控制玉米葉夾角大小的ZmCLA1基因及其在選育耐密株型玉米的方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了控制玉米葉夾角大小的ZmCLA1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本發(fā)明采用正向遺傳學(xué)方法（通過(guò)構(gòu)建作圖群體對(duì)葉夾角進(jìn)行QTL初步定為、精細(xì)定位）準(zhǔn)確無(wú)誤的分離候選基因，ZmCLA1基因的功能在植物中沒(méi)有任何報(bào)道，本發(fā)明提供了調(diào)控玉米葉夾角大小的基因ZmCLA1及其編碼蛋白。該基因?qū)τ诮馕鲇衩兹~夾角形成的分子機(jī)理等理論研究具有重要的價(jià)值，將含有SEQ ID NO：1所示序列的基因進(jìn)行改造，導(dǎo)入玉米植株中，可以創(chuàng)建株型緊湊、葉夾角小的玉米育種材料，對(duì)玉米育種具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。
【專利說(shuō)明】控制玉米葉夾角大小的ZmCLAI基因及其在選育耐密株型玉米的方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及玉米選育【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及控制玉米葉夾角大小的ZmCLAl基因及其在選育耐密株型玉米的方法與應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]玉米是我國(guó)第二大糧食作物，常年種植面積2545萬(wàn)公頃左右，播種面積和總廣占糧食作物的25%和28%左右。隨著耕地面積的減少、人口的不斷增加，玉米消費(fèi)量則呈剛性增加。因此，提高單產(chǎn)、增加總產(chǎn)是我國(guó)玉米育種長(zhǎng)期追求的重要目標(biāo)。國(guó)內(nèi)外研究表明，提高單產(chǎn)是發(fā)展玉米生產(chǎn)的主要措施，而單產(chǎn)的提高主要依賴于新品種的選育與更新。以提高產(chǎn)量為目的的玉米品種改良是通過(guò)提高雜種優(yōu)勢(shì)和株型改良來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0003]20世紀(jì)初至今，以利用雜種優(yōu)勢(shì)選育新品種為目標(biāo)的玉米遺傳改良一直是世界各國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究的重要方向，但隨著育成和推廣品種產(chǎn)量水平的提高，單純依靠雜種優(yōu)勢(shì)利用技術(shù)已很難實(shí)現(xiàn)玉米持續(xù)高產(chǎn)的目標(biāo)。國(guó)內(nèi)外實(shí)踐證明，隨著玉米產(chǎn)量水平的不斷提升和玉米生產(chǎn)機(jī)械化的推廣普及，提高玉米種植密度已成為實(shí)現(xiàn)玉米持續(xù)高產(chǎn)最重要的技術(shù)措施。在過(guò)去幾十年里，美國(guó)生產(chǎn)上應(yīng)用的玉米雜交種單株產(chǎn)量并沒(méi)有明顯提高，而單產(chǎn)和總產(chǎn)提高的主要原因是種植密度的提高和抗逆性的增強(qiáng)。2009年美國(guó)平均畝產(chǎn)接近700公斤，種植密度在5500株/畝左右。與美國(guó)相比，目前我國(guó)的玉米種植密度和產(chǎn)量仍有進(jìn)一步提高的空間。例如，我國(guó)黃淮海玉米產(chǎn)區(qū)平均畝產(chǎn)不到400公斤，種植密度為3500 — 4500株/畝。因此，提高單產(chǎn)、增加總產(chǎn)的最大潛力在于提高種植密度。在玉米群體高密度逆境條件下，玉米植株如何才能充分接受和利用光？玉米植株如何對(duì)密植環(huán)境下產(chǎn)生相應(yīng)的調(diào)控反應(yīng)來(lái)提高光合效率？玉米遮蔭綜合癥(Shade Avoidance Responses,SAR)是高密度逆境常常發(fā)生的一種現(xiàn)象，當(dāng)玉米處于這種逆境條件下，將會(huì)改變?cè)瓉?lái)的生長(zhǎng)模式和光合產(chǎn)物分配方式，最終導(dǎo)致產(chǎn)量降低。玉米耐密性的實(shí)質(zhì)是在高密度環(huán)境下玉米群體光合效率高，遮蔭綜合癥低，群體即單位面積產(chǎn)量高。因此，玉米種植群體密度的提高需要具有耐密株型和耐密特性的優(yōu)良高產(chǎn)品種的選育與應(yīng)用。緊湊合理株型是耐密高產(chǎn)的一個(gè)重要外在形態(tài)指標(biāo)，如葉片夾角、長(zhǎng)度、寬度、空間分布及姿態(tài)等都影響了玉米群體的種植密度。玉米光合產(chǎn)物源、流、庫(kù)合理高效運(yùn)轉(zhuǎn)等是耐密高產(chǎn)的一個(gè)重要內(nèi)在生理機(jī)制，控制耐密高產(chǎn)性狀基因的克隆和分子機(jī)理的解析，則是開展耐密高產(chǎn)玉米品種選育的基礎(chǔ)。因此，通過(guò)對(duì)株型性狀基因的圖位克隆和分子機(jī)理解析，探索耐密高產(chǎn)分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)，為選育耐密株型和耐密特性的優(yōu)良高產(chǎn)玉米品種提供理論和技術(shù)支撐。
[0004]葉夾角是玉米株型最重要農(nóng)藝性狀之一，盡管有關(guān)玉米葉夾角的QTL被定位，但到目前為止還沒(méi)有通過(guò)圖位克隆技術(shù)獲得相應(yīng)的候選基因。而一些與玉米葉夾角相關(guān)的基因通過(guò)比較基因組學(xué)和突變體技術(shù)被研究。Ku等(2011)利用比較基因組學(xué)方法，克隆了位于第二染色體上的qLA2的候選基因。研究表明，緊湊型親本自交系豫82和松散型親本自交系沈137其5’ -UTR端” CTCC”變?yōu)椤?CCCC”，影響了為以67的表達(dá)水平，從而進(jìn)一步影響葉夾角的大小。由此表明為以67基因表達(dá)水平的高低是通過(guò)5’ -UTR位點(diǎn)序列‘CTCC’ -1CCCC ’的變化調(diào)控的。Moreno等(1997)對(duì)7W突變體的研究發(fā)現(xiàn)，該突變體為基因表達(dá)缺失突變體，該突變體表現(xiàn)為不能形成葉舌和葉耳，葉片和葉鞘的連接處不能夠發(fā)育。利用活化劑(Ac)轉(zhuǎn)座因子作為一個(gè)分子標(biāo)簽，將的等位基因lgl-ml從中分離和克隆出來(lái)，研究證實(shí)Z似基因以一種細(xì)胞自主方式產(chǎn)生功能。Juarez等(2004)發(fā)現(xiàn)r7i//和7W2突變體表現(xiàn)出近軸/向上的葉部形態(tài)。通過(guò)克隆其相對(duì)應(yīng)的基因發(fā)現(xiàn)，編碼一個(gè)HD-ZIPIII蛋白，通過(guò)遠(yuǎn)軸端的miR166_directed的轉(zhuǎn)錄裂解限定了空間近軸端表達(dá)。半顯性miR166互補(bǔ)位點(diǎn)一個(gè)單核苷酸替換導(dǎo)致遠(yuǎn)軸端的突變體轉(zhuǎn)錄本的持續(xù)表達(dá)，這引起葉子偏向近軸端。遺傳分析表明Ibim皮此相互抑制，說(shuō)明這2個(gè)基因在同一路徑中起作用。對(duì)TaMlF基因的研究發(fā)現(xiàn)其直接引起側(cè)生器官向外生長(zhǎng)。與已鑒定的QTL相比，已鑒定出的與葉夾角有關(guān)的基因數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，說(shuō)明大量的與葉夾角相關(guān)的候選基因有待進(jìn)一步鑒定。本研究涉及的基因ZmCLAl是通過(guò)圖位克隆技術(shù)發(fā)現(xiàn)的與葉夾角大小有關(guān)的一個(gè)含有GHMP-kinases-N和Pmev-kin_ERG8的結(jié)構(gòu)域新基因，其分子生物學(xué)功能目前在植物中尚未報(bào)道。本發(fā)明研究了該基因調(diào)控玉米葉夾角的分子生物學(xué)功能，并為培育耐密株型和耐密特性的優(yōu)良高產(chǎn)玉米品種提供了一個(gè)潛在的新基因資源。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種調(diào)控玉米葉夾角大小的基因ZmCLAl，該基因具有如SEQ ID NO:1所示的DNA片段。本發(fā)明也包括如SEQ ID NO:2所示的蛋白質(zhì)序列。該基因mRNA積累量降低，導(dǎo)致玉米葉夾角減小，因此該基因的克隆有助于理解玉米葉夾角形成的分子機(jī)制。
[0006]本發(fā)明利用RNAi (RNA干擾)技術(shù)，抑制玉米內(nèi)源ZmCLAl基因的表達(dá)，造成橫截面細(xì)胞的長(zhǎng)度變短，導(dǎo)致葉夾角減小(見實(shí)施例6)。具體的說(shuō)就是將ZmCLAl基因與其它調(diào)控元件，如組成型啟動(dòng)子(如CaMV35S啟動(dòng)子)或器官特異性啟動(dòng)子融合構(gòu)建基因抑制表達(dá)載體，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)(如反義RNA或RNAi)創(chuàng)造葉夾角小、株型緊湊的玉米自交系，用于培育玉米耐密新品種。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案是:控制玉米葉夾角大小的ZmCLAl基因，其核苷酸序列如SEQID NO:1 所示。
[0008]控制玉米葉夾角大小的ZmCLAl基因，其蛋白質(zhì)序列如SEQ ID NO:2所不。
[0009]控制玉米葉夾角大小的ZmCLAl基因在選育耐密株型玉米的方法，它的步驟如下: (O以緊湊型自交系豫82為供體親本，以松散型玉米自交系沈137為受體親本，采用回交轉(zhuǎn)育結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇構(gòu)建位于第一染色體的主效qLAl的近等基因系沈137-NIL68 ；
(2)采用圖位克隆技術(shù)分離ZmCLAl基因，利用RNAi技術(shù)抑制玉米內(nèi)源ZmCLAl基因的表達(dá)選育玉米葉夾角小的自交系。
[0010]控制玉米葉夾角大小的ZmCLAl基因應(yīng)用于選育耐密株型玉米，在ZmCLAl基因的編碼區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)RNAi引物
RNA1-F:5’ -actagtggatccgttgttgcagttcttcttc-3>
RNA1-R:5’ -agatctggtaccggatagcactaccgactcat-3’
從ρΒΙ1391-Ζ?αΧ沖擴(kuò)增出來(lái)，以該序列及其反向序列形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)插入到PJL1460載體中，從而形成PZmCLAl-RNAi載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用于轉(zhuǎn)化玉米自交系沈137，得到葉夾角表現(xiàn)不同程度的減小的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株。
[0011]本發(fā)明具體方法如下:
1.本發(fā)明以緊湊型自交系豫82為供體親本，以松散型玉米自交系沈137為受體親本，采用回交轉(zhuǎn)育結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇構(gòu)建位于第一染色體的主效qLAl的近等基因系，我們將其命名為沈137-NIL68，近等基因系的構(gòu)建方法見實(shí)施例1中詳細(xì)描述；
2.采用圖位克隆技術(shù)分離ZmCLAl基因(見實(shí)施例2)。利用qRT-PCR技術(shù)分析ZmCLAl的表達(dá)規(guī)律，結(jié)果表明該基因不同時(shí)期不同部位在沈137中的表達(dá)量顯著高于沈137-NIL68中的表達(dá)量，且在莖尖、葉片、葉鞘、葉枕中高量表達(dá)，說(shuō)明ZmCLAl正向調(diào)控玉米葉夾角(見實(shí)施例3)；
3.本發(fā)明分析了沈137和沈137-NIL68不同時(shí)期的玉米葉片橫切面的細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果表明沈137-NIL68的葉夾角變小是由于葉片橫切面的細(xì)胞長(zhǎng)度減小所致(見實(shí)施例4)；
4.過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)(見實(shí)施例5)證明本發(fā)明獲得的候選基因ZmCLAl的過(guò)量表達(dá)引起玉米葉夾角增大的原因；
5.利用RNAi技術(shù)抑制玉米內(nèi)源ZmCLAl基因的表達(dá)選育玉米葉夾角小的自交系(見實(shí)施例6)。
[0012]本發(fā)明的有益效果是:
1.本發(fā)明采用正向遺傳學(xué)方法(通過(guò)構(gòu)建作圖群體對(duì)葉夾角進(jìn)行QTL初步定為、精細(xì)定位)準(zhǔn)確無(wú)誤的分離候選基因；
2.ZmCLAl基因的功能在植物中沒(méi)有任何報(bào)道，本發(fā)明提供了調(diào)控玉米葉夾角大小的基因ZmCLAl及其編碼蛋白。該基因?qū)τ诮馕鲇衩兹~夾角形成的分子機(jī)理等理論研究具有重要的價(jià)值；
3.將含有SEQID NO:1所示序列的基因進(jìn)行改造，導(dǎo)入玉米植株中，可以創(chuàng)建株型緊湊、葉夾角小的玉米育種材料，對(duì)玉米育種具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013]序列表SEQ ID NO:1是本發(fā)明分離克隆的ZmCLAl基因的核苷酸序列，序列長(zhǎng)度為2097bp，其中339-1878為編碼區(qū)。
[0014]序列表SEQ ID NO: 2是ZmCLAl基因編碼的氨基酸序列。
[0015]圖1.豫82、沈137-NIL68和沈137的田間表型，圖中A:穩(wěn)定時(shí)期(玉米開花后10天)豫82 (左)、沈137-NIL68 (中)與沈137 (右)的植株形態(tài)；B:穗上部第二片葉豫82(左)、沈137-NIL68 (中)與沈137 (右)的葉夾角；C:授粉后10天葉豫82 (左)、沈137-NIL68(中)與沈137 (右)的穗上部葉夾角平均值；
圖2.圖位克隆ZmCLAl基因的分子鑒定結(jié)果，圖中a:利用BC3F2群體3684個(gè)單株，篩選到16個(gè)交換單株，對(duì)16個(gè)交換單株進(jìn)行精細(xì)定位將qLAl QTL縮小的標(biāo)記LAI25和bnlgl484區(qū)間內(nèi)；b:利用BC4F2群體共8752個(gè)單株，共篩選到17株交換單株，對(duì)17個(gè)交換單株進(jìn)行精細(xì)定位將qLAl QTL縮小的標(biāo)記LAII40和LAII53區(qū)間內(nèi)；c:通過(guò)精細(xì)定位將qLAl的區(qū)間縮小到30.26Kb的區(qū)域內(nèi)，該區(qū)域包含3個(gè)候選基因。黑色線條和紅色方框分別代表基因的內(nèi)含子和外顯子；d:3個(gè)候選基因GRMZM2G019260(ZmCLAl，左)、GRMZM2G019567(中)和GRMZM5G808271 (右)在豫82、沈137-NIL68與沈137中的表達(dá)量(mRNA積累量)；
圖3為ZmCLAl基因的表達(dá)模式，qRT-PCR檢測(cè)ZmCLAl基因從3_19葉期在沈137和沈137-NIL68在葉片中的表達(dá)量(mRNA積累量)，18S基因作為內(nèi)對(duì)照；
圖4為ZmCLAl基因的表達(dá)模式，qRT-PCR檢測(cè)ZmCLAl基因從3_19葉期在沈137和沈137-NIL68在葉鞘中的表達(dá)量(mRNA積累量)，18S基因作為內(nèi)對(duì)照；
圖5為ZmCLAl基因的表達(dá)模式，qRT-PCR檢測(cè)ZmCLAl基因從3_19葉期在沈137和沈137-NIL68在葉枕中的表達(dá)量(mRNA積累量)，18S基因作為內(nèi)對(duì)照；
圖6為ZmCLAl基因的表達(dá)模式，qRT-PCR檢測(cè)ZmCLAl基因從3_19葉期在沈137和沈137-NIL68在莖尖中的表達(dá)量(mRNA積累量)，18S基因作為內(nèi)對(duì)照；
圖7為為CU癌因的形態(tài)學(xué)觀察。圖中，(a)沈137葉枕，(b)D132葉枕，(c)在圖(a)中箭頭所指向部位的橫切面組織，Cd)在圖(b)中箭頭所指向部位的橫切面組織；
圖8為mCLAl過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因使自交系豫82葉夾角增大的植株表型，圖中A:穩(wěn)定時(shí)期過(guò)表達(dá)ZmCLAl陽(yáng)性植株(左)和對(duì)照植株(右)的形態(tài)；B:穩(wěn)定時(shí)期過(guò)表達(dá)ZmCLAl陽(yáng)性植株(左)和對(duì)照植株(右)穗上部葉夾角平均值；
圖9為利用RNAi技術(shù)抑制自交系沈137中內(nèi)源ZmCLAl的表達(dá)可以使葉夾角減小的結(jié)果，圖中A:穩(wěn)定時(shí)期RNA1-ZmCLAl陽(yáng)性植株(左)和對(duì)照植株(右)的形態(tài)；B:穩(wěn)定時(shí)期RNA1-ZmCLAl陽(yáng)性植株(左)和對(duì)照植株(右)穗上部葉夾角平均值。

【具體實(shí)施方式】
[0016]本發(fā)明是利用河南農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的緊湊型玉米自交系豫82 (圖1)為母本，以沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育的松散型玉米自交系沈137 (圖)為父本雜交獲得F1，F(xiàn)1自交獲得F2作圖群體及其衍生的F2:3家系為定位群體，通過(guò)3個(gè)地點(diǎn)的葉夾角表型鑒定，對(duì)葉夾角進(jìn)行了QTL定位，共定位到3個(gè)與葉夾角有關(guān)的QTL，其中位于第一染色體上的主效qLAl的效應(yīng)值最大(Ku et al.2010)。為此，以自交系豫82為供體親本，自交系沈137為受體親本構(gòu)建qLAl的近等基因系。采用回交轉(zhuǎn)育結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇方法構(gòu)建而成，構(gòu)建的近等基因系為沈137-NIL68 (圖1)，為進(jìn)一步理解本發(fā)明的內(nèi)容與目的，下面的實(shí)施例1將詳細(xì)介紹本發(fā)明的具體技術(shù)實(shí)施步驟。
[0017]1:近等基因系的構(gòu)建
以葉夾角小、株型緊湊的玉米自交系豫82為供體親本，葉夾角大、株型松散的玉米自交系沈137為受體親本通過(guò)回交轉(zhuǎn)育結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)構(gòu)建近等基因系(圖1)。2007年春在鄭州兩親本組配獲得F1;2007年冬在海南種植F 及受體親本沈137，用沈137回交F1獲得BC芯;根據(jù)BC芯的表型選擇葉夾角小的13株于2008年春在鄭州種成穗行，繼續(xù)與沈137回交獲得BC2F1;從中選擇葉夾角小的15個(gè)單株于2008年冬在海南三亞種成穗行，繼續(xù)與沈137回交獲得BC3F1;2009年春，將BC芯在鄭州種成穗行，從BC芯中根據(jù)植株葉夾角大小、結(jié)合qLAl的雙側(cè)標(biāo)記進(jìn)行基因型分析，獲得14個(gè)交換單株(并對(duì)14個(gè)交換單株采用構(gòu)建F2遺傳圖譜的222個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳背景分析。其中雙側(cè)標(biāo)記和222個(gè)SSR標(biāo)記及參照庫(kù)麗霞，玉米株型相關(guān)性狀分子遺傳機(jī)理研究，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2010)繼續(xù)與沈137回交獲得BC4F1，同時(shí)對(duì)交換單株自交獲得BC3F2 ;2009年冬在海南三亞，將BC4F1和BC3F2種植，根據(jù)BC4F1群體的表型結(jié)合基因型選擇了 22株交換單株自交獲得BC4F2;2010春在鄭州將獲得BC4F2種植，根據(jù)BC 4F2群體的表型結(jié)合基因型分析，獲得11個(gè)交換單株，并對(duì)11個(gè)交換單株采用上述222個(gè)SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳背景分析，從中選擇遺傳背景回復(fù)率高的3個(gè)交換單株自交，進(jìn)而獲得在該位點(diǎn)純合、遺傳穩(wěn)定的近等基因系。
[0018]2:采用圖位克隆技術(shù)分離ZmCLAl基因
利用BC3F2群體3684株作為精細(xì)定位群體，從中選擇葉夾角小于或等于12°的單株有株668，用私W雙側(cè)的標(biāo)記bnlgl803和bnlgl484分析其基因型，從中選擇在bnlgl803或bnlgl484處發(fā)生重組交換單株6株；同時(shí)選擇葉夾角大于20°以上的單株812株，并結(jié)合分子標(biāo)記選擇篩選出10株葉夾角大的交換單株。利用新開發(fā)并具有多態(tài)性強(qiáng)的9對(duì)引物L(fēng)AI5, LAI8、LAI9、LAI10、LAI18、LAI25、LAI29, LAI31、LAI38 (標(biāo)記開發(fā)方法參照張君，玉米葉夾角有關(guān)的ZmCLA4基因圖位克隆與功能分析，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2014)分析交換單株基因型。根據(jù)交換單株目標(biāo)區(qū)段的標(biāo)記基因型，可以把qLAl限定在標(biāo)記LAI25和 bnlgl484 之間(圖 2a)。
[0019]為了進(jìn)一步確定qLAl為I個(gè)或多個(gè)候選基因，利用BC3F2群體8752株作為精細(xì)定位群體，從中選擇葉夾角小于或等于12°單株有1682株，用qLA4-l雙側(cè)的標(biāo)記LAI25和bnlgl484分析其基因型，從中選擇在SR4-6或SSR4-39處發(fā)生重組交換單株11株；同時(shí)選擇葉夾角大于20°以上的單株1769株并結(jié)合分子標(biāo)記選擇篩選出6株葉夾角大的交換單株。再利用具有多態(tài)性強(qiáng)的9對(duì)新開發(fā)的標(biāo)記(LAII10、LAI126, LAII31、LAII33、LAI136,LAII39、LAII40、LAII42、LAII53)分析交換單株基因型。11株葉夾角小的交換單株的葉夾角變異范圍是6.70° -12.30°，平均葉夾角為10.67°，5株葉夾角大的交換單株的葉夾角變異范圍是20.12° -21.35°，平均葉夾角為20.85°。根據(jù)交換單株目標(biāo)區(qū)段的標(biāo)記基因型，可以把qLAl限定在標(biāo)記LAII40和LAII53之間(圖2b)。該區(qū)間大約30.26_kb，包含三個(gè)預(yù)測(cè)基因(圖2c)，因此將標(biāo)記LAII40和LAII53之間的30.26-kb區(qū)域作為qLAl的基因所在區(qū)域。以豫82、沈137、沈137-NIL的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板，分離3個(gè)候選基因，同時(shí)以上述3個(gè)材料的DNA為模板，分離3個(gè)候選基因的啟動(dòng)序列。通過(guò)序列差異性分析結(jié)果顯示，GRMZM2G019260啟動(dòng)子序列在豫82、沈137及沈137-NIL68中存在差異，其它2個(gè)基因所有序列都不存在差異。說(shuō)明沈137和沈137-NIL68的葉夾角大小存在差異是由于GRMZM2G019260在啟動(dòng)子序列的差異引起的。為進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)論，采用qTR-PCR技術(shù)(參照張君，玉米葉夾角有關(guān)的ZmCLA4基因圖位克隆與功能分析，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2014)以5葉期的豫82、沈137、沈137_NILs為莖尖材料，提取mRNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA ;以這些cDNA為模板分析上述3個(gè)候選基因的表達(dá)量，結(jié)果表明，GRMZM2G019260在3個(gè)材料中存在顯著差異，GRMZM2G019567在3個(gè)材料中雖然表達(dá)但不存在顯著差異，GRMZM5G808271在3個(gè)材料不表達(dá)(圖2d)。這些結(jié)果表明沈137和沈137-NIL68葉夾角存在差異是由GRMZM2G019260的表達(dá)量不同引起的，由此說(shuō)明GRMZM2G019260就是qLAl區(qū)域內(nèi)調(diào)控玉米葉夾角的候選基因，命名為ZmCLAl。
[0020]3:ZmCLAI正向調(diào)控玉米葉夾角
ZmCLAl在沈137中使葉夾角增大，在沈137-NIL68中使葉夾角減小，因此我們檢測(cè)了ZmCLAl基因的表達(dá)情況。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，從玉米生長(zhǎng)發(fā)育的3到19葉期的葉片(圖3)、葉鞘(圖4)、葉枕(圖5)和莖尖(圖6)中均高效表達(dá)。在玉米的不同發(fā)育階段，沈137和沈137-NIL68的表達(dá)量具有一定的相似性，都是從3葉期開始表達(dá)，9到10葉期表達(dá)量較高，11葉期后表達(dá)量降低。就不同材料而言，ZmCLAl在沈137的不同時(shí)期、不同部位的表達(dá)量明顯高于沈137-NIL68 (圖3_6)，表明ZmCLAl的表達(dá)量高玉米的葉夾角就相對(duì)增大，由此提出ZmCLAl作為正向調(diào)控因子調(diào)控玉米葉夾角的大小。
[0021]4:細(xì)胞形態(tài)觀察證明沈137-NIL68的葉夾角是由于葉枕等部位橫截面細(xì)胞長(zhǎng)度縮小所致，實(shí)施例3對(duì)基因在沈137和沈137-NIL68中不同器官、不同葉期的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果表明，癌因在莖尖、葉枕、葉鞘、葉片中均高效表達(dá).因此，采用石蠟切片法(參照潘葉等，一種適用于植物組織的快速石蠟制片法。2008，農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)科學(xué)，24 (3) 112-115所示方法與步驟)在穩(wěn)定時(shí)期的葉枕、葉片部位的細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析，有助于了解為基因在此處表達(dá)效果的分析。通過(guò)對(duì)葉枕、葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)，沈137與沈137-NIL68植株在其所選取部位的橫截面細(xì)胞的的長(zhǎng)度存在顯著的差異。由圖7可以看出，沈137-NIL68的細(xì)胞明顯短于沈137。這些結(jié)果表明ZmCLAl可能影響細(xì)胞發(fā)育從而導(dǎo)致葉夾角的變化。
[0022]5 =ZmCLAl過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證其基因功能
(1)過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建
根據(jù)為基因的編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物TF與TR，引物5’端分別加上BglII和Spel酶切位點(diǎn)。用該引物擴(kuò)增沈137材料中ZmCLAm cDNA序列，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，將回收目的PCR產(chǎn)物連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化、挑選單克隆、PCR檢測(cè)、測(cè)序、并將測(cè)序正確的菌液提取質(zhì)粒，將該質(zhì)粒與PBI1391載體質(zhì)粒分別用BglII和分el酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切。分別回收酶切后的目的片段，利用T4連接酶連接載體片段和目的片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，鑒定陽(yáng)性克隆，提取重組質(zhì)粒，命名為PBI1391-為aJ7。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用于轉(zhuǎn)化玉米自交系豫82。
[0023]引物TF 5-GAAGATCTATGGAAGTGGTGGCGTCG -3’,橫線部分為酶切位點(diǎn) BglII TR:5’ -GGACTATCAGTATTAATCTGAATGGAC -3’，橫線部分為酶切位點(diǎn)分el
(2)遺傳轉(zhuǎn)化
采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米莖尖遺傳轉(zhuǎn)化方法(參照張君，玉米葉夾角有關(guān)的ZmCLA4基因圖位克隆與功能分析，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2014)。經(jīng)過(guò)種子處理、種子萌發(fā)、切生長(zhǎng)點(diǎn)、菌液培養(yǎng)、浸染，浸染過(guò)的幼苗，23度培養(yǎng)三天就可以移入盆中，移苗前用自來(lái)水洗苗，苗洗凈后移入花盆中。移栽后，上面灑一層略微濕潤(rùn)的蛭石，用浸過(guò)的保鮮膜罩在花盆上(每盆60株即可)，蓋上紙板遮光，等苗長(zhǎng)至兩葉一芯時(shí)，噴除草劑，噴灑時(shí)要均勻，溫室中溫度在30度左右。剔除對(duì)除草劑敏感的幼苗，對(duì)除草劑鈍感的幼苗提取葉片總DNA，進(jìn)行標(biāo)記基因的PCR檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)出的陽(yáng)性株移栽大田，自交獲得TO代種子，完成對(duì)轉(zhuǎn)基因TO代的鑒定過(guò)程。
[0024]本實(shí)施例共獲得23株獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株，其葉夾角表現(xiàn)不同程度的增大，而5株空載體PBI1391的對(duì)照株則葉夾角沒(méi)有明顯的變化(圖8)
6 =RNAi (RNA干擾)載體轉(zhuǎn)化驗(yàn)證ZmCLAl基因功能
根據(jù)ZmCLAl基因的結(jié)構(gòu)，我們?cè)赯mCLAl基因的編碼區(qū)域設(shè)計(jì)了一對(duì)RNAi引物RNA1-F(5， -actagtggatccGTTGTTGCAGTTCTTCTTC-3，)和 RNA1-R (5， - agatctggtaccGGATAGCACTACCGACTCAT-3’，其中的下劃線表示加的酶切位點(diǎn))從ρΒΙ1391_Ζ〃?αΧ7中擴(kuò)增出來(lái)，以該序列及其反向序列形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)插入到PJL1460載體中，從而形成pZmCLAl-RNAi載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用于轉(zhuǎn)化玉米自交系沈137。其遺傳轉(zhuǎn)化方法同實(shí)施例5的遺傳轉(zhuǎn)化。本實(shí)施例共獲得18株獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株，其葉夾角表現(xiàn)不同程度的減小，而7株空載體PJL1460的對(duì)照株則葉夾角沒(méi)有明顯的變化(圖9)。
[0025]由此可見，通過(guò)RNAi技術(shù)抑制沈137中內(nèi)源ZmCLAl基因的表達(dá)后，導(dǎo)致玉米葉夾角顯著減小，證明認(rèn)為控制ZmCLAl基因的表達(dá)可應(yīng)用培育株型緊湊、葉夾角小的自交系作為育種的基礎(chǔ)材料，可用于培育耐密的育種雜交種在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用。
【權(quán)利要求】
1.控制玉米葉夾角大小的21110^1基因，其核苷酸序列如3即10勵(lì):1所示。
2.控制玉米葉夾角大小的21110^1基因，其蛋白質(zhì)序列如3即10勵(lì):2所示。
3.控制玉米葉夾角大小的200^1基因在選育耐密株型玉米的方法，其特征在于，它的步驟如下: (1)以緊湊型自交系豫82為供體親本，以松散型玉米自交系沈137為受體親本，采用回交轉(zhuǎn)育結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇構(gòu)建位于第一染色體的主效也“的近等基因系沈137-^1168 ； (2)采用圖位克隆技術(shù)分離21110^1基因，利用價(jià)仏1技術(shù)抑制玉米內(nèi)源21110^1基因的表達(dá)選育玉米葉夾角小的自交系。
4.控制玉米葉夾角大小的200^1基因應(yīng)用于選育耐密株型玉米，其特征在于:在21110^1基因的編碼區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)1？嫩1引物:5’0—3’ 尺X八 1—尺:5’00^^81:8^08 01:800^801:0 &七一3’ 從1)811391-^^“沖擴(kuò)增出來(lái)，以該序列及其反向序列形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)插入到？幾1460載體中，從而形成載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，用于轉(zhuǎn)化玉米自交系沈137，得到葉夾角表現(xiàn)不同程度的減小的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株。
【文檔編號(hào)】A01H1/02GK104480121SQ201410778824
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月17日
【發(fā)明者】陳彥惠, 庫(kù)麗霞, 郭書磊 申請(qǐng)人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)