198-R-56 CGMCC No. 9868為活性成分的菌劑在生產(chǎn)吲哚乙酸中的應(yīng)用 也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024] 本發(fā)明的再一個目的是提供一種培養(yǎng)紅球菌（Rhodococcus sp.) 198-R-56 CGMCC No. 9868的方法。
[0025] 本發(fā)明所提供的培養(yǎng)紅球菌（Rhodococcus sp.) 198-R-56 CGMCC No. 9868的方 法，包括將紅球菌（Rhodococcus sp.)198-R-56 CGMCC No. 9868在用于培養(yǎng)紅球菌的培養(yǎng) 基中培養(yǎng)的步驟。
[0026] 本發(fā)明的又一個目的是提供一種以紅球菌（Rhodococcus sp.)198-R-56 CGMCC No. 9868為活性成分的菌劑的制備方法。
[0027] 本發(fā)明所提供上述菌劑的制備方法，包括如下步驟：將所述的紅球菌 (Rhodococcus sp.)198-R-56 CGMCC No. 9868 作為活性成分，得到所述菌劑。
[0028] 本發(fā)明是從長期受到除草劑普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚污染的農(nóng)田采集 土樣，并從中分離篩選得到的除草劑降解菌紅球菌（Rhodococcus sp.)198-R-56 CGMCC No. 9868。實(shí)驗(yàn)證明，紅球菌（Rhodococcus sp.) 198-R-56 CGMCC No. 9868 在無機(jī)鹽培養(yǎng)基 中7天對10〇11^/1普施特的降解率達(dá)到84.63%;對5〇11^/1乙草胺降解率達(dá)到69.15% ;對 100mg/L氯嘧磺隆降解率達(dá)到52. 20% ;對100mg/L雜草焚的降解率達(dá)到20. 16%。這表明 該菌株能降解除草劑普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚，在修復(fù)土壤除草劑普施特、乙草 胺、氯嘧磺隆和雜草焚污染方面具有廣闊的應(yīng)用前景。紅球菌（Rhodococcus sp.) 198-R-56 CGMCC No. 9868具有產(chǎn)生植物激素吲哚乙酸能力，其產(chǎn)量為62. 35±3. 76 μ g/ml，表明該菌 株具有促進(jìn)植物生長的能力。
[0029] 保藏說明
[0030] 菌種名稱：紅球菌
[0031] 拉丁名：Rhodococcus sp.
[0032] 菌株編號：198_R_56
[0033] 保藏機(jī)構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心
[0034] 保藏機(jī)構(gòu)簡稱：CGMCC
[0035] 地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號
[0036] 保藏日期：2014年10月28日
[0037] 保藏中心登記入冊編號：CGMCC No. 9868

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 圖1為普施特標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0039] 圖2為乙草胺標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0040] 圖3為氯嘧磺隆標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0041] 圖4為雜草焚標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0042] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0043] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0044] 下述實(shí)施例中所用的培養(yǎng)基如下：
[0045] 無氮液體培養(yǎng)基：溶質(zhì)及其濃度為蔗糖10g/L，NaCl 0· 12g/L，K2HPO4 · 3H20 0· 5g/ L，CaC03lg/L，MgSO4 · 7H20 0· 2g/L ;溶劑為蒸餾水；pH 7· 2。
[0046] 無氮固體培養(yǎng)基：向無氮液體培養(yǎng)基中加瓊脂至其含量為15-20g/L得到的培養(yǎng) 基。
[0047] 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：溶質(zhì)及其濃度為牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaC15g/ L ;溶劑為蒸餾水；pH7. 2。
[0048] 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：溶質(zhì)及其濃度為牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaC15g/ L、瓊脂15-20g/L ;溶劑為蒸餾水；pH7. 2。
[0049] 無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基：溶質(zhì)及其濃度為NH4Cl I. Og/L，KH2PO4O. 5g/L，K2HPO4L 5g/L， MgSO4O. 2g/L，NaCl 0· 5g/L ;溶劑為蒸餾水；ρΗ7· 2。
[0050] 無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基：向無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中加瓊脂至其含量為2%得到的培養(yǎng) 基。
[0051] DF 培養(yǎng)基：溶質(zhì)及其濃度為 ΚΗ2Ρ044· Og/L，Na2HP046. Og/L，MgSO4 · 7Η20 0· 2g/L， 葡萄糖2. 0g/L，葡萄糖酸鈉 2. 0g/L，檸檬酸2. 0g/L，（NH4)2S042. 0g/L，組分一溶液和組分二 溶液各〇· ImL(組分一溶液的組成：溶質(zhì)及其濃度為H3B03100mg/L，MnSO4 · H2OllL 9mg/L， ZnSO4 · 7H201246mg/L，CuSO4 · 5H20 782. 2mg/L，Mo03100mg/L，溶劑為蒸餾水；組分二溶液的 組成：溶質(zhì)及其濃度為FeSO4 · 7H2010g/L，溶劑為蒸餾水）；溶劑為蒸餾水；pH7. 2。
[0052] 實(shí)施例 1、紅球菌（Rhodococcus sp.) 198-R-56 CGMCC No. 9868 的分離與鑒定
[0053] -、除草劑降解菌198-R-56的分離
[0054] 1、在IOOrnl無菌水中加入IOg土壤樣品（采自中國黑龍江黑河受除草劑污染的農(nóng) 田），振蕩培養(yǎng)30min制成混池液。吸取Iml上述混池液加入盛有9ml無菌水中的試管中充 分混勻（此時稀釋度記為KT 1)，然后從此試管中吸取Iml加入到另一盛有9ml無菌水的試 管中混合均勻，以此類推制成10_2、10_ 3、10_4、10_5不同稀釋度的菌懸液。將各稀釋度取0.11111 均勻涂布在無氮固體培養(yǎng)基平板上，28°C恒溫靜置培養(yǎng)2- 3天。待菌落形成后，在無氮固 體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行菌種純化。
[0055] 2、對除草劑普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚降解能力的初步篩選采用平板透 明圈法。將普施特標(biāo)準(zhǔn)品（Fluka公司產(chǎn)品）加入無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基使其含量為IOOOmg/ L，得到普施特平板；將乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品（Fluka公司產(chǎn)品）加入無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基使其含量為 1000mg/L，得到乙草胺平板；將氯嘧磺隆標(biāo)準(zhǔn)品（Fluka公司產(chǎn)品）加入無機(jī)鹽固體培養(yǎng)基 使其含量為l〇〇〇mg/L，得到氯嘧磺隆平板；將雜草焚標(biāo)準(zhǔn)品（Fluka公司產(chǎn)品）加入無機(jī)鹽 固體培養(yǎng)基使其含量為l〇〇〇mg/L，得到雜草焚平板。將普施特平板、乙草胺平板、氯嘧磺隆 平板和雜草焚平板進(jìn)行分區(qū)，吸取步驟1純化得到的每株菌的菌懸液10 μ L(各種菌株菌懸 液的菌體含量相同）分別點(diǎn)種到四種平板上（每株菌在一個平板上重復(fù)3次），28°C培養(yǎng)、 觀察。篩選到一株在普施特平板、乙草胺平板、氯嘧磺隆平板和雜草焚平板上均能形成較大 透明圈的菌株，將該菌株其命名為除草劑降解菌198-R-56。說明除草劑降解菌198-R-56能 降解氯嘧磺隆、普施特、乙草胺和雜草焚。
[0056] 表1.除草劑降解菌198-R-56對四種除草劑降解能力初篩結(jié)果
[0057]

【權(quán)利要求】
1. 紅球菌（Rhodococcus sp. )198_R_56,其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心的保藏編號為CGMCC No. 9868。
2. -種菌劑，其特征在于：所述菌劑的活性成分為權(quán)利要求1所述的紅球菌 (Rhodococcus sp.)198-R-56CGMCC No. 9868〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的菌劑，其特征在于：所述菌劑為下述1)或2)或3)所述菌劑： 1) 用于降解除草劑的菌劑；所述除草劑為普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚中至少 一種； 2) 用于修復(fù)土壤除草劑污染的菌劑；所述除草劑為普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草 焚中至少一種； 3) 用于產(chǎn)生吲哚乙酸的菌劑。
4. 權(quán)利要求1所述的紅球菌（Rhodococcus sp.)198_R_56CGMCC No. 9868、或權(quán)利要求 2或3所述的菌劑在降解除草劑中的應(yīng)用；所述除草劑為普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草 焚中至少一種。
5. 權(quán)利要求1所述的紅球菌（Rhodococcus sp.)198_R_56CGMCC No. 9868、或權(quán)利要求 2或3所述的菌劑在修復(fù)土壤除草劑污染中的應(yīng)用；所述除草劑為普施特、乙草胺、氯嘧磺 隆和雜草焚中至少一種。
6. 權(quán)利要求1所述的紅球菌（Rhodococcus sp.)198_R_56CGMCC No. 9868、或權(quán)利要求 2或3所述的菌劑在生產(chǎn)吲哚乙酸中的應(yīng)用。
7. 權(quán)利要求1所述的紅球菌（Rhodococcus sp.) 198-R-56CGMCC No. 9868、或權(quán)利要求 2或3所述的菌劑在促進(jìn)植物生長中的應(yīng)用。
8. 培養(yǎng)權(quán)利要求1所述紅球菌（Rhodococcus sp.) 198-R-56CGMCC No. 9868的方法，包 括將所述紅球菌（Rhodococcus sp.)198-R-56CGMCC No. 9868在用于培養(yǎng)紅球菌的培養(yǎng)基 中培養(yǎng)的步驟。
9. 權(quán)利要求2或3所述菌劑的制備方法，包括如下步驟：將權(quán)利要求1所述的紅球菌 (Rhodococcus sp.)198-R-56CGMCC No. 9868 作為活性成分，得到所述菌劑。
【文檔編號】A01P21/00GK104480043SQ201410772625
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月12日
【發(fā)明者】高淼, 孫建光, 孫穎飛, 楊慧 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所