一種用于鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，屬于植物組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基用于散播鐵皮石斛果莢內(nèi)的種子，誘導(dǎo)種子萌發(fā)形成胚芽，外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，在基本培養(yǎng)基中添加瓊脂5～9g/L，白糖28～30g/L，活性炭0.5～0.6g/L，香蕉65～75g/L，自制有機(jī)液肥1.5～2g/L，滅菌劑1.5～2.5ml/L，外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為5.4～5.8。本發(fā)明的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中沒有添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，采用天然的香蕉泥和特定的自制有機(jī)液肥能夠促進(jìn)細(xì)胞和組織的增殖與分化，既安全又環(huán)保。同時(shí)，為提高鐵皮石斛組培苗的繁殖系數(shù)及移栽成活率提供了保證，解決了現(xiàn)有技術(shù)中生根緩慢、成活率不高的問題。
【專利說(shuō)明】一種用于鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地說(shuō)，涉及一種用于鐵皮石斛組培苗 培養(yǎng)的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

【背景技術(shù)】
[0002] 鐵皮石斛為多年生草本，屬附生蘭類，俗名鐵皮楓斗，因其老莖外呈黑色，又名為 黑節(jié)草，石斛是常用的名貴中藥，應(yīng)用歷史悠久，在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，現(xiàn)已證實(shí) 它具有滋陰清熱、生津益胃、止咳潤(rùn)肺、潤(rùn)喉明目、提高人體免疫功能、防治腫瘤和心血管疾 病以及改善睡眠、防治白內(nèi)障、延年益壽等功效。但由于生長(zhǎng)環(huán)境特殊和分布局限，以及長(zhǎng) 期采挖，自然資源日趨枯竭，已被國(guó)家列為重點(diǎn)保護(hù)的野生藥材并鼓勵(lì)人工大面積栽培鐵 皮石斛。
[0003] 植物組織培養(yǎng)作為一種有效的技術(shù)手段已被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐的各個(gè)領(lǐng)域。傳 統(tǒng)的鐵皮石斛的培育主要是通過(guò)扦插、分株的方式，但其繁殖率較低，生根緩慢，生長(zhǎng)周期 長(zhǎng)。為了滿足市場(chǎng)的需求，國(guó)內(nèi)外許多科研人員進(jìn)行了鐵皮石斛組織培養(yǎng)技術(shù)的研究，期望 能進(jìn)行批量生產(chǎn)并提高種苗的繁殖系數(shù)及移栽成活率，這是目前亟待解決的問題。而要提 高種苗的移栽成活率，用于組織培養(yǎng)的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方至關(guān)重要。
[0004] 通過(guò)專利檢索，關(guān)于鐵皮石斛組織培養(yǎng)技術(shù)的技術(shù)方案，已有相關(guān)技術(shù)方案公開。 如中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01310173395. 0,申請(qǐng)日為：2013. 05. 13,發(fā)明創(chuàng)造名稱為：一種鐵皮石 斛組培苗方法，該申請(qǐng)案公開了一種鐵皮石斛組培苗方法，包括如下操作步驟：制作鐵皮石 斛組培苗的培養(yǎng)基，按下列質(zhì)量配比裝入容器中，然后燒開，經(jīng)過(guò)灌裝機(jī)將培養(yǎng)基灌入組培 瓶中，殺菌消毒，1000?1500克香蕉攪拌成糊狀，白糖200?300克，硫酸亞鐵90?105 毫升，硝酸銨25?33克，硝酸鉀35?40克，硫酸鎂5?8克，甘氨酸8?12毫升，維生素 B11?3暈升，B21?3各暈升，糖氨基酸20?30暈升，萘乙酸20?30暈升，自來(lái)水1000 毫升；用成熟鐵皮石斛種子的花粉播種在上述培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)3個(gè)月后母苗長(zhǎng)出。
[0005] 又如，中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01210102034. 2,申請(qǐng)日為：2012. 03. 31，發(fā)明創(chuàng)造名稱 為：一種鐵皮石斛無(wú)激素組織培養(yǎng)的方法，該申請(qǐng)案公開了一種鐵皮石斛無(wú)激素組織培養(yǎng) 的方法，該方法包括鐵皮石斛種子萌發(fā)為圓球莖，圓球莖的生長(zhǎng)，增殖分化，莖段的生根、壯 苗四個(gè)組織培養(yǎng)階段，這四個(gè)階段所用的培養(yǎng)基依次為：無(wú)激素的MS培養(yǎng)基、無(wú)激素的MS 基本培養(yǎng)基+ 土豆泥15?20g/L培養(yǎng)基、無(wú)激素的MS基本培養(yǎng)基+香蕉泥15?20g/L+ 土豆泥15?20g/L培養(yǎng)基和無(wú)激素的1/2MS基本培養(yǎng)基+香蕉泥15?20g/L+ 土豆泥 15?20g/L培養(yǎng)基。上述兩個(gè)申請(qǐng)案中：中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?01310173395.0公開的技術(shù)方 案是用成熟鐵皮石斛種子的花粉播種在上述培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)3個(gè)月后母苗長(zhǎng)出，然后人工 接種分苗，這種培養(yǎng)方式在實(shí)際應(yīng)用中無(wú)法保證成活率，推廣應(yīng)用難度大。中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?201210102034. 2公開的技術(shù)方案主要是采用了無(wú)激素組織培養(yǎng)技術(shù)，但是其培養(yǎng)基的配方 不盡合理，需要進(jìn)一步改進(jìn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 1.發(fā)明要解決的技術(shù)問題
[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)技術(shù)的不足，提供了一種 用于鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，采用本發(fā)明的技術(shù)方案，能夠促進(jìn)細(xì)胞和 組織的增殖與分化。
[0008] 2?技術(shù)方案
[0009] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
[0010] 本發(fā)明的一種用于鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該外植體誘導(dǎo)培養(yǎng) 基用于散播鐵皮石斛果莢內(nèi)的種子，誘導(dǎo)種子萌發(fā)形成胚芽。
[0011] 更進(jìn)一步地，所述的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，在基本培養(yǎng) 基中添加瓊脂5?9g/L，白糖28?30g/L，活性炭0? 5?0? 6g/L，香蕉65?75g/L，自制有 機(jī)液肥1. 5?2g/L，滅菌劑1. 5?2. 5ml/L，外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為5. 4?5. 8。
[0012] 更進(jìn)一步地，自制天然有機(jī)液肥的配方具體如下：生麩3000g、乳酸菌500g、全脂 奶粉500g、水50000g、米糠3000g、酵母菌500g、磷肥500g、紅糖6000g、海帶3000g、五花肉 500g、魚骨粉500g、雞蛋6個(gè)。
[0013] 更進(jìn)一步地，對(duì)外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌操作，其滅菌溫度為120?126°C，滅 菌時(shí)間為10?40min。
[0014] 3?有益效果
[0015] 采用本發(fā)明提供的技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下顯著效果：
[0016] 本發(fā)明的一種用于鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該外植體誘導(dǎo)培養(yǎng) 基中沒有添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，采用天然的香蕉泥和特定的自制有機(jī)液肥能夠促進(jìn)細(xì)胞和 組織的增殖與分化，既安全又環(huán)保。本發(fā)明自制有機(jī)液肥中的微量元素多樣，能夠更均衡的 利于植物生長(zhǎng)，為提高鐵皮石斛組培苗的繁殖系數(shù)及移栽成活率提供了保證，解決了傳統(tǒng) 的鐵皮石斛的培養(yǎng)方法所帶來(lái)的生根緩慢、成活率不高的問題，所培育出的鐵皮石斛組培 苗較未添加天然有機(jī)物的培養(yǎng)基培育出的苗株粗度、高度、葉片數(shù)均有增加且對(duì)根系有良 好的促進(jìn)作用。

【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述，但它們不是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步限制。
[0018] 實(shí)施例1
[0019] 本實(shí)施例的一種用于鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，該外植體誘導(dǎo)培 養(yǎng)基用于散播鐵皮石斛果莢內(nèi)的種子，誘導(dǎo)種子萌發(fā)形成胚芽。具體在本實(shí)施例中，外植體 誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，在基本培養(yǎng)基中添加瓊脂5. 5g/L，白糖30g/L，活 性炭〇. 5g/L，香蕉67g/L，自制有機(jī)液肥2g/L，滅菌劑2. 5ml/L。本實(shí)施例中外植體誘導(dǎo)培 養(yǎng)基的制備過(guò)程具體如下：（1)、根據(jù)MS培養(yǎng)基的成分及用量稱取藥品，使其充分溶解，并 按相應(yīng)濃度依次取用。（2)、在MS培養(yǎng)基中按所需來(lái)加入各類物質(zhì)，其分別為：瓊脂5. 5g/ L，白糖30g/L，活性炭0. 5g/L，香蕉67g/L，自制有機(jī)液肥2g/L，滅菌劑2. 5ml/L，其中：本實(shí) 施例中的香蕉是指香蕉泥，該香蕉泥是將香蕉去皮，稱重后放于料理機(jī)中加水打成香蕉泥； 在MS培養(yǎng)基中加入各類物質(zhì)的具體過(guò)程為：蒸餾水加熱燒開，取蒸餾水溶解白糖后，加入 瓊脂并攪拌，待其完全熔化，將活性炭、香蕉泥、自制有機(jī)液肥、滅菌劑、基本培養(yǎng)基一齊加 入，用pH試紙測(cè)pH值，并用0. lmol/L的NaOH或HCI調(diào)節(jié)pH值為5. 8,最后加水定容至所 需體積。（3)、將配好的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基灌裝于培養(yǎng)瓶中，然后用瓶蓋封口，放入高壓蒸汽 滅菌鍋中滅菌，其滅菌溫度為120?126°C，滅菌時(shí)間為10?40min均可，將滅過(guò)菌好的培 養(yǎng)基置于冷凝室，觀察無(wú)污染后即可用于接種。本實(shí)施例中的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基中沒有添 加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，目的就是要改善細(xì)胞和組織增殖與分化的環(huán)境，本實(shí)施例中的外植體 誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用天然的香蕉泥和特定的自制有機(jī)液肥能夠促進(jìn)細(xì)胞和組織的增殖與分化， 既安全又環(huán)保。作為本發(fā)明中關(guān)鍵的技術(shù)改進(jìn)，本實(shí)施例中自制有機(jī)液肥中的微量元素多 樣，能夠更均衡的利于植物生長(zhǎng)，為提高鐵皮石斛組培苗的繁殖系數(shù)及移栽成活率提供了 保證。此外，白糖為細(xì)胞呼吸代謝提供底物和能量，它比葡萄糖價(jià)格便宜得多，節(jié)約成本。
[0020] 關(guān)于本實(shí)施例中自制天然有機(jī)液肥具體說(shuō)明如下，外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基和生根培 養(yǎng)基中添加的自制天然有機(jī)液肥配方相同，該自制天然有機(jī)液肥的配方具體如下：生麩 3000g、乳酸菌500g、全脂奶粉500g、水50000g、米糠3000g、酵母菌500g、磷肥500g、紅糖 6000g、海帶3000g、五花肉500g、魚骨粉500g、雞蛋6個(gè)。本實(shí)施例中自制天然有機(jī)液肥的 制作過(guò)程為：(a)將海帶曬干后打成粉；(b)按照上述配方將所有物料全部倒入肥桶混合攪 拌并密閉封存，其中：本實(shí)施例中的米糠為細(xì)米糠，生麩由豆餅和花生麩組成，且豆餅：花 生麩=1:1 (質(zhì)量比），乳酸菌即為酸牛奶；（c)每日早晚各攪拌一次，具體可以是早上8:00 和晚上18:00各攪拌一次；(d)待50?60天后發(fā)酵腐熟，無(wú)臭味，即可使用。本實(shí)施例配置 的特定自制天然有機(jī)液肥由八十幾種天然微量元素含鈣、鎂、硫、銅、鐵、鑰、錳、鋁、硼、鋅、 鉛、鉀、鈉、磷、維生素B1、維生素C、葉綠素、胡蘿卜素等組成。發(fā)明人經(jīng)過(guò)十余年的研究發(fā) 現(xiàn)，采用這種自制天然有機(jī)液肥能夠用于植物生長(zhǎng)期使用，補(bǔ)充植物生長(zhǎng)階段所需的營(yíng)養(yǎng) 元素，使其得到均衡的養(yǎng)分，更全面的促進(jìn)生長(zhǎng)，并提高植物抗病能力，以此改善組培苗的 質(zhì)量，促進(jìn)根系與葉片的生長(zhǎng)，提高了移栽成活率，這是本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)的關(guān)鍵所在。
[0021] 采用本實(shí)施例的一種用于鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，進(jìn) 行培養(yǎng)鐵皮石斛組培苗具體步驟為：
[0022] 步驟一、種子的誘發(fā)及培養(yǎng)：選取顆粒飽滿、無(wú)病蟲害的鐵皮石斛果莢作為外植 體，在超凈工作臺(tái)上對(duì)其進(jìn)行初步修剪，用75%乙醇溶液沖洗3遍，再用95%乙醇溶液沖洗 1遍，濾干水分。用無(wú)菌刀切開鐵皮石斛果莢，將果莢內(nèi)的種子散播在本實(shí)施例中的外植體 誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)種子萌發(fā)，將外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于培養(yǎng)架上，培養(yǎng)溫度為23?25°C 均可，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，光照強(qiáng)度1500Lx條件下培養(yǎng)30?45天，種子萌發(fā)形成胚 芽。
[0023] 步驟二、胚芽增殖繼代培養(yǎng)：將步驟一中形成的胚芽轉(zhuǎn)接于增殖繼代培養(yǎng)基上進(jìn) 行培養(yǎng)，將增殖繼代培養(yǎng)基放在培養(yǎng)室中，培養(yǎng)溫度為23?25°C均可，光照時(shí)間為12小時(shí) /天，光照強(qiáng)度1800?2000Lx條件下培養(yǎng)80?90天，得到鐵皮石斛幼苗。本實(shí)施例中的 增殖繼代培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，在基本培養(yǎng)基中添加瓊脂6g/L，白糖30g/L， 活性炭〇. 5g/L，香蕉50g/L，滅菌劑2.5ml/L。本實(shí)施例中的增殖繼代培養(yǎng)基沒有添加植物 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，而用天然的香蕉泥作為營(yíng)養(yǎng)成分，采用本實(shí)施例特定的增殖繼代培養(yǎng)基，能夠 在沒有植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的情況下保證鐵皮石斛組培苗的培養(yǎng)過(guò)程。此外，本實(shí)施例中增殖 繼代培養(yǎng)基添加活性炭用于吸附培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生的部分有毒物質(zhì)，且增加通氣度，利于發(fā) 根。
[0024] 步驟三、生根苗的培養(yǎng)：將步驟二中得到的鐵皮石斛幼苗轉(zhuǎn)入到生根培養(yǎng)基上，對(duì) 其進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25?26°C均可，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，光照強(qiáng)度1800?2000Lx 條件下培養(yǎng)1〇〇?120天，得到鐵皮石斛壯苗。本實(shí)施例中的生根培養(yǎng)基以自制母液作為 基本培養(yǎng)基，在基本培養(yǎng)基中添加瓊脂6g/L，白糖20g/L，活性炭0. 5g/L，香蕉50g/L，自制 天然有機(jī)液肥1. 5g/L，滅菌劑2. 5ml/L。自制母液的配方具體為：硫酸銨0. 46g/L、氯化鈣 0? 17g/L、肌醇0? lg/L、硝酸鉀2. 83g/L、硫酸亞鐵0? 03g/L、l-萘乙酸2mg/L、磷酸二氫鉀 〇. 4g/L、硫酸鎂0. 19g/L。本實(shí)施例中的自制母液中添加的1-萘乙酸可以用于誘導(dǎo)不定根 的生長(zhǎng)，且植物在不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段對(duì)無(wú)機(jī)鹽的需求不同，故按此比例自制母液能夠滿 足不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段對(duì)無(wú)機(jī)鹽的需求。本實(shí)施例中生根培養(yǎng)基中添加的香蕉泥對(duì)根系有 良好的促進(jìn)作用，且通過(guò)其它特定的組分作為配合，利用本發(fā)明特定的生根培養(yǎng)基配方能 夠顯著促進(jìn)根系生長(zhǎng)，尤其是其中的自制天然有機(jī)液肥為后續(xù)對(duì)成活率的保證起到了關(guān)鍵 作用。此外，本實(shí)施例通過(guò)添加滅菌劑，降低了污染率。
[0025] 步驟四、移栽：將步驟三進(jìn)行生根培養(yǎng)后的鐵皮石斛壯苗進(jìn)行煉苗后移栽。
[0026] 本實(shí)施例培養(yǎng)的鐵皮石斛組培苗具體情況見表1，由此可以證明本實(shí)施例的外植 體誘導(dǎo)培養(yǎng)基能夠改善組培苗的質(zhì)量，提高了鐵皮石斛組培苗的品質(zhì)及種苗移栽成活率， 從而解決鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中的關(guān)鍵技術(shù)難點(diǎn)。
[0027] 表1實(shí)施例1-3的鐵皮石斛組培苗具體情況
[0028]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特征在于，該外植體誘導(dǎo)培 養(yǎng)基用于散播鐵皮石斛果莢內(nèi)的種子，誘導(dǎo)種子萌發(fā)形成胚芽。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特 征在于，所述的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基，在基本培養(yǎng)基中添加瓊脂 5?9g/L，白糖28?30g/L，活性炭0? 5?0? 6g/L，香蕉65?75g/L，自制有機(jī)液肥1. 5? 2g/L，滅菌劑1. 5?2. 5ml/L，外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH為5. 4?5. 8。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特 征在于，自制天然有機(jī)液肥的配方具體如下：生麩3000g、乳酸菌500g、全脂奶粉500g、水 50000g、米糠3000g、酵母菌500g、磷肥500g、紅糖6000g、海帶3000g、五花肉500g、魚骨粉 500g、雞蛋6個(gè)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于鐵皮石斛組培苗培養(yǎng)的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基，其特 征在于，對(duì)外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌操作，其滅菌溫度為120?126°C，滅菌時(shí)間為10? 40min〇
【文檔編號(hào)】A01H4/00GK104429972SQ201410826442
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月25日
【發(fā)明者】鄭毓華, 于太和, 周道陽(yáng) 申請(qǐng)人:安徽同創(chuàng)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)投資發(fā)展有限公司