本申請(qǐng)要求2013年11月26日提交的“通過破囊壺菌PUFA合酶在油料作物中產(chǎn)生ω-3長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸”的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)系列號(hào)61/909,289的申請(qǐng)日的權(quán)益。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明公開一般性地涉及用多不飽和脂肪酸(PUFA)合酶系統(tǒng)和一種或多種輔助蛋白遺傳修飾的重組宿主生物(例如，植物)，所述輔助蛋白允許和/或提高PUFA在宿主生物中的產(chǎn)生。本發(fā)明還涉及制造和利用這種生物(例如，為了獲得PUFA)的方法以及從這種生物獲得的產(chǎn)物(例如，油和種子)。

背景

多不飽和脂肪酸(PUFA)被認(rèn)為可用于營(yíng)養(yǎng)、藥物、和工業(yè)應(yīng)用，以及其他目的。然而，對(duì)于許多長(zhǎng)期的商業(yè)需求而言，天然來源(例如，魚油和海藻油)以及來自化學(xué)合成的PUFA的當(dāng)前供應(yīng)不足，或者成本效益不高。

來源于植物(例如，油料作物)的植物油相對(duì)價(jià)廉，沒有與魚油相關(guān)的污染問題，并被認(rèn)為是可持續(xù)的。然而，商業(yè)開發(fā)的植物和植物油中發(fā)現(xiàn)的PUFA一般不包括更飽和或更長(zhǎng)鏈的PUFA，一般僅僅包括諸如亞油酸(十八碳，具有在Δ9和12位置的2個(gè)雙鍵，18:2Δ9,12)和亞麻酸(18:3Δ9,12,15)之類的脂肪酸。

已經(jīng)有人描述了通過修飾由植物內(nèi)源性產(chǎn)生的脂肪酸而在植物中產(chǎn)生更飽和或更長(zhǎng)鏈的PUFA。例如，已經(jīng)有人描述，用編碼脂肪酸延長(zhǎng)酶和/或去飽和酶的不同基因遺傳修飾植物，結(jié)果產(chǎn)生的葉或種子含有顯著水平的更長(zhǎng)鏈且更飽和的PUFA，如二十二碳六烯酸(DHA)和二十碳五烯酸(EPA)，而且含有顯著水平的混合較短鏈且較不飽和的PUFA。Qi等人，(2004)Nature Biotech.22:739；PCT國(guó)際專利公開No.WO 04/071467；Abbadi等人，(2004)Plant Cell16:1；Napier和Sayanova(2005)Proc.Nutr.Soc.64:387-93；Robert等人，(2005)Functional Plant Biol.32:473-79；美國(guó)專利公開No.2004/0172682；Petrie等人，(2012)PLOS One 7:e49165；和美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.61/345,537(2010年5月17日提交)。

公開

本文描述了方法和組合物，可用于在轉(zhuǎn)基因宿主生物(例如，植物細(xì)胞、植物部分、和植物)中產(chǎn)生LC-PUFA，以及產(chǎn)生在此類PUFA中富集的大量非天然植物脂質(zhì)，例如三酰甘油(TAG)和磷脂(PL)，并且產(chǎn)生相比于以往可得的PUFA主鏈更長(zhǎng)且不飽和程度更高的PUFA。本文還描述了通過提供用功能性PUFA合酶系統(tǒng)遺傳修飾的宿主生物而在宿主植物中產(chǎn)生PUFA的系統(tǒng)。

本文中的一些實(shí)施方案包括遺傳修飾的植物細(xì)胞(例如，芥花(canola)、大豆、和/或擬南芥植物細(xì)胞)，所述植物細(xì)胞包含編碼來自破囊壺菌——裂殖壺菌藻(Schizochytrium alga)(其代表性例子是以ATCC登錄號(hào)PTA-9695保藏(保藏日2009.1.7)的裂殖壺菌屬物種)的多不飽和脂肪酸(PUFA)合酶(PFA1、PFA2、和PFA3)的至少一種多肽，和來自藍(lán)藻細(xì)菌屬—念珠藻屬(Nostoc)的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(HetI)的多核苷酸，所述多核苷酸的表達(dá)產(chǎn)物重構(gòu)功能性PUFA合酶系統(tǒng)。例如，植物細(xì)胞可包含編碼裂殖壺菌PFA1、PFA2、和PFA3；以及念珠藻屬HetI的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，植物細(xì)胞還包含至少一種編碼脂酰CoA合成酶同工酶2(SzACS2)的多核苷酸。在具體的實(shí)施方案中，還在宿主植物細(xì)胞中表達(dá)了編碼至少一種DHA優(yōu)選輔助蛋白的多核苷酸，以促進(jìn)LC-PUFA摻入到種子油中(例如，ACS、DGAT、LPAT、LPCAT、和PDAT)。

本文中的具體實(shí)施方案包括：包括這樣的植物細(xì)胞的遺傳修飾植物(例如，蕓苔屬、大豆屬、擬南芥屬、和油料作物)，以及其后代、種子、組織、或部分。在具體的實(shí)施方案中，遺傳修飾的植物細(xì)胞為油料作物細(xì)胞；例如，但不限于，紅花、向日葵、和棕櫚。表達(dá)功能性PUFA合酶系統(tǒng)的遺傳修飾的油料作物細(xì)胞可生成特征性的脂肪酸概貌，例如，包括含DHA的植物油的脂肪酸概貌。

一些實(shí)施方案提供了編碼功能性PUFA合酶系統(tǒng)的組分(例如，裂殖壺菌PFA1、PFA2、PFA3，和念珠藻屬HetI)以及任選地至少一種輔助蛋白(例如，SzACS2)的多核苷酸。在一些實(shí)例中，這些多核苷酸被包含在單個(gè)重組表達(dá)載體中。在其他實(shí)例中，這些多核苷酸被包含在不同的重組表達(dá)載體中。

在具體的實(shí)施方案中，編碼功能性PUFA合酶系統(tǒng)的組分以任選地至少一 種輔助蛋白的多核苷酸與種子特異性啟動(dòng)子可操作連接。例如，在特定實(shí)例中所述多核苷酸可與選自PvDlec2；PvPhas；LfKCS3；FAE1；BoACP；BnaNapinC；SSPRO2745.1；和SSPRO2743.1的啟動(dòng)子可操作連接，這些啟動(dòng)子元件在本文中有示例。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸與組成型啟動(dòng)子(例如，泛素和CsVMV啟動(dòng)子)、或葉特異性啟動(dòng)子可操作連接。在具體的實(shí)施方案中，可以采用另外的啟動(dòng)子在不同的生長(zhǎng)階段和/或在種子發(fā)育期間以更高的水平(例如，為了提供增加的LC-PUFA積累)驅(qū)動(dòng)功能性PUFA合酶系統(tǒng)的表達(dá)。

在其他實(shí)施方案中，編碼功能性PUFA合酶的組分的多核苷酸編碼：包含與SEQ ID NO:1至少80％相同的氨基酸序列的多肽；包含與SEQ ID NO:4至少80％相同的氨基酸序列的多肽；和/或包含與SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:14至少80％相同的氨基酸序列的多肽，其中所述多核苷酸還包含HetI基因(例如，編碼與SEQ ID NO:10的編碼產(chǎn)物具有至少80％同一性的多肽的多核苷酸)。在一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸還包含SzACS2基因(例如，編碼與SEQ ID NO:11的編碼產(chǎn)物具有至少80％同一性的多肽的多核苷酸)。

在具體的實(shí)例中，編碼功能性PUFA合酶的組分的多核苷酸包括：與SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3至少70％相同的多核苷酸；與SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6至少70％相同的多核苷酸；與SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、和/或SEQ ID NO:13至少70％相同的多核苷酸；和/或編碼與SEQ ID NO:10至少80％相同的多肽的多核苷酸。在某些實(shí)例中，多核苷酸還包括編碼與SEQ ID NO:11具有至少80％同一性的多肽的多核苷酸。

在具體的實(shí)例中，編碼功能性PUFA合酶的組分的多核苷酸在嚴(yán)格條件(例如，極嚴(yán)格條件)下與SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、和/或SEQ ID NO:13；SEQ ID NO:10；和/或SEQ ID NO:11雜交。在某些實(shí)例中，多核苷酸在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:10；和SEQ ID NO:11中的全部雜交。

本文中還描述了產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法，其中所述方法包括將編碼功能性PUFA合酶的組分的多核苷酸導(dǎo)入植物細(xì)胞中；和從所述植物細(xì)胞再生植物。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸在單個(gè)載體中被轉(zhuǎn)化到作物細(xì)胞中。在其他實(shí)施方案中，多核苷酸介由多個(gè)載體轉(zhuǎn)化到作物細(xì)胞中，從而生成在不同的事件中包含組成基因的植物。在一些實(shí)施方案中，介由常規(guī)育種，通過基因滲入將 多核苷酸導(dǎo)入作物細(xì)胞中。在具體的實(shí)例中，通過育種雜交來優(yōu)化子代植物的PUFA概貌(例如，通過選擇產(chǎn)生DHA(C22:6，n-3)和/或EPA(C20:5，n-3)的植物)，從而重構(gòu)功能性PUFA合酶系統(tǒng)。

在一些實(shí)施方案中，遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子、或部分，或從該遺傳修飾的植物、其后代、種子、細(xì)胞、組織、或部分獲得的非天然油(例如，生籽油)，含有可檢出量的DHA、DPA(n-6)(C22:5，n-6)、和/或EPA。在具體的實(shí)施方案中，遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子、或部分或油包含這樣的脂肪酸概貌，其具有按重量計(jì)0.01％到15％的DHA(例如，按重量計(jì)0.05％到10％的DHA；或0.05％到5％的DHA)。在具體的實(shí)施方案中，遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子、或部分或油包含這樣的脂肪酸概貌，其具有按重量計(jì)0.01％到10％的EPA(例如，按重量計(jì)0.05％到5％的EPA；或0.05％到1％的EPA)。在具體的實(shí)施方案中，遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子、或部分或油包含這樣的脂肪酸概貌，其具有按重量計(jì)0.01％到10％的DPA(n-6)(例如，按重量計(jì)0.01％到5％的DPA(n-6)；或0.01％到1％的DPA(n-6))。在具體的實(shí)施方案中，遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子、或部分或油包含這樣的脂肪酸概貌，其具有按總脂肪酸的重量計(jì)從10:1到1:30(例如，從約2:1到約1:10、從約1:1到約1:12、從約2:1到約1:11、從約1:1.5到約1:5、從約6:1到約1:6.5、和約1:1.25)的EPA:DHA比率。在具體的實(shí)施方案中，遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、種子、或部分或油包含具有按總脂肪酸的重量計(jì)從1:1到1:10(例如，從約1:2到約1:5、從約1:3到約1:5、約1:3到約1:6、和約1:5)的DPA(n-6):DHA比率的脂肪酸概貌。在具體的實(shí)施方案中，遺傳修飾的植物，其后代、細(xì)胞、組織、種子、或部分或油包含具有按油的重量計(jì)70％到99％甘油三酯的脂肪酸概貌。

在一些實(shí)施方案中，可檢出量的DHA、DPA(n-6)和/或EPA也在從遺傳修飾的植物獲得的植物商業(yè)產(chǎn)品(例如，油產(chǎn)品、特種油產(chǎn)品、谷物、和粕)中被發(fā)現(xiàn)。從本文中描述的遺傳修飾植物獲得的含LC-PUFA的植物油可用作低成本的DHA/EPA來源，用于旨在改進(jìn)人類營(yíng)養(yǎng)的食品成分。從本文中描述的遺傳修飾植物獲得的油和油料種子可作為低成本、高質(zhì)量的ω-3 LC-PUFA來源用于動(dòng)物飼料和水產(chǎn)養(yǎng)殖，或作為交酯化的原料來構(gòu)建富含ω-3 LC-PUFA的結(jié)構(gòu)化脂質(zhì)，以供藥品和營(yíng)養(yǎng)食品應(yīng)用。

本文中還描述了用于產(chǎn)生包含至少一種LC-PUFA的油的方法，其中所述方法包括培植本文中描述的遺傳修飾植物(例如，油料植物)、其后代、細(xì)胞、組織、或部分，和/或從本文中描述的遺傳修飾的植物回收油(例如，種子油)。

本文中還描述了向個(gè)體提供包含至少一種LC-PUFA的補(bǔ)充劑或治療產(chǎn)品的方法，其中所述方法包括向個(gè)體提供本文中描述的遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分、本文中描述的油、本文中描述的種子、本文中描述的食物產(chǎn)品、本文中描述的功能性食品、或本文中描述的藥物產(chǎn)品。在一些實(shí)施方案中，此類實(shí)施方案中包含的LC-PUFA為DHA、DPA(n-6)、和/或EPA。

根據(jù)下面援引附圖展開的若干實(shí)施方案的詳細(xì)說明，能夠更清楚地了解前述特征和其他特征。

附圖簡(jiǎn)述

圖1包括了在某些實(shí)施方案中使用的示例性PUFA合酶構(gòu)建體的總結(jié)。在每個(gè)加框的PTU上示出轉(zhuǎn)錄的方向，在每個(gè)PTU上標(biāo)示出編碼序列，并標(biāo)明了所使用的啟動(dòng)子/終止子組合。

圖1a包括按“取向1”排列的PUFA合酶構(gòu)建體。

圖1b包括按“取向2”排列的構(gòu)建體。

圖1c包括按“取向3”排列的構(gòu)建體。

圖2包括¹⁴C-標(biāo)記的EPA、DHA、和DPA標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC放射性痕量分析。EPA和DHA的保留時(shí)間分別標(biāo)記在約5.3和約6.1分鐘處。

圖3包括用PUFA合酶和HetI轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的擬南芥事件T₂種子中的LC-PUFA含量的總結(jié)。每個(gè)豎條代表來自一個(gè)擬南芥事件的LC-PUFA含量；黑色＝DHA，深灰＝EPA，淺灰＝DPA(n-6)。

圖4包括來自選定的轉(zhuǎn)基因擬南芥的產(chǎn)DHA T₂系的T₃種子子代的LC-PUFA含量的圖示。每個(gè)圓圈代表來自一株純合T2植物的T₃種子?；覘l代表每個(gè)T₃種子系的平均LC-PUFA含量。

圖5包括來自四株純合T₁芥花植物和五株半合T₁芥花植物的個(gè)體T₂種子的LC-PUFA含量的圖示。每個(gè)系分析了48粒種子?！癙UFA”代表DHA+EPA+DPA(n＝6)的總和?？v軸相應(yīng)于LC-PUFA含量，表示為總FAME的％。

序列表

隨附序列表中列出的核酸序列使用如37 C.F.R.§1.822規(guī)定的核苷酸堿基的標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫來表示。每個(gè)核酸序列僅示出了一條鏈，但應(yīng)理解對(duì)被展示的鏈的任何提述也包括其互補(bǔ)鏈。在所附序列表中：

SEQ ID NO:1示出了一個(gè)示例性PFA1蛋白的氨基酸序列：

MDTRIAIVGMSAILPSGENVRESWEAIRDGLDCLSDLPADRVDVTAYYNPEKTTKDKIYCKRGGFIPEYDFDAREFGLNMFQMEDSDANQTISLLKVKEALTDANIPAFSSGKKNIGCVLGIGGGQKASHEFYSRLNYVVVDKVLRKMGLPEEDVAAAVDKYKASFPEWRLDSFPGFLGNVTAGRCCNTFNMEGMNCVVDAACASSLIAVKVAIEELLYGDCDAMIAGATCTDNSIGMYMAFSKTPVFSTDPSVKAYDAATKGMLIGEGSAMLVLKRYADAVRDGDTVHAVIKGCASSSDGKAAGIYTPTISGQEEALRRAYARANVDPATVTLVEGHGTGTPVGDKIELTALSNLFSKAFSANGGGAEEAEQVAVGSIKSQIGHLKAVAGLAGLVKVVLALKHKTLPQTINVDKPPSLVDGTPIQQSPLYVNTMNRPWFTPVGVPRRAGVSSFGFGGANYHAVLEEFEPEHESAYRYNNLPQVALLHAGDVATLAATVRAKLALATAEQEEARVVKNADYIAYHRFLDECKLRGAVPQAHARVGLLVRDLSSLIAVLEAAAAKLAGEESATEWTVSVATGEAAFRVRGVATEANVAALFSGQGAQYTHMFSDVAMNWPPFRESVAAMDRAQRERFGRPAKRVSSVLYPRKPYGDEPRQDHKEISQTRYSQPATLACSVGAFDIFKAAARAPSFAAGHSLGEFAALYAAGSLDRDAVFDLVCARAKAMSDFTAQASSSGGAMAAVIGAKADQLSLGGAPDVWLANSNSPSQTVITGTAEAVAAASDKLRCSGNFRVVPLACEAAFHSPHMRGAEQTFASALAQAPVSAPAAARFYSNVTGGAAVTSPADVKTNLGKHMTSPVQFVQQVRAMHAAGARVFVEFGPKQVLSRLVKETLGEAGDVVTVAVNPDSAKDSDTQLRQAALTLAVAGVPLKDFDRWQLPDATRLEPVKKKKTTLRLSAATYVSAKTLRQREAVLNDGYTVSGATAVVKEVDTANEERLVRQAQDLQRQLAEASTAAQAAQSKVAELERTIQDLERKVQQQQQEKGENSDSNAAAEVLRRHKELLQRMLQDCDEQAVPVATVVPTPTSSPTPTSSPVSGNSKSTRGSADLQALLAKAETVVMAVLAAKTGYEADMVEADMDLEAELGIDSIKRVEILSEVQGQLGVEAKDVDALSRTRTVGEVVDAMKAEIVAASGGSAPAVPSAPAASAAPTPAASTAPSADLQALLSKAETVVMAVLAAKTGYEADMVEADMDLEAELGIDSIKRVEILSEVQGQLGVEAKDVDALSRTRTVGEVVDAMKA EIVAASAGSAPAPAVPSAPAASAAPTPAASTAPSADLQALLSKAETVVMAVLAAKTGYEADMVEADMDLEAELGIDSIKRVEILSEVQGQLGVEAKDVDALSRTRTVGEVVDAMKAEIVAASGGSAPAPAVPSAPAASAAPTPAAATAPSADLQALLAKAETVVMAVLAAKTGYEADMVEADMDLEAELGIDSIKRVEILSEVQGQLGVEAKDVDALSRTRTVGEVVDAMKAEIVAASAGSAPAPAVPSAPAASAAPTPAASTAPSADLQALLSKAETVVMAVLAAKTGYEADMVEADMDLEAELGIDSIKRVEILSEVQGQLGVEAKDVDALSRTRTVGEVVDAMKAEIVAASGGSAPAAAVPSAPAASAAPTPATAPSADLQALLSKAETVVMAVLAAKTGYEADMVEADMDLEAELGIDSIKRVEILSEVQGQLGVEAKDVDALSRTRTVGEVVDAMKAEIVAASGGSAPAAPSAPALLPTLFGSECEDLSLTFPVITTLPLPAELVLAEGGARPVVVVDDGSALTSSLVSSLGDRAVLLQVQSSSACSPRSTTHKLVTVADRSEAALQAALTSVEAQFGKVGGFVFQFGDDDVQAQLGWALLAAKHLKTSLSEQIEGGRTFFVAVARLDGQLGLSGKSTTATVDLSRAQQGSVFGLCKTLDLEWPAVFCRGIDLAADLDAAQAARCLLGELSDPDVAVRESGYSASGQRCTTTTKSLTTGKPHQPISSSDLFLVSGGARGITPLCVRELAQRVGGGTYVLIGRSELPTTEPAWAVGVESGKPLEKAALAFLKAEFAAGRGAKPTPMLHKKLVGAVVGAREVRASLAEITAQGATAVYESCDVSSAAKVREMVERVQQQGGRRVSGVFHASGVLRDKLVENKSLADFSAVYDTKVGGLINLLACVDLAQLRHLVLFSSLAGFHGNVGQSDYAMANEALNKLAAHLSAVHPQLCARSICFGPWDGGMVTPALKANFIRMGIQIIPRQGGAQTVANMLVSSSPGQLLVGNWGVPPVVPSATEHTVLQTLRQSDNPFLDSHVIQGRRVLPMTLAVGYMAHQAQSIYAGHQLWAVEDAQLFKGIAIDNGADVPVRVELSRRKEEQEDAGKVKVKVQVLLKSQVNGKSVPAYKATVVLSPAPRPSVITRDFDLTPDPACTEHDLYDGKTLFHGKAFQGIEQVLSATPKQLTAKCRNLPLTPEQRGQFVVNLSQQDPFQADIAFQAMLVWARMLRQSAALPNNCERFDFYKPMAPGATYYTSVKLASASPLV

DSVCKCTVAMHDEQGEVYFSARASVVLNKTLTY

SEQ ID NO:2示出了一個(gè)示例性PFA1基因的核苷酸序列，在本文中稱為PFA1 v1，其分離自破囊壺菌——裂殖壺菌屬物種(如ATCC登錄號(hào)PTA-9695代表的)：

ATGGATACTCGCATCGCGATCGTGGGGATGTCGGCGATCCTGCCGAGCG GGGAGAACGTGCGCGAGAGCTGGGAGGCGATCCGCGATGGGCTGGATTGCCTGAGCGATCTGCCGGCGGACCGCGTGGACGTGACGGCCTACTACAACCCGGAGAAGACGACCAAGGACAAGATCTACTGCAAGCGCGGCGGGTTCATCCCGGAGTACGACTTCGACGCGCGTGAGTTCGGGCTCAACATGTTCCAGATGGAGGACTCGGACGCCAACCAGACGATCTCGCTGCTCAAGGTGAAGGAGGCGCTGACGGACGCCAACATCCCGGCGTTCTCGAGCGGTAAGAAGAACATCGGCTGCGTGCTGGGCATCGGCGGCGGCCAGAAGGCGAGCCACGAGTTCTACTCGCGGCTCAACTACGTGGTCGTGGACAAGGTGCTGCGCAAGATGGGCCTGCCGGAGGAAGACGTGGCGGCGGCGGTGGACAAGTACAAGGCGAGTTTCCCCGAGTGGCGCCTCGACTCTTTCCCCGGGTTCCTGGGCAACGTCACGGCGGGGCGCTGCTGCAATACCTTCAACATGGAGGGCATGAACTGCGTCGTGGACGCGGCCTGCGCGTCGTCGCTGATCGCGGTCAAAGTGGCGATCGAGGAGCTGCTCTACGGCGACTGCGATGCGATGATCGCGGGTGCCACCTGCACGGACAACTCGATCGGGATGTACATGGCCTTCTCCAAGACGCCCGTGTTTTCCACGGACCCGAGCGTCAAGGCGTACGACGCCGCCACCAAAGGCATGCTCATCGGCGAGGGCTCGGCGATGCTCGTGCTGAAGCGCTACGCGGACGCCGTGCGCGACGGCGACACCGTGCACGCCGTCATCAAGGGGTGCGCGTCCTCGAGCGACGGCAAGGCGGCGGGCATCTACACGCCGACAATCTCGGGCCAGGAGGAGGCCCTGCGCCGCGCCTACGCCCGCGCCAATGTCGACCCGGCCACTGTGACGCTGGTGGAGGGCCACGGCACGGGTACGCCGGTGGGCGACAAGATCGAGCTGACGGCGCTGAGCAACCTCTTCTCCAAGGCGTTTTCTGCCAACGGTGGCGGCGCGGAGGAAGCAGAGCAGGTGGCGGTGGGCAGCATCAAGTCGCAGATCGGGCACCTCAAGGCGGTGGCCGGGCTGGCCGGGCTGGTCAAGGTGGTGCTGGCGCTCAAGCACAAGACGCTGCCGCAGACGATCAACGTCGACAAGCCGCCGTCGCTGGTGGACGGGACCCCGATCCAGCAGTCGCCGCTGTACGTCAACACGATGAACCGCCCCTGGTTCACGCCCGTAGGGGTGCCGCGCCGCGCCGGCGTGTCGTCGTTTGGGTTTGGCGGTGCCAACTACCACGCCGTGCTGGAGGAGTTTGAGCCCGAGCACGAGAGCGCGTACCGGTACAACAACCTGCCGCAGGTGGCGCTGCTGCACGCGGGGGACGTCGCGACCTTGGCGGCGACGGTTCGCGCCAAGCTGGCGCTGGCCACCGCCGAGCAGGAAGAGGCGCGT GTGGTGAAGAACGCGGACTACATCGCGTACCACCGGTTCCTGGACGAGTGCAAGTTGCGCGGCGCTGTGCCGCAGGCGCACGCGCGGGTGGGACTGCTCGTACGGGACCTGAGCTCGCTCATCGCCGTGCTCGAGGCCGCTGCCGCCAAGCTCGCGGGCGAAGAGAGCGCGACGGAGTGGACGGTCAGCGTTGCTACGGGCGAGGCGGCCTTCCGCGTGCGCGGTGTGGCTACGGAGGCCAACGTGGCGGCGCTGTTCTCGGGCCAGGGCGCGCAGTACACGCACATGTTCAGCGACGTGGCGATGAACTGGCCCCCGTTCCGCGAGAGCGTCGCCGCCATGGACCGCGCCCAGCGCGAGCGCTTCGGGCGGCCTGCCAAGCGCGTGAGCAGCGTGCTGTACCCGCGCAAGCCGTACGGCGACGAACCGCGGCAGGACCACAAGGAGATCTCGCAAACGCGCTACTCGCAGCCCGCAACGCTCGCGTGCTCGGTCGGCGCCTTTGACATCTTCAAAGCGGCGGGACTGGCGCCGAGCTTTGCGGCGGGCCACTCGCTGGGCGAGTTTGCGGCGCTCTACGCGGCCGGGTCGCTCGATCGCGACGCCGTCTTCGACCTGGTCTGCGCGCGCGCCAAGGCCATGAGCGACTTCACGGCCCAGGCCAGCAGCAGCGGTGGCGCCATGGCGGCCGTGATTGGCGCCAAGGCGGACCAGCTCTCGCTGGGTGGCGCGCCCGACGTGTGGCTCGCCAACAGCAACTCGCCCTCGCAGACCGTGATCACGGGAACCGCCGAAGCAGTGGCTGCGGCCTCTGACAAGTTGCGCTGCAGCGGCAACTTCCGCGTCGTGCCTCTGGCCTGCGAGGCGGCCTTCCACTCGCCGCACATGCGCGGCGCGGAGCAGACGTTTGCGTCGGCGCTCGCGCAGGCGCCCGTGTCGGCACCGGCGGCTGCTCGGTTCTACTCTAACGTGACGGGGGGCGCCGCGGTAACCTCGCCCGCGGACGTCAAAACGAACCTGGGCAAGCACATGACGAGCCCTGTGCAGTTCGTGCAGCAGGTGCGAGCCATGCACGCGGCGGGCGCGCGTGTGTTTGTGGAGTTTGGGCCCAAGCAGGTCCTGTCGCGCCTCGTCAAGGAGACCCTTGGCGAGGCCGGCGACGTGGTCACGGTCGCCGTCAACCCAGACTCGGCCAAGGACAGCGACACGCAGCTGCGCCAGGCGGCGCTCACGTTGGCGGTCGCCGGCGTGCCGCTCAAGGACTTTGACCGCTGGCAGCTGCCGGATGCCACGCGCCTCGAGCCTGTCAAGAAGAAGAAGACCACGTTGCGGCTCTCGGCAGCCACCTACGTCTCCGCCAAGACGTTGCGCCAGCGCGAGGCCGTGCTCAACGACGGCTACACTGTCAGTGGTGCCACGGCGGTAGTCAAGGAAGTGGACACGGCCAACGAGGAGCGTCTCGTCCGCCAAGCCCAGGATCTCCAGCGCCAGC TCGCGGAGGCCTCGACGGCAGCCCAGGCGGCGCAGTCCAAGGTCGCGGAGCTCGAGCGCACGATCCAGGACTTGGAGCGCAAGGTGCAGCAGCAGCAGCAAGAGAAGGGTGAGAACTCAGACAGCAACGCTGCCGCCGAAGTGCTGCGGCGCCACAAGGAGCTGCTCCAGCGCATGCTGCAGGACTGTGACGAGCAGGCAGTGCCCGTAGCCACGGTGGTTCCGACACCTACGTCCTCCCCGACGCCTACATCCTCACCCGTATCCGGCAACAGCAAGAGCACTCGTGGCAGTGCTGATCTGCAAGCGCTGCTGGCCAAGGCGGAGACTGTGGTGATGGCTGTGCTGGCTGCCAAGACTGGCTACGAGGCCGACATGGTTGAGGCGGACATGGACCTGGAGGCCGAGCTCGGCATCGACTCGATCAAGCGCGTGGAGATCCTTTCCGAGGTGCAGGGCCAGCTGGGCGTCGAGGCCAAGGACGTGGATGCGCTGAGCCGCACGCGCACGGTCGGTGAGGTTGTGGACGCCATGAAGGCGGAGATCGTGGCTGCCTCTGGTGGTAGTGCTCCTGCGGTTCCTTCGGCGCCCGCTGCTTCTGCAGCTCCGACTCCCGCTGCTTCGACTGCGCCTTCTGCTGATCTGCAAGCGCTGCTGTCCAAGGCGGAGACTGTGGTGATGGCTGTGCTGGCGGCCAAGACTGGCTACGAGGCCGACATGGTCGAGGCGGACATGGACCTGGAGGCCGAGCTCGGCATCGACTCGATCAAGCGCGTGGAGATCCTCTCGGAGGTGCAGGGCCAGCTGGGCGTCGAGGCCAAGGACGTGGATGCGCTGAGCCGCACGCGCACGGTCGGTGAGGTTGTGGATGCCATGAAGGCGGAAATCGTGGCTGCCTCTGCTGGTAGTGCTCCTGCTCCTGCTGTTCCTTCGGCGCCCGCTGCTTCTGCAGCTCCGACTCCCGCTGCTTCGACTGCGCCTTCTGCTGATCTGCAAGCGCTGCTGTCCAAGGCGGAGACGGTGGTGATGGCTGTGCTGGCGGCCAAGACTGGCTACGAGGCCGACATGGTCGAGGCGGACATGGACCTGGAGGCCGAGCTCGGCATCGACTCGATCAAGCGCGTGGAGATCCTCTCGGAGGTGCAGGGCCAGCTGGGCGTCGAGGCCAAGGACGTGGATGCGCTGAGCCGCACGCGCACGGTCGGTGAGGTTGTGGATGCCATGAAGGCGGAAATCGTGGCTGCCTCTGGTGGTAGTGCTCCTGCTCCTGCGGTTCCTTCGGCGCCCGCTGCTTCTGCAGCTCCGACTCCCGCGGCTGCGACAGCGCCTTCTGCTGATCTGCAAGCGCTGCTGGCCAAGGCGGAGACTGTGGTGATGGCTGTGCTGGCGGCCAAGACTGGCTACGAGGCCGACATGGTCGAGGCGGACATGGACCTGGAGGCCGAGCTCGGCATCGACTCGATCAAGCGCGTGGAGATCCTTTCCGAGGTGCAGGGCCAG CTGGGCGTCGAGGCCAAGGACGTAGATGCGCTGAGCCGCACGCGCACGGTCGGTGAGGTTGTGGATGCCATGAAGGCGGAGATCGTGGCTGCCTCTGCTGGTAGTGCTCCTGCTCCTGCTGTTCCTTCGGCGCCCGCTGCTTCTGCAGCTCCGACTCCCGCTGCTTCGACTGCGCCTTCTGCTGATCTGCAAGCGCTGCTGTCCAAGGCGGAGACTGTGGTGATGGCTGTGCTGGCGGCCAAGACTGGCTACGAGGCCGACATGGTCGAGGCGGACATGGACCTGGAGGCCGAGCTCGGCATCGACTCGATCAAGCGCGTGGAGATCCTCTCGGAGGTGCAGGGCCAGCTGGGCGTCGAGGCCAAGGACGTGGATGCGCTGAGCCGCACGCGCACGGTCGGTGAGGTTGTGGATGCCATGAAGGCGGAAATCGTGGCTGCCTCTGGTGGTAGTGCTCCTGCTGCTGCTGTTCCTTCGGCGCCCGCTGCTTCTGCAGCTCCGACTCCTGCGACTGCGCCTTCTGCTGATCTGCAAGCGCTGCTGTCCAAGGCGGAGACTGTGGTGATGGCTGTGCTGGCGGCCAAGACTGGCTACGAGGCCGACATGGTCGAGGCGGACATGGACCTGGAGGCCGAGCTCGGCATCGACTCGATCAAGCGCGTGGAGATCCTTTCCGAGGTGCAGGGCCAGCTGGGCGTCGAGGCCAAGGACGTAGATGCGCTGAGCCGCACGCGCACGGTCGGTGAAGTGGTGGACGCCATGAAGGCGGAGATCGTGGCTGCCTCTGGTGGTAGTGCTCCTGCTGCTCCTTCGGCGCCCGCGCTTCTTCCAACGCTGTTTGGTTCCGAGTGCGAGGACCTGTCTCTGACCTTTCCCGTGATAACGACCCTGCCGCTTCCTGCAGAGCTTGTGCTGGCCGAGGGCGGCGCTCGCCCTGTAGTCGTGGTGGATGATGGATCTGCACTCACCTCGTCGCTGGTGTCCTCGCTCGGCGATCGTGCGGTGCTGCTGCAGGTGCAGTCTTCCTCTGCCTGCTCGCCGCGCTCGACCACGCACAAGTTGGTGACCGTAGCAGACCGCTCTGAAGCGGCGCTACAGGCGGCGCTCACGTCCGTCGAGGCGCAGTTCGGCAAGGTGGGTGGCTTTGTGTTCCAGTTCGGCGACGACGACGTGCAAGCGCAGCTCGGCTGGGCGCTGCTCGCGGCCAAGCACCTCAAAACTTCGCTGTCAGAACAGATCGAGGGCGGTCGCACCTTTTTCGTGGCCGTCGCGCGGCTCGACGGCCAGCTGGGGCTCTCCGGCAAGTCGACGACCGCTACCGTTGATCTCTCCCGCGCGCAGCAGGGCAGCGTGTTCGGCCTGTGCAAGACACTCGACCTGGAGTGGCCCGCTGTCTTCTGCCGCGGAATCGACCTGGCCGCCGACCTCGACGCCGCACAGGCCGCGCGGTGCCTGCTGGGCGAGCTGTCAGACCCCGACGTGGCCGTGCGCGAGTCTGGTTACTCCG CCTCGGGCCAGCGCTGCACGACAACTACGAAGTCGCTGACTACGGGCAAGCCGCACCAGCCGATCTCCTCGTCGGACCTCTTTCTGGTGTCGGGCGGCGCGCGCGGCATCACCCCGCTGTGCGTGCGCGAGCTGGCGCAGCGCGTGGGCGGCGGCACGTACGTGCTCATCGGCCGCTCGGAGCTGCCCACGACGGAGCCTGCCTGGGCGGTCGGCGTGGAGTCTGGCAAGCCGCTGGAGAAGGCCGCGCTGGCGTTCCTGAAGGCGGAGTTTGCAGCGGGCCGCGGGGCCAAGCCGACGCCGATGCTGCACAAGAAGCTCGTGGGCGCCGTGGTCGGAGCGCGCGAGGTGCGAGCCTCGCTCGCCGAGATCACTGCACAGGGCGCCACGGCTGTGTACGAGTCGTGCGACGTGAGCTCTGCCGCCAAGGTGCGTGAGATGGTAGAGCGCGTGCAGCAGCAGGGCGGGCGGCGCGTGTCGGGCGTGTTCCACGCGTCGGGCGTGCTGCGCGACAAGCTCGTGGAGAACAAGTCGCTGGCGGACTTCAGCGCCGTGTACGACACCAAGGTGGGCGGCCTCATCAACCTGCTGGCCTGCGTGGACCTGGCGCAGCTGCGTCACCTCGTGCTCTTCAGCTCGCTCGCGGGCTTCCACGGCAACGTCGGGCAGTCGGACTACGCAATGGCCAACGAGGCGCTCAACAAGCTGGCGGCGCACCTGTCGGCGGTGCACCCGCAGCTGTGCGCGCGCTCGATCTGCTTCGGACCGTGGGACGGCGGCATGGTGACCCCCGCGCTCAAGGCCAACTTCATCCGCATGGGCATCCAGATCATCCCGCGCCAAGGCGGCGCGCAGACCGTCGCCAACATGCTCGTCAGTAGCTCCCCCGGTCAGCTGCTCGTGGGCAACTGGGGCGTGCCACCCGTCGTGCCGAGTGCCACCGAGCACACCGTGCTGCAGACGCTCCGCCAGAGCGACAACCCCTTCCTCGACTCGCACGTGATCCAGGGCCGCCGCGTGCTGCCCATGACCCTGGCCGTGGGCTACATGGCGCACCAGGCGCAGAGCATCTACGCGGGCCACCAGCTGTGGGCCGTCGAGGACGCCCAGCTCTTCAAGGGCATCGCCATCGACAATGGCGCCGACGTGCCCGTGCGCGTGGAGCTGTCGCGCCGCAAGGAGGAGCAGGAGGACGCCGGCAAGGTCAAGGTCAAGGTGCAGGTGCTGCTCAAATCGCAGGTCAACGGCAAGTCGGTGCCCGCGTACAAGGCGACCGTCGTGCTGTCCCCTGCGCCGCGCCCCAGCGTCATCACGCGTGACTTCGACCTCACCCCGGACCCGGCCTGCACGGAGCACGACCTCTACGACGGCAAGACGCTCTTCCACGGCAAGGCCTTCCAGGGCATCGAGCAGGTGCTCTCGGCGACGCCCAAGCAGCTCACCGCCAAGTGCCGCAATTTGCCCCTCACGCCCGAGCAGCGCGGCCAGTTCGTCGTT AACCTCAGCCAGCAGGACCCGTTCCAGGCGGACATTGCGTTCCAGGCGATGCTCGTCTGGGCGCGCATGCTGCGCCAATCGGCGGCCCTGCCCAACAACTGCGAGCGCTTCGACTTTTACAAGCCGATGGCCCCGGGCGCCACCTACTACACGTCGGTCAAGCTGGCCTCGGCCTCACCCTTGGTGGACTCTGTGTGCAAGTGCACCGTGGCGATGCACGATGAGCAAGGTGAGGTGTACTTTTCTGCTCGT

GCCAGCGTCGTCCTCAACAAGACCCTCACGTACTAA

SEQ ID NO:3示出了示例性的植物優(yōu)化的PFA1基因的核苷酸序列，在本文中稱為PFA1 v2：

ATGGATACCAGAATTGCCATTGTGGGAATGAGTGCGATCCTTCCGAGTGGTGAGAATGTTAGAGAGAGCTGGGAGGCCATCAGAGATGGCTTGGATTGTCTGTCTGATCTGCCTGCGGATCGTGTGGATGTGACTGCCTATTACAATCCAGAGAAAACGACCAAGGACAAAATCTACTGCAAAAGAGGTGGGTTCATCCCTGAGTATGACTTTGATGCTCGTGAGTTTGGCCTCAACATGTTCCAGATGGAAGATTCTGATGCGAACCAGACCATCTCATTGCTCAAGGTGAAGGAAGCTCTCACCGATGCCAACATACCTGCTTTCTCAAGTGGCAAAAAGAACATTGGTTGTGTTCTTGGCATAGGTGGAGGTCAGAAGGCGTCACATGAGTTCTACTCCAGACTCAACTATGTTGTGGTTGACAAAGTGCTCAGAAAGATGGGTTTGCCAGAGGAAGATGTGGCAGCTGCGGTGGACAAGTACAAGGCGAGCTTCCCAGAGTGGAGGCTTGATTCTTTTCCTGGTTTCTTGGGCAATGTTACCGCTGGCAGATGTTGCAACACCTTCAACATGGAGGGCATGAACTGTGTCGTTGACGCTGCCTGTGCTTCAAGCCTGATTGCGGTCAAGGTGGCAATAGAAGAGCTTCTCTATGGTGACTGTGATGCCATGATTGCTGGTGCCACCTGCACAGACAATTCAATAGGGATGTACATGGCCTTCTCCAAGACGCCTGTTTTCTCTACGGACCCGAGTGTCAAAGCGTATGATGCTGCCACCAAAGGCATGTTGATTGGTGAAGGATCTGCGATGCTTGTTCTGAAGAGATATGCGGATGCTGTCAGAGATGGTGACACTGTTCATGCTGTCATCAAGGGCTGTGCTTCCTCAAGTGATGGAAAAGCAGCTGGAATCTACACACCGACAATCAGCGGACAAGAAGAGGCTCTCCGTAGAGCCTATGCACGTGCCAATGTGGACCCAGCCACTGTCACTCTTGTTGAAGGACATGGAACTGGCACTCCGGTTGGGGACAAGATTGAACTCACAGCTCTGAGCAATCTCTTCTCCAAA GCGTTTTCTGCGAATGGAGGTGGAGCTGAGGAAGCTGAGCAAGTTGCTGTTGGCAGCATCAAGAGCCAGATAGGGCACCTCAAAGCGGTTGCTGGATTGGCTGGATTGGTCAAAGTGGTCCTTGCTCTCAAGCACAAGACATTGCCTCAGACGATCAATGTGGACAAGCCACCTTCACTGGTGGATGGGACACCGATTCAACAGTCCCCTTTGTACGTCAACACCATGAACCGTCCCTGGTTCACTCCGGTTGGGGTTCCGAGGAGAGCTGGCGTTTCCTCATTTGGTTTTGGAGGTGCGAACTACCATGCTGTGCTTGAAGAGTTTGAACCTGAACATGAGAGTGCTTACCGTTACAACAATCTTCCCCAAGTTGCTCTCCTTCATGCTGGGGATGTTGCAACTCTTGCTGCCACAGTTAGGGCAAAACTGGCATTGGCCACTGCTGAGCAAGAAGAGGCTAGAGTTGTGAAGAACGCTGATTACATTGCATACCATAGGTTCCTTGATGAATGTAAGTTGAGAGGAGCTGTTCCCCAAGCCCACGCAAGGGTTGGACTTCTGGTGAGGGACCTGTCCTCTCTCATTGCGGTTTTGGAAGCAGCTGCAGCCAAACTTGCTGGAGAAGAGTCAGCAACGGAATGGACGGTCTCAGTTGCCACTGGTGAGGCTGCATTCAGAGTTAGGGGTGTTGCCACAGAGGCCAATGTTGCTGCACTTTTCTCTGGCCAAGGAGCGCAGTACACTCACATGTTCTCAGATGTTGCCATGAACTGGCCTCCGTTCAGAGAGAGTGTTGCTGCGATGGACAGAGCGCAGAGAGAACGTTTTGGGAGGCCAGCCAAAAGAGTCTCCAGTGTTCTCTATCCGAGAAAACCTTATGGAGATGAGCCAAGGCAAGATCACAAAGAGATTTCTCAGACGCGTTACTCTCAGCCAGCAACCCTCGCTTGCTCTGTCGGTGCCTTTGACATCTTCAAAGCAGCTGGATTGGCTCCTTCTTTTGCAGCTGGACATTCCCTGGGAGAGTTTGCAGCTCTCTATGCAGCTGGTTCATTGGATCGTGATGCTGTGTTTGACTTGGTTTGCGCTAGGGCAAAGGCCATGTCTGATTTCACTGCTCAAGCCAGCTCCAGTGGAGGTGCTATGGCAGCGGTCATAGGAGCCAAGGCTGATCAGCTCAGCCTTGGTGGAGCACCTGATGTTTGGCTGGCCAATAGCAACAGTCCATCACAGACGGTGATCACGGGAACTGCTGAAGCAGTGGCAGCTGCATCTGACAAACTTCGTTGTAGTGGAAACTTCAGAGTGGTTCCTCTTGCTTGTGAAGCTGCCTTCCATTCACCACACATGCGTGGAGCAGAGCAGACATTTGCGTCTGCGCTTGCTCAAGCTCCAGTGTCCGCACCTGCAGCTGCCAGATTCTACAGCAACGTCACTGGTGGAGCTGCAGTCACCTCTCCTGCTGATGTCAAAACGAACCTTGGGAAACACATGACTTCTCCTGTGCAGTTT GTGCAGCAAGTCCGTGCCATGCACGCAGCTGGAGCAAGGGTGTTTGTTGAGTTCGGTCCCAAGCAAGTCCTTTCTCGTTTGGTCAAAGAGACCCTTGGGGAAGCTGGAGACGTGGTCACGGTGGCTGTCAACCCAGACTCAGCCAAGGATTCAGACACCCAGCTGAGACAAGCAGCTCTCACCTTGGCTGTGGCTGGTGTTCCACTCAAAGACTTTGACAGATGGCAGCTTCCCGATGCCACTCGTCTTGAGCCTGTCAAGAAAAAGAAAACAACCTTGAGGTTGAGTGCTGCCACCTATGTCTCTGCCAAGACCTTGAGGCAGAGGGAGGCTGTGCTCAATGATGGTTACACTGTGAGTGGTGCCACAGCGGTTGTCAAAGAAGTGGACACTGCAAACGAAGAGAGACTTGTCAGACAAGCACAAGACCTCCAGCGTCAGCTTGCTGAAGCAAGCACTGCAGCCCAAGCAGCTCAATCCAAGGTCGCTGAATTGGAGAGGACAATCCAAGACTTGGAGAGGAAGGTTCAACAGCAACAGCAAGAGAAAGGTGAGAACTCTGACTCCAATGCAGCTGCGGAAGTGCTTAGGAGACACAAGGAACTGCTCCAGAGGATGCTCCAAGATTGTGATGAGCAAGCAGTTCCCGTGGCAACAGTCGTTCCAACACCCACTTCTTCCCCTACACCAACATCCTCACCAGTTAGCGGAAACAGCAAGTCCACCAGAGGATCAGCCGACCTCCAAGCACTCCTGGCGAAAGCTGAGACGGTCGTGATGGCAGTTTTGGCTGCAAAGACTGGCTACGAGGCAGACATGGTGGAAGCAGATATGGATTTGGAGGCTGAGCTTGGGATTGATTCCATCAAAAGGGTGGAGATCCTGAGTGAAGTCCAAGGGCAGCTCGGAGTTGAAGCGAAGGATGTTGATGCCCTTTCACGTACAAGGACCGTCGGAGAGGTTGTGGATGCCATGAAGGCTGAGATTGTTGCTGCATCTGGTGGGTCAGCACCTGCTGTCCCCTCTGCACCAGCTGCATCAGCGGCTCCGACACCTGCTGCGAGTACCGCTCCGAGTGCTGATCTTCAGGCTCTCCTGTCTAAAGCCGAGACGGTTGTGATGGCTGTGCTCGCAGCGAAAACTGGTTACGAGGCTGACATGGTGGAAGCTGACATGGACCTTGAAGCGGAGTTGGGAATAGATAGCATCAAACGTGTTGAAATCTTGTCTGAGGTCCAAGGACAGTTGGGTGTGGAAGCCAAAGATGTCGATGCGCTTTCAAGAACCAGAACCGTCGGTGAGGTCGTGGACGCCATGAAGGCTGAGATTGTGGCTGCCTCTGCTGGCTCCGCTCCTGCTCCAGCAGTTCCTTCTGCACCTGCAGCGTCAGCGGCTCCAACTCCAGCTGCATCCACGGCTCCTTCTGCAGACCTCCAAGCCTTGCTGTCCAAAGCCGAAACAGTTGTGATGGCTGTCCTTGCTGCAAAGACTGGTTACGAAGCC GACATGGTTGAAGCTGACATGGATTTGGAAGCCGAACTTGGAATAGATTCCATCAAAAGAGTGGAGATACTCTCTGAGGTGCAAGGTCAGCTCGGAGTTGAAGCGAAAGACGTTGATGCCCTCAGTAGGACCAGAACTGTTGGGGAAGTTGTCGATGCGATGAAGGCTGAGATTGTCGCTGCCAGCGGTGGATCTGCACCTGCACCTGCGGTCCCGTCAGCTCCAGCAGCCAGCGCAGCTCCGACTCCTGCAGCTGCCACAGCACCGAGTGCGGATCTGCAGGCATTGCTTGCGAAGGCTGAAACAGTTGTCATGGCTGTCCTGGCTGCGAAAACTGGCTATGAGGCTGATATGGTGGAAGCCGACATGGACCTTGAGGCTGAATTGGGCATTGACAGCATCAAGCGTGTTGAGATTCTCAGTGAAGTCCAAGGACAGCTCGGAGTGGAGGCGAAGGATGTGGATGCCCTCTCAAGGACCAGAACAGTTGGTGAGGTCGTTGATGCGATGAAGGCAGAGATTGTTGCTGCCAGTGCTGGTTCTGCTCCCGCACCCGCTGTCCCAAGCGCACCAGCTGCCTCCGCCGCTCCCACACCAGCTGCCTCTACTGCACCAAGTGCGGACCTTCAAGCTCTCCTGAGCAAGGCTGAGACAGTTGTGATGGCAGTCCTTGCTGCGAAAACTGGCTATGAGGCAGACATGGTGGAAGCGGACATGGATCTGGAAGCTGAACTTGGAATTGACTCCATCAAACGTGTTGAAATCCTCTCTGAGGTTCAAGGTCAGCTTGGGGTGGAGGCCAAAGATGTTGATGCTCTTTCCAGAACAAGGACGGTGGGAGAGGTGGTTGATGCCATGAAGGCTGAGATAGTGGCAGCGTCAGGAGGGTCAGCACCTGCAGCTGCCGTTCCGTCCGCACCAGCAGCCTCTGCAGCTCCCACGCCAGCCACCGCTCCTAGTGCTGATTTGCAAGCCCTCCTTTCAAAAGCTGAAACTGTTGTCATGGCTGTTTTGGCTGCCAAGACTGGCTACGAGGCTGACATGGTTGAGGCTGACATGGACTTGGAAGCCGAGCTTGGGATTGATAGCATCAAGCGTGTGGAAATCCTTTCTGAGGTTCAAGGTCAGCTGGGTGTTGAGGCCAAAGATGTCGATGCGTTGTCAAGGACCAGAACGGTTGGAGAAGTGGTCGATGCCATGAAGGCTGAGATAGTTGCTGCCTCTGGAGGTTCAGCTCCTGCAGCTCCGTCAGCACCTGCCCTCCTTCCAACTTTGTTTGGTTCTGAGTGTGAAGATTTGAGCTTGACTTTCCCAGTCATCACAACCCTGCCTCTTCCTGCTGAACTTGTGCTGGCTGAAGGTGGAGCACGTCCTGTGGTTGTGGTTGACGATGGCTCTGCACTCACCAGTTCTCTTGTGTCCTCACTTGGTGATCGTGCTGTGCTCTTGCAAGTTCAGTCCAGCTCTGCCTGTTCACCCAGAAGCACCACGCACAAGTTGGTCACTGTT GCAGACCGTTCTGAAGCTGCATTGCAAGCTGCGCTCACATCAGTTGAAGCACAGTTTGGAAAAGTGGGAGGTTTTGTGTTCCAGTTTGGTGATGACGATGTCCAAGCGCAGCTTGGTTGGGCACTGCTTGCTGCCAAACATCTCAAAACGTCCTTGTCAGAACAGATAGAAGGTGGGAGGACCTTCTTTGTTGCCGTTGCGAGGTTGGATGGTCAGTTGGGGTTGTCTGGAAAGTCCACGACTGCCACTGTTGATCTCTCCAGAGCGCAGCAAGGCTCAGTCTTTGGACTCTGCAAAACCCTTGACTTGGAATGGCCTGCTGTTTTCTGCAGAGGAATCGACCTTGCAGCTGACTTGGATGCTGCACAAGCTGCCAGATGTCTTTTGGGTGAGCTTTCAGACCCAGATGTGGCAGTGAGGGAGTCTGGTTACTCCGCATCTGGGCAAAGATGCACCACAACCACAAAGTCTCTCACCACGGGAAAACCACATCAACCGATCTCTTCCAGTGATTTGTTCCTGGTCTCTGGAGGTGCTCGTGGAATCACACCTCTTTGTGTGAGAGAATTGGCACAGAGGGTGGGAGGTGGAACCTATGTCCTCATTGGGAGAAGTGAGCTGCCCACCACGGAACCTGCCTGGGCTGTTGGTGTTGAGTCAGGGAAACCTCTTGAGAAGGCTGCGCTGGCGTTCCTCAAAGCTGAGTTTGCAGCTGGAAGGGGAGCGAAGCCGACACCGATGCTCCACAAGAAACTTGTTGGAGCTGTTGTGGGAGCTAGAGAGGTCCGTGCGAGCCTGGCAGAGATAACTGCTCAAGGTGCCACAGCTGTCTATGAGTCCTGTGATGTCAGCTCTGCAGCCAAGGTTCGTGAAATGGTTGAGAGGGTTCAACAGCAAGGAGGGAGAAGGGTCAGCGGTGTGTTTCATGCAAGTGGTGTTTTGAGAGACAAGTTGGTTGAGAACAAGTCACTGGCTGATTTCAGTGCTGTGTATGACACAAAGGTTGGTGGACTCATCAACCTCCTTGCCTGTGTGGATCTTGCACAGCTTAGGCACCTGGTGCTCTTCAGCTCCCTTGCTGGGTTCCACGGCAATGTTGGTCAGAGTGACTATGCAATGGCCAATGAGGCTCTCAACAAGCTGGCTGCACATCTGTCTGCTGTGCATCCCCAACTTTGTGCGAGATCCATTTGCTTTGGTCCGTGGGATGGAGGGATGGTGACGCCTGCACTCAAGGCCAACTTCATCAGAATGGGCATTCAGATTATCCCTCGTCAAGGTGGAGCACAGACAGTTGCGAACATGCTTGTCAGCTCCAGCCCTGGTCAGCTCCTTGTTGGGAACTGGGGAGTGCCACCTGTGGTTCCAAGTGCCACTGAGCACACTGTTTTGCAGACTCTTCGTCAGAGCGACAACCCCTTCTTGGATTCACATGTCATTCAAGGGAGAAGGGTTTTGCCGATGACACTGGCTGTCGGCTACATGGCTCACCAAGCTCAGAGCATCTACGC TGGACATCAGCTTTGGGCAGTTGAGGATGCCCAGCTTTTCAAAGGCATAGCCATTGACAATGGAGCTGATGTTCCGGTTAGGGTTGAGTTGTCAAGGAGAAAGGAGGAACAAGAGGATGCTGGCAAGGTCAAGGTCAAGGTTCAAGTGCTTCTCAAATCTCAAGTCAATGGCAAGTCAGTCCCTGCTTACAAGGCGACTGTCGTGCTTTCCCCTGCTCCACGTCCCAGTGTCATCACCCGTGACTTTGATCTCACTCCTGACCCAGCCTGCACCGAACATGACCTCTATGATGGCAAGACGCTCTTCCACGGCAAAGCCTTCCAAGGAATAGAACAAGTTCTTTCTGCGACGCCAAAACAGCTCACTGCCAAATGCAGAAACCTTCCACTCACACCGGAGCAGCGTGGCCAGTTTGTGGTCAATCTCAGCCAGCAAGACCCATTCCAAGCTGACATTGCTTTCCAAGCCATGCTTGTTTGGGCTAGGATGTTGAGACAGTCTGCTGCGCTGCCCAATAACTGTGAAAGGTTTGATTTCTACAAACCGATGGCTCCTGGAGCAACTTACTATACCAGTGTCAAACTGGCTTCAGCTTCACCATTGGTGGATTCTGTGTGCAAATGCACTGTTGCCATGCACGATGAGCAAGGTGAAGTGTACTTCTCTGCGAGA

GCCAGTGTTGTCCTCAACAAGACACTCACATACTGA

SEQ ID NO:4示出了示例性PFA2蛋白的氨基酸序列：

MPCDNIAVVGMAVQYAGCKNQDEFWDTLMRKEINSSPISAERLGTRYRDLHFHPQRSKYADTFCNDRYGCVDASVDNEHDLLADLARRALLDAGINLDDASTTANLRDFGIVSGCLSFPMDNLQGELLNLYQVHVENRVGAQRFRDSRPWSERPRAVSPEASDPRVYSDPASFVANQLGLGPVRYSLDAACASALYCLKLASDHLLSRSADVMLCGATCFPDPFFILSGFSTFQAMPLGGPDDNPLSVPLRQGSQGLTPGEGGAIMVLKRLEDAVRDGDRIYGTLLGTSLSNAGCGLPLSPHLPSEKSCMEDLYTSVGIDPSEVQYVECHATGTPQGDVVEVEALRHCFRGNTDHPPRMGSTKGNFGHTLVAAGFAGMAKVLLSMQHGTIPPTPGVDRSNCIDPLVVDEAIPWPYSSAQARAGKPGDELKCASLSAFGFGGTNAHCVFREHRQIAATATASPVLPEVTPGPIAIIGMDATFGTLKGLDAFEQAIYKGTDGASDLPSKRWRFLGADTDFLTAMGLDAVPRGCYVRDVDVDYKRLRSPMIPEDVLRPQQLLAVATMDRALQDAGMATGGKVAVLVGLGTDTELYRHRARVTLKERLDPAAFSPEQVQEMMDYINDCGTSTSYTSYIGNLVATRVSSQWGFTGPSFTVTEGANSVYRCLELGKFLLDTHQVDAVVVAGVDLCATAENLYLKARRSAISRQDHPRANFEASADGYFAGEGSGALVLKRQADVGSDDKVYASVAGLTCA AQPAEAVSPLLLQVHNDDNEKRVVEMVELAADSGRHAPHLANSPLSAESQLEQVSKLLAHQVPGSVAIGSVRANVGDVGYASGAASLIKTALCLHNRYLPANPQWERPVAPVSEALFTCPRSRAWLKNPGESRLAAVASASESGSCFGVLLTDEYATHESSNRLSLDDAAPKLIAIRGDTVDDIMAKVNAELALLRAHAETGSATDDDPAAAVAFTAHRLRFLRLVGETVASHGATATLCLALLTTPEKLEKELELAAKGVPRSAKAGRNWMSPSGSAFAPTPVTSDRVAFMYGEGRSPYYGVGLDLHRLWPALHERINDKTAALWENGDSWLMPRAVDADSQRAVQTAFDADQIEMFRTGIFVSICLTDYARDVLGVQPKACFGLSLGEISMLFALSRRNCGLSDQLTQRLRTSPVWSTQLAVEFQALRKLWNVPADAPVESFWQGYLVRASRAEIEKAIGPDNRFVRLLIVNDSSSALIAGKPAECLRVLERLGGRLPPMPVKQGMIGHCPEVAPYTPGIAHIHEILEIPDSPVKMYTSVTNAELRGGSNSSITEFVQKLYTRIADFPGIVDKVSRDGHDVFVEVGPNNMRSAAVSDILGKAATPHVSVALDRPSESAWTQTLKSLALLTAHRVPLHNPTLFADLYHPTFLTAIDSAMQEPPPKPNRFLRSVEVNGYFCPDGISKQVAAASAKPSTHCMVRLHPAKAVVVAAAGAVVADSTPVVKAKQTSSSLLVGDDAFLRCYDVDWPLYMGAMAEGISSVDLVVAAAEARMLASFGAARLPMDQVELQIREIQQRTSNAFAVNLMPGPDEAATVDALLRTGVSIVEASGYTGALSADLVRYRVTGLRRTSCGASVSATHRVVAKVSRTEVAEHFLRPAPAAVLEALVAAKQITPEQAALASRVAMADDVAVEADSGGHTDNRPIHVLLPLVVAQRNRWRHLVDTPVRVGAGGGIACPRAALLAFSLGAAFVVTGSVNQLAREAGTSDAVRLLLATATYSDVAMAPGGVQVLKKQTMFAARATMLAQLQAKFGSFDAVPEPQLRKLERSVFKQSVADVWAAAREKFGVDATAASPQERMALCVRWYMSQSSRWATEATSARKADYQIWCGPAIGSFNDFVRGTKLDATAGTGEFPRVVDINQHILLGASHYRRVQQQ

QQDDDVEYIIV

SEQ ID NO:5示出了示例性PFA2基因的核苷酸序列，在本文中稱為PFA2v1，分離自破囊壺菌——裂殖壺菌屬物種(如ATCC登錄號(hào)PTA-9695代表的)：

ATGCCGTGCGATAACATTGCGGTCGTGGGCATGGCGGTGCAGTATGCCGGATGCAAGAACCAGGACGAGTTCTGGGATACGCTGATGCGTAAGGAGATCAACTCGAGCCCGATCTCGGCGGAGCGCCTCGGTACGCGCTACCGCGACCTCCACTTCCACCCGCAGCGCAGCAAGTACGCCGACACCTTCTGCAACGATCGCTACGGCTGCGTCGATGCCAGCGTCGACAACGAGCACGACCTCC TCGCCGACCTGGCCCGGCGCGCCCTGCTCGACGCCGGAATTAACCTCGACGACGCCAGCACCACCGCCAACCTACGCGACTTCGGCATCGTGAGCGGCTGCCTGTCGTTCCCCATGGACAATCTGCAGGGCGAGCTGCTCAATCTGTACCAAGTGCATGTGGAGAACCGCGTGGGCGCCCAGCGCTTCCGCGACTCGCGCCCCTGGTCGGAGCGCCCGCGCGCTGTCTCGCCCGAGGCCAGCGACCCGCGCGTGTACTCCGACCCGGCGTCCTTCGTGGCCAACCAGCTCGGCCTGGGGCCCGTGCGCTACAGCCTCGATGCAGCCTGCGCGTCGGCGCTGTACTGCCTCAAGCTGGCGTCCGACCACTTGCTCTCGCGCAGCGCGGACGTGATGCTGTGCGGCGCCACATGCTTTCCGGACCCGTTCTTCATTCTCTCGGGGTTCTCCACCTTCCAGGCGATGCCGCTGGGCGGACCGGACGATAACCCACTGTCCGTGCCGCTGCGGCAGGGCAGCCAGGGCCTGACGCCCGGAGAGGGCGGCGCCATCATGGTGCTGAAGCGCCTCGAGGACGCCGTGCGCGACGGCGACCGCATCTACGGCACCTTGCTCGGCACGAGTCTGAGCAACGCCGGGTGCGGCCTGCCGCTGAGCCCGCACCTGCCGAGCGAGAAGTCGTGCATGGAGGACCTGTACACGAGCGTCGGCATCGACCCAAGCGAGGTGCAGTACGTGGAGTGCCACGCCACGGGCACTCCGCAGGGCGACGTCGTGGAGGTAGAGGCGCTGCGCCACTGCTTTCGAGGTAACACGGACCACCCGCCGCGCATGGGCTCCACCAAGGGCAACTTTGGCCACACTCTCGTGGCGGCCGGGTTCGCAGGCATGGCCAAGGTGCTGCTGTCGATGCAGCACGGCACGATCCCGCCCACGCCCGGTGTCGACCGCTCCAACTGCATCGACCCGCTCGTCGTGGACGAGGCCATCCCTTGGCCGTACTCGTCGGCGCAGGCGCGGGCAGGCAAACCAGGCGATGAGCTCAAGTGCGCCTCGCTCTCCGCCTTTGGCTTTGGTGGAACCAACGCGCACTGTGTCTTCCGTGAGCACCGCCAAATTGCTGCTACTGCGACAGCCTCGCCGGTGCTTCCCGAGGTGACTCCTGGACCGATTGCCATCATCGGGATGGACGCGACGTTTGGTACCCTCAAGGGCCTGGACGCGTTTGAGCAGGCCATCTACAAGGGCACGGACGGCGCCAGCGACCTGCCGAGCAAGCGCTGGCGGTTCCTGGGCGCCGACACGGACTTCTTGACCGCCATGGGCCTCGACGCCGTGCCGCGCGGGTGCTACGTGCGCGACGTGGACGTGGACTACAAGCGGCTGCGGTCGCCGATGATCCCTGAGGACGTCCTGCGCCCGCAACAGCTGCTGGCGGTGGCTACGATGGACCGCGCGCTGCAGGACGCTGGAATGGCGACGGGAGGCAAGGTGGCGGTGCT GGTGGGGCTCGGCACGGACACCGAGCTGTACCGGCACCGCGCGCGCGTGACACTCAAGGAGCGGCTCGACCCGGCCGCGTTCTCGCCCGAGCAGGTGCAGGAGATGATGGACTACATCAACGACTGCGGCACCTCGACGTCGTACACGTCGTACATCGGCAACCTCGTGGCCACGCGCGTGTCCTCGCAGTGGGGCTTTACGGGCCCGTCCTTCACCGTCACCGAAGGCGCAAACTCGGTCTACCGCTGCCTCGAGCTGGGCAAGTTCCTGCTCGACACGCACCAGGTGGACGCCGTCGTGGTGGCCGGCGTCGACCTCTGTGCCACCGCCGAGAACCTTTACCTCAAGGCGCGCCGCTCCGCCATCAGCCGACAGGACCACCCTCGCGCCAACTTTGAGGCCAGCGCCGACGGGTACTTTGCCGGCGAGGGCAGCGGCGCCCTGGTCCTCAAGCGCCAGGCCGACGTTGGCTCAGACGACAAGGTCTACGCCAGTGTCGCGGGCCTCACGTGCGCCGCGCAGCCCGCTGAAGCCGTGTCGCCGCTACTACTCCAAGTCCACAACGACGACAACGAGAAGAGGGTGGTGGAGATGGTGGAGCTCGCCGCCGACTCGGGTCGCCATGCGCCGCACTTGGCCAACTCGCCGCTGAGCGCCGAGTCGCAGCTGGAGCAAGTGTCCAAGTTGCTCGCGCACCAGGTGCCGGGCTCGGTGGCCATCGGCAGCGTGCGCGCCAACGTGGGAGACGTCGGGTACGCCTCGGGCGCCGCGAGCCTCATCAAGACGGCGCTGTGCCTCCACAACCGCTACCTCCCGGCCAACCCGCAGTGGGAGCGGCCGGTGGCGCCGGTCTCCGAGGCGCTGTTTACTTGCCCGCGCTCGCGTGCCTGGCTGAAGAACCCGGGCGAGTCGCGACTGGCGGCTGTCGCCAGTGCCTCCGAGAGCGGGTCCTGCTTTGGCGTGCTCCTCACAGACGAGTACGCCACTCATGAGAGCAGCAACCGCCTCTCGCTGGATGACGCCGCCCCCAAGCTCATCGCGATCCGTGGCGACACCGTTGACGATATCATGGCCAAGGTCAACGCCGAGCTGGCGCTCCTCCGAGCGCACGCCGAAACCGGGTCTGCTACTGACGACGACCCAGCTGCTGCTGTCGCTTTCACTGCTCATCGCTTGCGCTTTTTGCGGCTCGTAGGGGAGACGGTGGCTAGTCACGGTGCCACGGCGACCTTGTGTTTGGCCCTGCTGACAACGCCGGAGAAGCTGGAGAAGGAGTTGGAGCTGGCAGCCAAGGGTGTACCGCGAAGCGCCAAGGCCGGGCGCAACTGGATGTCGCCATCGGGCAGCGCCTTTGCGCCGACACCTGTGACCAGCGACCGCGTCGCGTTCATGTACGGCGAGGGCCGCAGCCCCTACTACGGCGTCGGGCTCGACCTGCACCGCCTGTGGCCGGCTTTGCACGAGCGCATCAACGACAAGACCGCGGCGCTGTGGGA GAACGGCGACTCGTGGCTCATGCCGCGCGCGGTGGATGCCGACTCGCAGCGCGCCGTGCAGACGGCCTTTGACGCGGACCAGATCGAGATGTTCCGCACGGGCATCTTCGTGTCCATCTGCCTCACCGACTACGCGCGCGACGTGCTCGGGGTGCAGCCCAAGGCGTGCTTCGGCCTCAGCCTCGGCGAGATCTCCATGCTCTTTGCGCTGTCGCGACGCAACTGCGGCCTGTCGGACCAGCTCACGCAGCGCCTACGCACCTCGCCGGTGTGGTCGACACAGCTGGCGGTGGAGTTCCAGGCCTTGCGCAAGCTATGGAACGTGCCGGCGGACGCCCCCGTGGAGTCCTTCTGGCAGGGCTACTTGGTTCGCGCCAGCCGCGCCGAAATCGAGAAGGCGATCGGGCCCGACAACCGCTTCGTGCGCCTGCTGATCGTCAACGACTCGAGCAGCGCGCTGATCGCCGGCAAACCTGCCGAGTGTCTGCGCGTGCTGGAGCGCCTGGGCGGGCGGTTGCCGCCGATGCCCGTCAAGCAAGGCATGATTGGGCACTGCCCCGAAGTGGCGCCCTACACGCCGGGCATCGCGCACATCCACGAGATTTTGGAGATTCCGGACAGCCCCGTCAAGATGTACACCTCGGTCACCAACGCCGAGCTGCGCGGGGGCAGCAACAGCAGCATCACCGAGTTCGTGCAGAAGTTGTACACGCGCATCGCCGACTTTCCGGGCATCGTCGACAAGGTCAGCCGTGACGGCCACGATGTCTTCGTCGAGGTGGGGCCGAACAACATGCGCTCCGCCGCGGTCAGTGACATTCTTGGCAAGGCTGCCACCCCGCATGTCTCCGTGGCGCTGGACCGCCCCAGTGAGTCGGCGTGGACGCAGACCCTCAAGTCGCTGGCGCTGCTGACCGCCCACCGCGTGCCCCTGCACAACCCGACTCTGTTTGCGGACCTGTACCACCCCACGTTCCTGACGGCTATCGACTCTGCGATGCAGGAGCCCCCGCCCAAGCCCAACCGCTTCCTTCGCAGCGTAGAGGTCAACGGGTACTTTTGCCCCGACGGCATCAGCAAGCAGGTTGCTGCTGCAAGTGCCAAACCCTCGACGCATTGCATGGTTCGTTTGCACCCAGCCAAGGCAGTTGTGGTTGCTGCTGCTGGTGCTGTGGTTGCTGATTCGACGCCCGTGGTCAAGGCCAAGCAGACGTCGTCGTCGTTGTTGGTTGGGGATGACGCCTTTCTGCGCTGCTACGACGTGGACTGGCCGCTCTACATGGGCGCCATGGCGGAAGGCATCTCGTCGGTAGACCTGGTGGTCGCTGCCGCCGAGGCCCGCATGCTGGCATCATTCGGAGCGGCCCGCTTGCCTATGGACCAGGTGGAACTCCAGATCCGTGAGATCCAGCAACGCACCTCCAACGCCTTTGCTGTCAACCTGATGCCGGGTCCTGACGAGGCCGCGACGGTGGACGCGCTGCTGCGCACGGGCGTCTCAATC GTCGAGGCATCGGGCTACACCGGCGCGCTCTCTGCAGACCTGGTGCGCTACCGTGTCACGGGTCTGCGACGAACTAGTTGCGGTGCTTCTGTGTCGGCGACTCACCGTGTGGTCGCCAAGGTGTCGCGCACCGAGGTGGCCGAGCACTTTCTGCGCCCGGCGCCGGCCGCCGTACTAGAGGCTTTGGTCGCCGCCAAACAGATTACGCCCGAGCAGGCCGCGCTGGCCAGCCGCGTCGCCATGGCCGACGACGTCGCGGTGGAGGCCGACTCGGGCGGGCACACCGACAACCGACCGATCCACGTGCTGCTGCCGCTCGTGGTGGCGCAGCGCAACCGCTGGCGCCACCTGGTGGACACGCCAGTGCGCGTCGGCGCCGGCGGCGGGATCGCCTGTCCGCGCGCCGCGCTGCTCGCCTTTTCCCTGGGCGCCGCCTTTGTGGTCACCGGGTCCGTCAACCAACTGGCCCGCGAGGCTGGCACCAGCGACGCGGTCCGACTACTGCTGGCGACGGCCACCTACTCGGACGTGGCCATGGCGCCGGGCGGCGTCCAGGTGCTCAAGAAGCAGACCATGTTCGCCGCGCGGGCCACGATGCTCGCCCAGCTGCAGGCCAAGTTCGGCTCCTTTGACGCCGTGCCGGAGCCGCAGCTGCGCAAGCTCGAGCGCTCCGTGTTCAAGCAGTCCGTGGCGGACGTGTGGGCTGCTGCACGCGAAAAGTTTGGTGTCGACGCTACCGCTGCAAGTCCGCAGGAGAGGATGGCGCTCTGTGTGCGCTGGTACATGTCGCAGTCGTCGCGATGGGCTACCGAGGCGACGTCCGCGCGCAAGGCGGACTACCAGATCTGGTGCGGCCCCGCCATCGGCAGCTTCAACGACTTCGTTCGCGGCACCAAGCTGGACGCGACCGCTGGCACCGGCGAGTTTCCGCGCGTCGTGGACATCAACCAGCACATCCTCCTCGGAGCCTCGCACTACCGCCGCGTGCAGCAACAA

CAACAGGACGACGACGTAGAATACATCATCGTATAA

SEQ ID NO:6示出了示例性的植物優(yōu)化的PFA2基因的核苷酸序列，在本文中稱為PFA2 v2：

ATGCCGTGTGACAACATTGCTGTGGTTGGAATGGCAGTTCAGTATGCTGGATGCAAGAACCAGGACGAGTTCTGGGACACACTGATGAGGAAGGAGATCAACAGCTCACCGATCTCAGCGGAGAGGCTTGGGACAAGATACAGAGACCTCCACTTCCATCCTCAGAGGAGCAAGTATGCAGACACCTTCTGCAATGACAGATATGGTTGTGTTGATGCTTCTGTTGACAATGAGCATGACTTGCTTGCTGACCTTGCCAGACGTGCTTTGCTTGATGCTGGGATCAACTTGGATGACGCCAGCACCACTGCCAACCTTCGTGACTTTGGGATTGTGAGTGGAT GCCTCTCCTTCCCGATGGACAATCTGCAAGGTGAGCTTTTGAATCTCTATCAAGTCCACGTTGAGAACCGTGTGGGTGCCCAGAGGTTCAGAGATTCAAGACCCTGGTCAGAAAGACCAAGAGCTGTGTCCCCTGAAGCCAGTGACCCGAGGGTCTACAGCGACCCTGCTTCCTTTGTGGCCAACCAGCTTGGTCTTGGTCCTGTCAGATACAGCCTTGATGCAGCTTGTGCGAGTGCGCTGTACTGCCTCAAGTTGGCTTCTGATCACTTGCTCTCCCGTTCTGCAGATGTCATGCTGTGTGGTGCCACATGCTTCCCAGACCCGTTTTTCATTCTCTCTGGGTTCTCCACATTCCAAGCGATGCCATTGGGTGGACCAGATGACAACCCACTCTCTGTGCCACTCCGTCAAGGCAGCCAAGGACTCACACCTGGAGAAGGTGGAGCCATCATGGTTCTGAAGCGTTTGGAAGATGCTGTGAGGGATGGTGATAGGATCTATGGCACCTTGCTTGGGACAAGTCTCAGCAATGCTGGTTGTGGTTTGCCACTTTCACCTCACCTGCCGTCTGAGAAAAGCTGCATGGAGGATTTGTACACGTCAGTTGGCATAGATCCATCTGAGGTTCAGTATGTCGAGTGTCATGCCACCGGAACTCCGCAAGGAGATGTGGTTGAAGTTGAGGCTCTGAGACATTGCTTCAGAGGCAACACTGACCACCCACCGAGGATGGGTTCCACCAAAGGAAACTTTGGTCACACCTTGGTTGCAGCTGGGTTTGCTGGAATGGCCAAAGTGTTGCTTTCCATGCAGCATGGCACGATCCCACCCACGCCTGGTGTTGATAGGAGCAACTGCATAGATCCGCTGGTCGTTGATGAGGCCATACCCTGGCCTTACAGCTCAGCTCAAGCGAGAGCTGGCAAACCTGGAGATGAATTGAAGTGTGCTTCCCTCTCAGCCTTTGGATTTGGTGGAACAAATGCTCATTGTGTGTTCAGAGAACACAGACAGATTGCTGCCACTGCGACAGCGTCTCCGGTCCTTCCTGAAGTCACCCCTGGACCCATTGCAATCATTGGGATGGATGCGACGTTTGGCACCCTCAAAGGACTTGATGCGTTTGAACAAGCGATCTACAAAGGCACGGATGGAGCATCTGATCTGCCATCCAAGAGATGGAGGTTCCTTGGTGCTGACACAGATTTCTTGACTGCAATGGGTCTGGATGCAGTCCCGAGAGGGTGCTATGTGAGGGATGTTGATGTGGACTACAAAAGACTCAGAAGTCCCATGATCCCTGAAGATGTCCTCAGACCCCAACAGCTTCTGGCAGTTGCCACGATGGATAGGGCACTTCAAGATGCTGGCATGGCCACGGGTGGAAAAGTTGCTGTCCTGGTGGGGTTGGGCACTGACACTGAGCTTTACAGACACCGTGCAAGGGTGACACTCAAGGAAAGGCTTGACCCAGCAGCTTTCTCCCCTGAACAAGTTCAAGAAATGATGGATTA CATCAATGATTGTGGAACCTCAACCAGCTACACTTCTTACATTGGGAATCTTGTGGCCACCAGAGTTTCCTCACAGTGGGGATTCACTGGTCCTTCTTTCACGGTCACTGAAGGTGCAAACTCAGTCTATCGTTGCCTTGAGCTGGGAAAGTTCCTTTTGGACACCCACCAAGTGGATGCAGTTGTGGTTGCTGGAGTTGATCTCTGTGCAACTGCTGAGAACCTTTACCTCAAGGCAAGAAGGTCTGCCATAAGCAGACAAGACCATCCACGTGCCAACTTTGAGGCTTCTGCTGATGGATACTTTGCTGGAGAGGGCAGTGGTGCTCTGGTCTTGAAGAGGCAAGCTGATGTTGGCTCAGATGACAAGGTCTATGCCAGTGTTGCTGGCCTCACATGTGCAGCGCAGCCTGCTGAAGCAGTTTCTCCTCTTCTCCTTCAAGTTCACAATGATGACAATGAGAAAAGGGTTGTGGAGATGGTGGAACTCGCAGCTGACTCTGGTCGTCATGCTCCCCACTTGGCCAACTCTCCTTTGAGTGCTGAATCACAGCTTGAGCAAGTGTCTAAACTCTTGGCTCATCAAGTCCCTGGTTCAGTCGCGATTGGAAGTGTTCGTGCCAATGTTGGAGATGTTGGATATGCGAGTGGTGCAGCTTCTCTCATAAAGACTGCGCTTTGCCTCCACAACCGTTACTTGCCTGCAAACCCACAGTGGGAAAGACCTGTGGCTCCAGTCTCAGAGGCTCTTTTCACCTGTCCAAGGTCCCGTGCTTGGCTCAAGAACCCTGGTGAGTCCAGACTTGCTGCAGTGGCCAGTGCTTCTGAGAGTGGGTCTTGCTTTGGAGTGCTTCTCACAGATGAGTATGCCACACATGAGTCCAGCAACAGATTGTCATTGGATGACGCTGCACCCAAACTCATAGCGATTCGTGGAGACACTGTTGATGACATCATGGCAAAAGTCAATGCTGAACTTGCGTTGCTCCGTGCTCATGCAGAAACTGGGTCTGCCACTGACGATGACCCAGCTGCAGCTGTTGCTTTCACTGCTCATCGTTTGAGGTTCTTGAGGCTTGTTGGTGAAACAGTTGCCAGTCACGGTGCCACAGCGACCTTGTGTTTGGCTCTGCTCACAACTCCAGAAAAGCTGGAGAAAGAATTGGAGTTGGCAGCCAAGGGTGTTCCAAGATCAGCCAAGGCTGGCAGAAACTGGATGTCACCATCTGGTTCTGCTTTTGCACCAACACCTGTCACCAGTGATCGTGTTGCGTTCATGTATGGTGAAGGGAGGTCTCCCTACTATGGTGTTGGGTTGGACCTTCACAGACTCTGGCCTGCTTTGCATGAGAGGATCAATGACAAGACAGCTGCACTTTGGGAGAATGGAGACTCCTGGCTCATGCCCAGAGCGGTTGATGCTGACTCTCAGAGGGCTGTCCAGACGGCTTTTGATGCTGACCAGATAGAGATGTTTAGGACGGGAATCTTTGTTTCCATTTGCCTCACAGACTATGCTCGT GATGTCCTTGGAGTCCAACCCAAGGCTTGCTTTGGACTCTCCCTTGGAGAAATCTCCATGCTCTTTGCACTTTCAAGGAGAAACTGTGGACTTTCTGACCAGCTCACTCAGAGGCTCAGAACCTCTCCGGTCTGGAGCACACAGCTTGCTGTGGAGTTCCAAGCCTTGAGGAAACTTTGGAATGTCCCTGCTGATGCTCCAGTTGAGTCCTTCTGGCAAGGCTACTTGGTTCGTGCCAGCAGAGCAGAGATTGAAAAGGCCATTGGACCGGACAACAGATTTGTTCGTTTGCTCATTGTCAACGACTCCAGCAGTGCCCTCATTGCTGGCAAACCTGCTGAGTGTCTGAGGGTGCTTGAGCGTCTTGGAGGTCGTTTGCCACCCATGCCAGTCAAGCAAGGCATGATTGGGCACTGCCCAGAAGTGGCTCCCTATACTCCTGGAATAGCTCACATCCACGAAATCTTGGAGATTCCTGACAGCCCTGTCAAGATGTATACCTCAGTCACCAATGCTGAGCTGAGAGGAGGCAGCAACTCTTCCATCACAGAGTTCGTTCAGAAGTTGTACACCAGAATAGCGGATTTCCCTGGCATTGTTGACAAGGTCAGCCGTGATGGCCATGATGTTTTCGTGGAAGTTGGTCCGAATAACATGAGGTCAGCAGCTGTCAGTGACATTCTTGGGAAGGCTGCAACTCCTCATGTCAGTGTGGCTCTTGATCGTCCAAGTGAGTCAGCTTGGACACAGACACTCAAATCTCTTGCCCTGCTCACTGCCCACAGAGTGCCTCTTCACAACCCGACTCTCTTTGCGGATCTTTACCACCCAACCTTCCTCACAGCCATAGATTCTGCAATGCAAGAACCACCTCCCAAGCCCAACAGATTCCTGAGGTCTGTTGAAGTCAATGGTTACTTCTGCCCTGATGGCATAAGCAAACAAGTTGCAGCTGCAAGTGCCAAACCCAGCACACATTGCATGGTTCGTCTCCATCCAGCCAAAGCTGTTGTGGTTGCAGCTGCCGGAGCTGTGGTTGCTGATTCAACACCGGTTGTCAAAGCCAAGCAGACTTCCTCATCTTTGCTTGTTGGAGACGATGCCTTCCTCAGATGCTATGATGTGGATTGGCCTCTCTACATGGGAGCGATGGCTGAAGGAATCTCCTCTGTTGACCTTGTGGTTGCAGCTGCAGAAGCTAGGATGCTTGCATCATTTGGAGCAGCGAGGCTTCCGATGGATCAAGTTGAACTCCAGATCCGTGAGATCCAACAGAGAACCTCCAATGCCTTTGCTGTCAACCTCATGCCTGGTCCTGATGAAGCTGCAACGGTGGATGCCCTTCTGAGAACGGGAGTCAGCATTGTGGAGGCGTCTGGTTACACGGGTGCGCTCTCTGCGGATCTGGTGAGATACCGTGTGACCGGTCTCAGAAGGACCTCCTGTGGTGCTTCTGTGTCAGCGACTCACCGTGTTGTGGCCAAAGTTTCAAGAACTGAGGTGGCTGAACATTTCCTG AGACCAGCACCTGCAGCTGTTCTTGAGGCTTTGGTGGCAGCCAAACAAATCACTCCTGAGCAAGCTGCGCTTGCCAGCAGAGTCGCGATGGCTGACGATGTCGCGGTGGAGGCAGATTCTGGAGGGCACACTGACAACCGTCCAATCCATGTGCTCCTTCCTTTGGTTGTGGCTCAGAGGAACAGATGGAGGCATCTGGTTGACACGCCAGTGCGTGTGGGAGCTGGAGGTGGGATAGCATGTCCGAGAGCAGCGTTGCTTGCCTTCTCCTTGGGTGCAGCCTTTGTGGTCACTGGAAGTGTCAACCAGCTTGCTCGTGAAGCTGGGACCTCTGATGCAGTCAGACTCCTTTTGGCGACTGCCACCTATAGTGATGTGGCGATGGCTCCTGGTGGAGTCCAAGTGTTGAAGAAACAAACCATGTTCGCTGCGAGAGCAACGATGTTGGCTCAGCTCCAAGCCAAGTTTGGTTCCTTTGATGCTGTGCCAGAACCGCAACTGAGAAAACTGGAGAGATCAGTGTTCAAGCAGAGTGTTGCTGATGTTTGGGCAGCTGCAAGGGAAAAGTTTGGGGTTGATGCCACGGCTGCAAGTCCGCAAGAGAGGATGGCTCTCTGTGTCAGATGGTACATGTCTCAAAGCTCACGTTGGGCAACAGAGGCCACTTCAGCAAGGAAAGCGGACTATCAGATTTGGTGTGGTCCTGCAATAGGCAGCTTCAATGACTTCGTCAGAGGCACCAAACTTGATGCCACGGCTGGGACTGGTGAGTTCCCGAGAGTTGTGGACATCAACCAGCACATCTTGCTGGGAGCCTCTCATTACAGAAGGGTTCAACAGCAA

CAGCAAGACGATGACGTTGAGTACATCATTGTTTGA

SEQ ID NO:7示出了示例性PFA3蛋白的氨基酸序列：

MTSSKKTPVWEMSKEELLDGKTVVFDYNELLEFAEGDVGQVFGPEFDIIDKYRRRVRLPAREYLLVSRVTLMDAEVNNFRVGSRMVTEYDVPVNGELSEGGDVPWAVLVESGQCDLMLISYMGIDFQCKGDRVYRLLNTSLTFFGVAHEGETLVYDIRVTGFAKGAGGEISMFFFEYDCFVDGRLLIEMRDGCAGFFTDAELAAGKGVLKTKAELAARAQIQKQDIAPFAPAPCSHKTSLDAREMRLLVDRQWARVFGSGMAGIDYKLCARKMLMIDRVTHLDPRGGAHGLGLLIGEKVLERDHWYFPCHFVRDEVMAGSLVSDGCSQLLKVYMLWLGLHTTVGAFDFRPVSGHANKVRCRGQISPHKGKLVYVMEIKEMGFDAKTGDPFAIADVDIIDVNFEEGQAFAGVEDLHSYGQGDLRKKIVVDFKGIALSLQKRKEQQKESMTVTTTTTTTSRVIAPPSGCLKGDPTAPTSVTWHPMAEGNGGPGPTPSFSPSAYPPRAVCFSPFPNNPLDNDHTPGQMPLTWFNMSEFMCGKVSNCLGPEFARFD ASKTSRSPAFDLALVTRVTSVADMEHGPFYNVDVNPGQGTMVGEFDCPADAWFFGASSRDDHMPYSILMEIALQTSGVLTSVLKAPLTMDKDDILFRNLDADAELVGDAMPDVRGKTIRNFTKCTGYSMLGKMGIHRFTFELSVDGAVFYKGSTSFGWFVPEVFESQTGLDNGKPRLPWYRENNVAVDTLSAPASASSAQGQLQLQRRGSQAQFLDTIHLAGSGAGVHGQGYAHGEKAVNKQDWFFSCHFWFDPVMPGSLGIESMFQLVEAWCVKQGLAARHGIAHPVFAHAPGATSWKYRGQLTPKNDRMDSEVHIKSVAAFSSWVDVVADGFLFVDGLRVYSADNLRVRIQTGAGHVEEQEVAAKATTKNSSIADVDVADLQALKQALLTLERPLQLDAGSEVPACAVSDLGDRGFMETYGVVAPLYSGAMAKGIASADLVIAMGQRKMLGSFGAGGLPMHVVRAGIEKIQAALPAGPYAVNLIHSPFDANLEKGNVDLFLEKGVRVVEASAFMELTPQVVRYRATGLSRDARGGSVRTAHKIIGKVSRTELAEMFIRPAPQAILDKLVASGEITPEQAALALEVPMADDIAVEADSGGHTDNRPIHVILPLILSLRNRLQRELKYPARHRVRVGAGGGIGCPQAALGAFHMGAAFVVTGTVNQLSRQAGTCDNVRRQLSRATYSDITMAPAADMFEQGVELQVLKKGTMFPSRAKKLFELFHKYDSFEAMPADELARVEKRIFSKSLAEVWAETKDFYITRLNNPEKIRKAENEDPKLKMSLCFRWYLGLSSFWANNGIADRTMDYQIWCGPAIGAFNDFIADSYLDVAVS

GEFPDVVQINLQILSGAAYLQRLLSVKLAPRIDVDTEDDLFTYRPDHAL

SEQ ID NO:8示出了示例性PFA3基因的核苷酸序列，在本文中被稱為PFA3 v1，分離自破囊壺菌———裂殖壺菌屬物種(表示為ATCC登錄號(hào)PTA-9695)：

ATGACATCATCGAAGAAGACTCCCGTGTGGGAGATGAGCAAGGAGGAGCTGCTGGACGGCAAGACGGTGGTCTTCGACTACAACGAGCTGCTCGAATTCGCCGAGGGCGACGTGGGCCAAGTGTTCGGACCCGAGTTCGACATCATCGACAAGTACCGGCGTCGCGTGCGGCTGCCGGCGCGCGAGTACCTGCTCGTGTCGCGCGTGACGCTGATGGACGCCGAGGTGAACAACTTCCGCGTCGGGTCGCGCATGGTGACCGAGTACGACGTGCCCGTGAACGGGGAGCTGTCGGAGGGCGGGGACGTGCCGTGGGCGGTGCTGGTGGAGTCGGGGCAGTGCGACCTGATGCTCATCTCGTACATGGGCATCGACTTCCAGTGCAAGGGCGACCGCGTGTACCGCCTGCTCAACACATCGCTCACCTTCTTCGGGGTGGCGCACGAGGGCGAGACGCTGGTGTACGACATCCGCGTCACGGG GTTCGCCAAGGGCGCGGGCGGGGAGATCTCGATGTTCTTCTTCGAGTACGACTGCTTCGTGGACGGCCGCCTGCTGATCGAGATGCGCGACGGGTGCGCCGGGTTCTTCACGGACGCCGAGCTGGCCGCCGGCAAGGGCGTGCTTAAGACCAAGGCGGAGCTGGCGGCGCGCGCGCAGATCCAGAAGCAGGACATCGCGCCCTTTGCGCCGGCGCCGTGCTCGCACAAGACCTCGCTGGACGCGCGCGAGATGCGGCTGCTCGTGGACCGCCAGTGGGCGCGCGTCTTCGGCAGCGGCATGGCGGGCATCGACTACAAGTTGTGCGCTCGCAAGATGCTCATGATCGACCGCGTCACGCACCTCGACCCGCGCGGCGGCGCGCACGGCCTCGGGCTGCTGATCGGGGAGAAGGTGCTGGAGCGCGACCACTGGTACTTCCCCTGCCACTTTGTGCGCGACGAGGTGATGGCCGGGTCGCTGGTCAGCGACGGCTGCTCGCAGCTCCTCAAGGTGTACATGCTGTGGCTCGGCCTGCACACGACCGTGGGCGCGTTCGACTTTCGTCCCGTGAGCGGGCACGCCAACAAGGTGCGGTGCCGCGGGCAGATCTCACCGCACAAGGGCAAGCTCGTGTACGTGATGGAGATCAAGGAAATGGGCTTTGACGCGAAGACGGGCGATCCGTTTGCGATCGCGGACGTGGACATCATCGACGTCAACTTCGAGGAGGGACAGGCGTTTGCGGGAGTGGAAGACCTGCACAGCTACGGCCAGGGCGACCTCCGCAAGAAGATCGTCGTCGACTTCAAGGGCATCGCGCTCTCCCTGCAGAAGCGGAAGGAGCAGCAGAAGGAAAGCATGACCGTGACTACGACGACGACGACGACGAGCCGGGTGATTGCGCCGCCCAGCGGGTGCCTCAAGGGCGACCCGACGGCGCCGACGAGCGTGACGTGGCACCCGATGGCGGAGGGCAACGGCGGGCCCGGACCGACGCCGTCGTTCTCGCCGTCCGCGTACCCGCCGCGGGCGGTGTGCTTCTCGCCGTTCCCCAACAACCCGCTTGACAACGACCACACGCCGGGCCAGATGCCGTTGACCTGGTTCAACATGTCCGAATTCATGTGCGGCAAAGTGTCCAACTGCCTGGGCCCCGAGTTTGCGCGCTTCGACGCGAGCAAGACGAGCCGCAGCCCGGCCTTTGACCTGGCGCTCGTGACGCGGGTGACGAGCGTGGCGGACATGGAGCACGGGCCGTTCTACAACGTGGACGTCAACCCGGGCCAGGGCACGATGGTGGGCGAGTTCGACTGTCCCGCGGACGCGTGGTTCTTCGGCGCCTCGAGCCGCGACGACCACATGCCGTACTCGATCCTGATGGAGATCGCGCTGCAGACGTCGGGCGTCCTCACCTCGGTGCTCAAGGCGCCGCTGACGATGGACAAGGACGACATCCTCTTCCGCAACCTCGACGCAGACGCCGAGCTCGTGG GCGACGCCATGCCGGACGTGCGCGGCAAGACGATCCGCAACTTCACCAAGTGCACAGGCTACAGCATGCTCGGCAAGATGGGCATCCACCGCTTCACCTTTGAGCTCAGCGTCGACGGCGCCGTCTTCTACAAGGGCAGCACCTCGTTTGGCTGGTTCGTCCCCGAGGTCTTCGAGTCGCAGACCGGTCTCGACAACGGCAAGCCGCGCCTGCCTTGGTACCGCGAGAACAACGTCGCCGTCGACACGCTCTCCGCGCCCGCCTCCGCTTCCTCCGCGCAAGGTCAGCTGCAGCTGCAGCGACGCGGGTCGCAGGCGCAGTTCCTGGACACAATCCACCTGGCGGGCAGCGGCGCCGGCGTGCACGGCCAGGGCTACGCGCACGGGGAGAAGGCCGTGAACAAGCAAGATTGGTTCTTCTCGTGCCACTTCTGGTTCGACCCCGTGATGCCCGGGTCCCTGGGCATCGAGTCGATGTTCCAGCTCGTCGAGGCGTGGTGCGTGAAGCAGGGACTCGCGGCGCGGCACGGCATCGCTCACCCAGTGTTCGCGCACGCGCCCGGGGCCACGAGCTGGAAGTACCGCGGGCAGCTAACCCCCAAGAACGACCGCATGGACAGCGAGGTGCACATCAAGTCGGTGGCGGCCTTCTCCTCCTGGGTCGACGTCGTCGCGGACGGGTTCCTCTTCGTCGACGGCCTCCGCGTCTACTCGGCAGACAACCTCCGCGTCCGCATCCAGACCGGCGCCGGCCACGTTGAAGAGCAAGAGGTTGCTGCCAAGGCCACAACCAAGAACAGCAGTATTGCTGATGTGGACGTGGCGGACCTGCAAGCGCTCAAGCAGGCGTTGCTGACGCTGGAGCGACCGCTGCAGCTGGACGCGGGGAGCGAGGTGCCCGCCTGCGCGGTGAGCGACCTGGGCGATAGGGGCTTCATGGAGACGTACGGGGTGGTGGCGCCGCTGTACAGCGGGGCGATGGCCAAGGGCATCGCGTCGGCGGACCTGGTGATCGCGATGGGCCAGCGCAAGATGCTGGGGTCGTTTGGCGCGGGCGGGCTCCCGATGCACGTCGTGCGCGCGGGGATTGAGAAGATCCAGGCAGCGCTGCCAGCGGGGCCATACGCGGTCAACCTGATTCACTCGCCTTTTGACGCCAACCTGGAGAAGGGCAACGTGGACCTCTTCCTGGAGAAGGGCGTGCGCGTCGTGGAGGCGTCGGCCTTCATGGAGCTCACGCCCCAGGTGGTGCGCTACCGCGCGACGGGCCTCTCTCGCGACGCGCGCGGCGGCTCCGTGCGCACGGCCCACAAGATCATCGGCAAGGTCAGCCGCACCGAGCTGGCCGAGATGTTTATCCGGCCCGCGCCGCAAGCCATTCTCGACAAGCTTGTGGCGTCCGGCGAGATCACCCCCGAGCAGGCGGCGCTGGCGCTCGAGGTGCCCATGGCGGACGACATCGCCGTCGAGGCCGATTCGGGCGGGCACACCGACAACCG CCCCATCCACGTCATCCTGCCCCTCATCCTCAGCCTGCGCAACCGCCTCCAGCGCGAGCTCAAGTACCCTGCGCGACACCGCGTGCGCGTCGGCGCCGGGGGCGGCATCGGGTGCCCGCAAGCGGCTCTGGGCGCCTTCCACATGGGCGCCGCGTTTGTGGTGACGGGCACGGTCAACCAGCTGAGCCGGCAGGCCGGGACATGCGACAATGTGCGGCGGCAGCTGTCGCGCGCGACGTACTCGGACATCACGATGGCGCCGGCGGCGGACATGTTCGAGCAGGGCGTCGAGCTGCAGGTGCTCAAGAAGGGCACGATGTTTCCCTCGCGCGCCAAGAAGCTGTTCGAGCTGTTTCACAAGTACGACTCGTTCGAGGCGATGCCGGCGGACGAGCTGGCGCGCGTCGAGAAGCGCATCTTCAGCAAGTCACTCGCCGAGGTGTGGGCCGAGACCAAGGACTTCTACATCACGCGGCTCAACAACCCGGAGAAGATCCGCAAGGCGGAGAACGAGGACCCCAAGCTCAAGATGTCACTCTGCTTCCGCTGGTACCTCGGGCTCAGCTCGTTCTGGGCCAACAACGGCATCGCGGACCGCACGATGGACTACCAGATCTGGTGCGGCCCTGCCATCGGCGCCTTCAACGACTTCATCGCCGACTCGTACCTCGACGTGGCCGTCTCGGGCGAGTTCCCCGACGTCGTGCAGATCAACCTGCAGATCCTGTCGGGCGCAGCCTACCTCCAGCGCCTCCTCTCCGTCAAGCTCGCACCGCGGATCGACGTCGACACCGAGGACGACCTCTTCACCTACCGC

CCCGACCACGCACTCTAA

SEQ ID NO:9示出了示例性的植物優(yōu)化的PFA3基因的核苷酸序列，在本文中稱為PFA3 v2：

ATGACATCTTCAAAGAAAACTCCTGTTTGGGAAATGAGCAAGGAAGAGCTGTTGGATGGCAAGACGGTTGTCTTTGACTACAACGAGCTGTTGGAGTTTGCGGAGGGTGATGTTGGTCAAGTGTTTGGACCAGAGTTTGACATCATTGACAAGTACAGAAGGCGTGTGAGGCTTCCAGCCAGAGAATACTTGCTTGTTTCAAGAGTGACTCTCATGGATGCCGAGGTGAATAACTTCAGAGTTGGCTCCAGAATGGTCACTGAGTATGATGTTCCAGTCAATGGTGAGTTGTCAGAGGGAGGTGATGTTCCCTGGGCAGTTCTTGTTGAAAGTGGGCAGTGTGACTTGATGCTCATCTCCTACATGGGGATTGACTTCCAGTGCAAAGGGGACCGTGTTTACAGATTGCTCAACACATCTCTCACCTTCTTTGGGGTTGCCCATGAAGGAGAAACCCTTGTGTATGACATCAGAGTCACTGGTTTCGCCAAGGGTGCTGGTGGGGAAATCTCAATGTTCTTTTTCGAGTATGACTGC TTTGTTGATGGCAGATTGCTCATAGAGATGAGAGATGGTTGTGCTGGCTTCTTTACTGATGCCGAACTTGCCGCTGGAAAAGGTGTGCTCAAAACGAAGGCTGAGCTTGCTGCACGTGCTCAGATCCAGAAACAAGACATTGCACCCTTTGCACCTGCACCGTGCAGTCACAAAACCAGCTTGGATGCCAGAGAAATGAGACTGCTTGTTGATAGGCAATGGGCAAGGGTCTTTGGTTCTGGAATGGCTGGCATAGACTACAAGTTGTGTGCGAGAAAGATGCTGATGATTGACAGAGTCACACACCTTGATCCGCGTGGAGGTGCTCACGGTCTTGGGCTTCTCATTGGGGAGAAAGTGCTTGAGAGGGACCACTGGTACTTCCCCTGCCACTTTGTGAGGGATGAGGTCATGGCTGGTTCTCTTGTCTCAGATGGATGCTCTCAGCTTCTCAAGGTTTACATGTTGTGGCTTGGCCTTCACACCACTGTTGGTGCGTTCGACTTTCGTCCAGTCAGTGGTCATGCCAACAAAGTGAGGTGTCGTGGACAGATTTCACCGCACAAGGGGAAACTTGTTTATGTCATGGAGATCAAAGAAATGGGCTTTGATGCCAAAACTGGAGATCCATTTGCCATAGCTGATGTTGACATCATTGATGTCAACTTTGAAGAGGGACAAGCGTTTGCTGGAGTTGAGGATCTTCACAGCTATGGCCAAGGAGATTTGAGGAAAAAGATAGTTGTGGATTTCAAGGGAATTGCGTTGTCACTGCAGAAAAGGAAGGAGCAACAGAAAGAGAGCATGACTGTCACCACTACGACCACGACAACCAGCAGAGTGATTGCTCCTCCAAGTGGATGCCTCAAAGGTGATCCCACTGCTCCCACCTCTGTCACGTGGCATCCAATGGCTGAGGGAAATGGAGGTCCTGGACCCACTCCGTCCTTCTCTCCTTCAGCGTATCCTCCCAGAGCTGTTTGCTTCTCTCCTTTCCCCAACAATCCGCTTGACAATGATCATACACCTGGCCAAATGCCGTTGACCTGGTTCAACATGTCTGAGTTCATGTGTGGAAAAGTGAGCAACTGCTTGGGTCCTGAGTTTGCCAGATTTGATGCTTCCAAGACATCCAGATCACCAGCTTTTGACCTGGCTCTTGTGACAAGGGTGACGAGTGTGGCTGACATGGAACATGGTCCTTTCTACAATGTGGATGTCAACCCTGGCCAAGGCACGATGGTGGGTGAGTTTGATTGTCCTGCAGATGCTTGGTTCTTTGGAGCCTCAAGCAGAGACGATCACATGCCGTACAGCATCTTGATGGAGATTGCTCTTCAGACTTCTGGAGTCCTCACATCTGTGCTCAAAGCTCCGCTCACAATGGACAAAGATGACATCCTTTTCAGAAACCTTGATGCAGATGCAGAACTTGTGGGTGATGCCATGCCTGATGTCAGAGGGAAAACCATAAGGAACTTCACCAAATGCACGGGATACTCCATGCTTGGCAAGATGGGA ATCCATCGTTTCACCTTCGAACTCTCTGTTGACGGAGCAGTTTTCTACAAAGGGAGCACCTCTTTTGGTTGGTTTGTTCCTGAGGTCTTTGAGAGCCAGACTGGATTGGACAATGGCAAGCCGAGGTTGCCTTGGTATAGGGAAAACAATGTGGCAGTGGACACACTCTCAGCACCTGCGTCAGCTTCTAGTGCCCAAGGTCAGCTTCAGCTTCAGAGGAGAGGGTCACAAGCGCAGTTCCTGGACACAATTCATCTTGCTGGGAGTGGAGCTGGAGTGCATGGCCAAGGTTATGCTCATGGGGAGAAAGCTGTGAACAAGCAAGATTGGTTCTTTTCTTGCCATTTCTGGTTTGACCCAGTGATGCCTGGGTCTTTGGGAATTGAGTCCATGTTCCAGCTTGTGGAAGCGTGGTGTGTCAAACAAGGCTTGGCTGCAAGGCATGGAATTGCTCATCCAGTCTTTGCACATGCACCTGGTGCCACCAGCTGGAAGTACAGAGGTCAGTTGACCCCAAAGAATGACAGAATGGACAGTGAAGTTCACATCAAGAGTGTTGCTGCCTTCTCCTCATGGGTTGATGTGGTTGCTGATGGGTTCCTCTTCGTTGATGGCCTCAGAGTCTATTCAGCAGACAACCTGAGGGTCAGAATCCAGACTGGAGCTGGCCATGTTGAAGAGCAAGAAGTTGCTGCCAAAGCCACCACAAAGAACTCCAGCATTGCTGATGTGGATGTGGCTGATCTTCAAGCTCTCAAACAAGCGTTGCTGACACTGGAGAGACCATTGCAGTTGGATGCTGGAAGTGAGGTGCCAGCCTGTGCTGTCAGCGATTTGGGAGACCGTGGATTCATGGAGACTTATGGGGTGGTTGCTCCGTTGTACAGTGGTGCGATGGCCAAGGGAATAGCCTCTGCGGATCTGGTCATAGCAATGGGTCAGAGGAAGATGTTGGGGAGCTTTGGAGCTGGTGGGTTGCCAATGCACGTTGTCCGTGCTGGGATTGAAAAGATCCAAGCTGCACTTCCCGCTGGTCCGTATGCTGTCAACCTCATCCACTCACCGTTCGATGCCAACCTGGAAAAGGGCAATGTTGATCTTTTCCTGGAAAAGGGAGTTCGTGTGGTTGAGGCGTCTGCCTTCATGGAACTCACACCACAAGTGGTCCGTTACAGAGCCACGGGACTCTCCAGAGATGCGAGAGGTGGCTCAGTGAGGACAGCACACAAGATCATAGGAAAGGTTTCCAGAACAGAGCTTGCGGAGATGTTCATCAGACCTGCACCTCAAGCAATTCTGGACAAACTTGTTGCGTCTGGTGAAATCACCCCTGAGCAAGCTGCGTTGGCTCTTGAAGTTCCAATGGCTGATGACATTGCAGTTGAGGCTGACAGTGGAGGGCACACTGACAACCGTCCCATTCATGTCATTCTGCCGTTGATCCTCAGTCTGAGGAATAGGCTCCAGAGGGAACTCAAGTACCCTGCCAGACACCGTGTTAGGGTTGGTGCTGG TGGAGGCATAGGTTGTCCTCAAGCTGCACTTGGAGCCTTCCACATGGGAGCTGCGTTTGTTGTGACTGGCACTGTCAACCAGCTGTCCCGTCAAGCTGGAACATGTGACAACGTGAGGCGTCAGCTCTCTCGTGCCACTTACTCTGACATCACGATGGCACCAGCTGCAGACATGTTTGAACAAGGAGTTGAACTGCAAGTTCTCAAGAAAGGAACGATGTTCCCATCTCGTGCCAAGAAACTCTTTGAACTGTTCCACAAGTATGATTCCTTTGAAGCAATGCCTGCGGATGAATTGGCTCGTGTTGAGAAGAGGATCTTCTCCAAGTCCCTTGCAGAAGTTTGGGCAGAGACCAAAGATTTCTACATCACTCGTCTCAACAATCCTGAAAAGATCAGAAAGGCTGAGAATGAGGACCCCAAGCTCAAGATGTCCCTCTGCTTCCGTTGGTACTTGGGTCTCAGCTCATTCTGGGCAAACAATGGCATAGCTGACCGTACGATGGATTACCAGATTTGGTGTGGACCTGCCATAGGAGCCTTCAACGATTTCATTGCAGACAGCTATCTTGATGTTGCAGTCTCTGGTGAGTTCCCTGATGTTGTGCAGATCAACCTTCAAATCCTGTCTGGTGCTGCGTATCTCCAGAGATTGCTCAGTGTCAAACTTGCACCAAGGATAGATGTGGACACTGAAGATGACCTCTTCACCTACAGA

CCAGATCATGCACTCTGA

SEQ ID NO:10示出了示例性HetI基因的核苷酸序列：

ATGCTTCAGCACACTTGGCTTCCGAAGCCTCCCAATCTGACCCTCTTGTCAGATGAGGTTCATCTCTGGAGGATTCCTCTTGACCAGCCTGAGTCACAACTTCAAGACCTTGCTGCCACCCTGAGCAGTGATGAATTGGCGAGGGCAAACAGATTCTACTTTCCAGAACACAGAAGGCGTTTCACTGCTGGGAGAGGCATCCTCAGATCCATCTTGGGTGGATACTTGGGAGTGGAACCGGGTCAAGTCAAGTTTGATTATGAGTCCCGTGGGAAACCGATCCTTGGTGACAGATTTGCTGAGAGTGGACTCCTGTTCAACTTGTCTCACAGCCAGAACCTTGCCTTGTGTGCTGTCAACTACACGCGTCAAATAGGCATTGATCTTGAATATCTGCGTCCAACATCTGACTTGGAGTCTCTTGCAAAGAGGTTCTTTCTCCCAAGAGAATATGAACTCTTGAGGTCACTCCCTGATGAGCAGAAACAGAAGATTTTCTTTCGTTACTGGACTTGCAAAGAGGCTTATCTCAAAGCAACGGGAGATGGAATAGCCAAACTTGAAGAGATCGAGATAGCACTCACCCCAACAGAACCTGCCAAGCTCCAAACAGCTCCTGCGTGGTCTCTGTTGGAGCTTGTGCCAGATGACAATTGTGTT

GCAGCTGTGGCTGTTGCGGGTTTTGGTTGGCAGCCCAAGTTCTGGCATTACTGA

SEQ ID NO:11示出了示例性SzACS2基因的核苷酸序列，其分離自裂殖壺菌ATCC登錄號(hào)20888：

ATGGCTCCCACTCCCGACGCCACCGCGCCTCTGAACAAGCCGAGCGACTATGCCGTCTACCACGAGGAAGACGGCCCCTTCTGGACCGCCGATTCCAGCGGCGTCTCGCGCGTGAACTTTAGCGAGACCGGCGTGGGATCCGAGGGCGTCATCCCTGCGCTCACGCTCATCGACGTCTTCGAGAGGGCCGTCAAGCGCGGCGGAAACAGGATCGCCTTCCGCACGGAAAACATGCCCACGCTCCGCCGCGGCGAAGAGGCCCCGGACGCGCTGCCGCTCAAGGACTGGAAGTCCTGGTCCTGGAAACAGTACAAGGCCGACGTCCACCGCATCGCCAGGGCTCTCATGGACCTCGGCGTTGAGCAGCATGACGCCGTCTCCATTTTTGGCTTTAACTCGCCCGAATGGTTTCTCAGTGCCGTCGGCGCCGTGCACGCAGGTGCCAAGATTGCCGGCATTTACCCCTCAGACACGCCCGCCCAGGTCCAGTACAAGGCCTTCCACAGTGACACCGCTGTTGCCGTTGTCGAAAACGAGCAGTGCTTCAAGAAGTTCGCCGAGGTCGTCGAGGACCTTCCTTACCTCAAGGCCATTGTTTGCTGGGACTATGAAGCCACAGACATCACGCGCGAGGACGGCTCCGTCGTCGAGGTCCTCACCTTTGCCGAGTTCCTCAAGCGCGGCGACACCGTCGAGGCGGCCGCCCTTGACGAGCGCATCTCCAAGATCGAGCCCACCATGTGCGCTGCCCTTATTTACACCAGCGGTACTACCGGCCGCCCCAAGGCCGTTATGATTTCGCACGACAACCTTGTTTTCGAGGCCAGCGCCGTCGTCCCCAACCTCGGAGGAGCCTGTACGACCACTGCTGAGGAGCGCATTCTCTCGTACCTGCCTCTCTCGCACGTCGCTGGTATGATGGTTGATATTATTGCCCCCATCATTGCCACCGCCTTCCACAAGGGCCGCATCTGCGTCTGCTTTGCTCGCCCGTACGATTTGCGCACCGGCACGCTGGGCCAGCGCCTCAACGCCGTGGAGCCCACCATCTTCCTTGGCGTGCCCCGTGTGTGGGAAAAGATTCAGGAAAAGCTCATGGCCGTCGGTGCCAAAACCACCGGCCTCAAGAAGAAGCTCTCTACGGCCGCCAAGAAGCGTGGTCTTGAATTCCAGGAGGAGCAGCAAATCGGCCGCTCCGGTGCCAACCCTGGCTTTGGCCCCCTTGGCATCTACAAGAAGCTCCTCGGCCTCATCAAGGGCAAGCTGGGCCTCACCAAGTGCAAGTTTGCCTTTGCTGGTGCCGCGCCCATGACCCG TGAGACCCTTCAGTACTTTGGCGCGCTGAACATCAACATTAACGAGGTCTACGGCATGTCCGAGTGCTCCGGTGCCGCCACCTGGTCCACGGACAAGGCCCACGAGTGGGGCACTGTTGGCTACGAGATGCCCAGTTGCGAGGTCCGCGTCTTCAAGATTGCCGAGGACGGTACCAAGACCGAGTGCCCGCGCGCCGCCGACATTATGCATGCTACCGAGGAGGAGCAGGGCGAAGTTTGCTTCCGCGGCCGTAACATCATGATGGGCTACCTTGCCAACCCCAAGCTTGGCGACGACCACGTTGCCGAGATCGAGGAGAAGAACGCTGCCGCTATCGACTCCGAGGGCTGGCTCCACAGTGGTGATAAGGGCGCCATTTCTACCCGCGGCATGCTCAAGATCACGGGCCGCTACAAGGAGCTCATCATCGGCGCCGGTGGCGAGAACGTGGCGCCCGTCCCTATTGAGGACGCCATCAAGGCGCGCATGCCTTTTGTTTCCAACGCCATGATGGTCGGAGATAAGCGCAAGTTCATGGCTGTCCTCCTTACCCTCAAGACGGTTGGCGCCACGGGCGAGCTTCCCGGTACGAACAAGCTCATGGGCGCTGCCGCCGACTATGGTGAGACCATCGAGGACGCCTGCGACAACGAGGCGCTCATTGAGGAGATCACGCAGCAGCTCAAGGAGATCGGTGATGATGGCGATGTCACGCCCTCGAACGCGGCTCGCATCCAAAAGTTCACCATTCTCCCGCTCGACTTTTCCGTCTCCACGGACGAGCTCACGGCCACGCTCAAGCTCAAGCGCTCCGTGGTCGCAGACAAGTACGAAGACATCATCGAGGCCTTTTACGAGTCCAAGAGCGTTTTTGTGCCGTACTCGACCGTTGGCGCCTACGCCACGGGCGGCCCGGTCGACGACTCCGTTGTCGATGGCTCCTTCAAGGGCGACTTTAGCATGATTGGCGACGATGATCCGGATCTTCAAAAC

GTCGATGTCCTCGAGGCGATTGACGAGGACAATTAA

SEQ ID NO:12示出了在一些實(shí)施方案中采用的隨機(jī)“間隔區(qū)”多核苷酸的核苷酸序列。

SEQ ID NO:13示出了示例性的5’截短的PFA3基因的核苷酸序列，所述基因在本文中被稱為PFA3 v3：

ATGAGCAAGGAGGAGCTGCTGGACGGCAAGACGGTGGTCTTCGACTACAACGAGCTGCTCGAATTCGCCGAGGGCGACGTGGGCCAAGTGTTCGGACCCGAGTTCGACATCATCGACAAGTACCGGCGTCGCGTGCGGCTGCCGGCGCGCGAGTACCTGCTCGTGTCGCGCGTGACGCTGATGGACGCCGAGGTGAACAACTTCCGCGTCGGGTCGCGCATGGTGACCGAGTACGACGTGC CCGTGAACGGGGAGCTGTCGGAGGGCGGGGACGTGCCGTGGGCGGTGCTGGTGGAGTCGGGGCAGTGCGACCTGATGCTCATCTCGTACATGGGCATCGACTTCCAGTGCAAGGGCGACCGCGTGTACCGCCTGCTCAACACATCGCTCACCTTCTTCGGGGTGGCGCACGAGGGCGAGACGCTGGTGTACGACATCCGCGTCACGGGGTTCGCCAAGGGCGCGGGCGGGGAGATCTCGATGTTCTTCTTCGAGTACGACTGCTTCGTGGACGGCCGCCTGCTGATCGAGATGCGCGACGGGTGCGCCGGGTTCTTCACGGACGCCGAGCTGGCCGCCGGCAAGGGCGTGCTTAAGACCAAGGCGGAGCTGGCGGCGCGCGCGCAGATCCAGAAGCAGGACATCGCGCCCTTTGCGCCGGCGCCGTGCTCGCACAAGACCTCGCTGGACGCGCGCGAGATGCGGCTGCTCGTGGACCGCCAGTGGGCGCGCGTCTTCGGCAGCGGCATGGCGGGCATCGACTACAAGTTGTGCGCTCGCAAGATGCTCATGATCGACCGCGTCACGCACCTCGACCCGCGCGGCGGCGCGCACGGCCTCGGGCTGCTGATCGGGGAGAAGGTGCTGGAGCGCGACCACTGGTACTTCCCCTGCCACTTTGTGCGCGACGAGGTGATGGCCGGGTCGCTGGTCAGCGACGGCTGCTCGCAGCTCCTCAAGGTGTACATGCTGTGGCTCGGCCTGCACACGACCGTGGGCGCGTTCGACTTTCGTCCCGTGAGCGGGCACGCCAACAAGGTGCGGTGCCGCGGGCAGATCTCACCGCACAAGGGCAAGCTCGTGTACGTGATGGAGATCAAGGAAATGGGCTTTGACGCGAAGACGGGCGATCCGTTTGCGATCGCGGACGTGGACATCATCGACGTCAACTTCGAGGAGGGACAGGCGTTTGCGGGAGTGGAAGACCTGCACAGCTACGGCCAGGGCGACCTCCGCAAGAAGATCGTCGTCGACTTCAAGGGCATCGCGCTCTCCCTGCAGAAGCGGAAGGAGCAGCAGAAGGAAAGCATGACCGTGACTACGACGACGACGACGACGAGCCGGGTGATTGCGCCGCCCAGCGGGTGCCTCAAGGGCGACCCGACGGCGCCGACGAGCGTGACGTGGCACCCGATGGCGGAGGGCAACGGCGGGCCCGGACCGACGCCGTCGTTCTCGCCGTCCGCGTACCCGCCGCGGGCGGTGTGCTTCTCGCCGTTCCCCAACAACCCGCTTGACAACGACCACACGCCGGGCCAGATGCCGTTGACCTGGTTCAACATGTCCGAATTCATGTGCGGCAAAGTGTCCAACTGCCTGGGCCCCGAGTTTGCGCGCTTCGACGCGAGCAAGACGAGCCGCAGCCCGGCCTTTGACCTGGCGCTCGTGACGCGGGTGACGAGCGTGGCGGACATGGAGCACGGGCCGTTCTACAACGTGGACGTCAACCCGGGC CAGGGCACGATGGTGGGCGAGTTCGACTGTCCCGCGGACGCGTGGTTCTTCGGCGCCTCGAGCCGCGACGACCACATGCCGTACTCGATCCTGATGGAGATCGCGCTGCAGACGTCGGGCGTCCTCACCTCGGTGCTCAAGGCGCCGCTGACGATGGACAAGGACGACATCCTCTTCCGCAACCTCGACGCAGACGCCGAGCTCGTGGGCGACGCCATGCCGGACGTGCGCGGCAAGACGATCCGCAACTTCACCAAGTGCACAGGCTACAGCATGCTCGGCAAGATGGGCATCCACCGCTTCACCTTTGAGCTCAGCGTCGACGGCGCCGTCTTCTACAAGGGCAGCACCTCGTTTGGCTGGTTCGTCCCCGAGGTCTTCGAGTCGCAGACCGGTCTCGACAACGGCAAGCCGCGCCTGCCTTGGTACCGCGAGAACAACGTCGCCGTCGACACGCTCTCCGCGCCCGCCTCCGCTTCCTCCGCGCAAGGTCAGCTGCAGCTGCAGCGACGCGGGTCGCAGGCGCAGTTCCTGGACACAATCCACCTGGCGGGCAGCGGCGCCGGCGTGCACGGCCAGGGCTACGCGCACGGGGAGAAGGCCGTGAACAAGCAAGATTGGTTCTTCTCGTGCCACTTCTGGTTCGACCCCGTGATGCCCGGGTCCCTGGGCATCGAGTCGATGTTCCAGCTCGTCGAGGCGTGGTGCGTGAAGCAGGGACTCGCGGCGCGGCACGGCATCGCTCACCCAGTGTTCGCGCACGCGCCCGGGGCCACGAGCTGGAAGTACCGCGGGCAGCTAACCCCCAAGAACGACCGCATGGACAGCGAGGTGCACATCAAGTCGGTGGCGGCCTTCTCCTCCTGGGTCGACGTCGTCGCGGACGGGTTCCTCTTCGTCGACGGCCTCCGCGTCTACTCGGCAGACAACCTCCGCGTCCGCATCCAGACCGGCGCCGGCCACGTTGAAGAGCAAGAGGTTGCTGCCAAGGCCACAACCAAGAACAGCAGTATTGCTGATGTGGACGTGGCGGACCTGCAAGCGCTCAAGCAGGCGTTGCTGACGCTGGAGCGACCGCTGCAGCTGGACGCGGGGAGCGAGGTGCCCGCCTGCGCGGTGAGCGACCTGGGCGATAGGGGCTTCATGGAGACGTACGGGGTGGTGGCGCCGCTGTACAGCGGGGCGATGGCCAAGGGCATCGCGTCGGCGGACCTGGTGATCGCGATGGGCCAGCGCAAGATGCTGGGGTCGTTTGGCGCGGGCGGGCTCCCGATGCACGTCGTGCGCGCGGGGATTGAGAAGATCCAGGCAGCGCTGCCAGCGGGGCCATACGCGGTCAACCTGATTCACTCGCCTTTTGACGCCAACCTGGAGAAGGGCAACGTGGACCTCTTCCTGGAGAAGGGCGTGCGCGTCGTGGAGGCGTCGGCCTTCATGGAGCTCACGCCCCAGGTGGTGCGCTACCGCGCGACGGGCCTCTCTCGCGACGCGCGC GGCGGCTCCGTGCGCACGGCCCACAAGATCATCGGCAAGGTCAGCCGCACCGAGCTGGCCGAGATGTTTATCCGGCCCGCGCCGCAAGCCATTCTCGACAAGCTTGTGGCGTCCGGCGAGATCACCCCCGAGCAGGCGGCGCTGGCGCTCGAGGTGCCCATGGCGGACGACATCGCCGTCGAGGCCGATTCGGGCGGGCACACCGACAACCGCCCCATCCACGTCATCCTGCCCCTCATCCTCAGCCTGCGCAACCGCCTCCAGCGCGAGCTCAAGTACCCTGCGCGACACCGCGTGCGCGTCGGCGCCGGGGGCGGCATCGGGTGCCCGCAAGCGGCTCTGGGCGCCTTCCACATGGGCGCCGCGTTTGTGGTGACGGGCACGGTCAACCAGCTGAGCCGGCAGGCCGGGACATGCGACAATGTGCGGCGGCAGCTGTCGCGCGCGACGTACTCGGACATCACGATGGCGCCGGCGGCGGACATGTTCGAGCAGGGCGTCGAGCTGCAGGTGCTCAAGAAGGGCACGATGTTTCCCTCGCGCGCCAAGAAGCTGTTCGAGCTGTTTCACAAGTACGACTCGTTCGAGGCGATGCCGGCGGACGAGCTGGCGCGCGTCGAGAAGCGCATCTTCAGCAAGTCACTCGCCGAGGTGTGGGCCGAGACCAAGGACTTCTACATCACGCGGCTCAACAACCCGGAGAAGATCCGCAAGGCGGAGAACGAGGACCCCAAGCTCAAGATGTCACTCTGCTTCCGCTGGTACCTCGGGCTCAGCTCGTTCTGGGCCAACAACGGCATCGCGGACCGCACGATGGACTACCAGATCTGGTGCGGCCCTGCCATCGGCGCCTTCAACGACTTCATCGCCGACTCGTACCTCGACGTGGCCGTCTCGGGCGAGTTCCCCGACGTCGTGCAGATCAACCTGCAGATCCTGTCGGGCGCAGCCTACCTCCAGCGCCTCCTCTCCGTCAAGCTCGCACCGCGGATCGAC

GTCGACACCGAGGACGACCTCTTCACCTACCGCCCCGACCACGCACTCTAA

SEQ ID NO:14示出了示例性的5’截短的PFA3蛋白(PFA3v3)的氨基酸序列：

MSKEELLDGKTVVFDYNELLEFAEGDVGQVFGPEFDIIDKYRRRVRLPAREYLLVSRVTLMDAEVNNFRVGSRMVTEYDVPVNGELSEGGDVPWAVLVESGQCDLMLISYMGIDFQCKGDRVYRLLNTSLTFFGVAHEGETLVYDIRVTGFAKGAGGEISMFFFEYDCFVDGRLLIEMRDGCAGFFTDAELAAGKGVLKTKAELAARAQIQKQDIAPFAPAPCSHKTSLDAREMRLLVDRQWARVFGSGMAGIDYKLCARKMLMIDRVTHLDPRGGAHGLGLLIGEKVLERDHWYFPCHFVRDEVMAGSLVSDGCSQLLKVYMLWLGLHTTVGAFDFRPVSGHANKVRCR GQISPHKGKLVYVMEIKEMGFDAKTGDPFAIADVDIIDVNFEEGQAFAGVEDLHSYGQGDLRKKIVVDFKGIALSLQKRKEQQKESMTVTTTTTTTSRVIAPPSGCLKGDPTAPTSVTWHPMAEGNGGPGPTPSFSPSAYPPRAVCFSPFPNNPLDNDHTPGQMPLTWFNMSEFMCGKVSNCLGPEFARFDASKTSRSPAFDLALVTRVTSVADMEHGPFYNVDVNPGQGTMVGEFDCPADAWFFGASSRDDHMPYSILMEIALQTSGVLTSVLKAPLTMDKDDILFRNLDADAELVGDAMPDVRGKTIRNFTKCTGYSMLGKMGIHRFTFELSVDGAVFYKGSTSFGWFVPEVFESQTGLDNGKPRLPWYRENNVAVDTLSAPASASSAQGQLQLQRRGSQAQFLDTIHLAGSGAGVHGQGYAHGEKAVNKQDWFFSCHFWFDPVMPGSLGIESMFQLVEAWCVKQGLAARHGIAHPVFAHAPGATSWKYRGQLTPKNDRMDSEVHIKSVAAFSSWVDVVADGFLFVDGLRVYSADNLRVRIQTGAGHVEEQEVAAKATTKNSSIADVDVADLQALKQALLTLERPLQLDAGSEVPACAVSDLGDRGFMETYGVVAPLYSGAMAKGIASADLVIAMGQRKMLGSFGAGGLPMHVVRAGIEKIQAALPAGPYAVNLIHSPFDANLEKGNVDLFLEKGVRVVEASAFMELTPQVVRYRATGLSRDARGGSVRTAHKIIGKVSRTELAEMFIRPAPQAILDKLVASGEITPEQAALALEVPMADDIAVEADSGGHTDNRPIHVILPLILSLRNRLQRELKYPARHRVRVGAGGGIGCPQAALGAFHMGAAFVVTGTVNQLSRQAGTCDNVRRQLSRATYSDITMAPAADMFEQGVELQVLKKGTMFPSRAKKLFELFHKYDSFEAMPADELARVEKRIFSKSLAEVWAETKDFYITRLNNPEKIRKAENEDPKLKMSLCFRWYLGLSSFWANNGIADRTMDYQIWCGPAIGAFNDFIADSYLDVAVSGEFPDVVQINL

QILSGAAYLQRLLSVKLAPRIDVDTEDDLFTYRPDHAL

SEQ ID NO:15-38示出了在本文某些實(shí)例中采用的幾種質(zhì)粒的核苷酸序列。

實(shí)施本發(fā)明的模式

I.若干實(shí)施方案概述

在真核生物中的LC-PUFA合成的經(jīng)典途徑涉及飽和或單不飽和脂肪酸的延長(zhǎng)與去飽和。經(jīng)由PUFA合酶的LC-PUFA合成途徑與所述經(jīng)典途徑差異很大。具體地說，PUFA合酶利用丙二酰輔酶A作為碳源，并產(chǎn)生最終的PUFA，而不釋放任何顯著量的中間體。同樣，在PUFA合酶的作用下，在合成過程中利用 不需氧的機(jī)制添加適當(dāng)?shù)捻樖诫p鍵。例如，NADPH可用作合成循環(huán)過程中的還原劑。

本文中描述了相對(duì)廉價(jià)的組合物和方法，用于在植物、植物種子、或植物油中高效率且有效地產(chǎn)生較長(zhǎng)鏈的或更不飽和的PUFA(以及此類PUFA中富含的大量脂質(zhì)，例如，TAG和PL)。此類脂肪酸及其生產(chǎn)方法可用于許多場(chǎng)合，包括飲食和工業(yè)應(yīng)用。一種通過用PUFA合酶系統(tǒng)(例如，含有從破囊壺菌——裂殖壺菌藻鑒定的PUFA合酶組分和來自藍(lán)藻細(xì)菌屬——念珠藻屬的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(HetI)，例如，還含有裂殖壺菌脂酰CoA合成酶同工酶2)遺傳修飾重組宿主生物而在宿主生物(例如植物)中提供和提高PUFA產(chǎn)生的系統(tǒng)，相比于獲得這些脂肪酸的方法具有顯著的益處。

海洋破囊壺菌裂殖壺菌藻(如ATCC登錄號(hào)PTA-9695代表)產(chǎn)生具有高ω-3/ω-6比率的油，也可作為作物轉(zhuǎn)化用的PUFA合酶基因的來源。另外，裂殖壺菌可產(chǎn)生除了DHA之外還含有顯著水平的EPA的油。這種產(chǎn)生顯著量的EPA的能力與某些其他的破囊壺菌菌株(例如，裂殖壺菌屬物種ATCC登錄號(hào)20888)形成了鮮明對(duì)比。美國(guó)專利公開No.US2013/0150599A1；PCT國(guó)際專利公開No.WO2013/016546。該裂殖壺菌PUFA合酶系統(tǒng)當(dāng)以異源方式在種類繁多的作物中表達(dá)時(shí)可發(fā)揮作用，正如本文在例如芥花、大豆、和模型植物擬南芥中所證明的，從而產(chǎn)生有商業(yè)意義水平的ω-3 LC-PUFA(例如，DHA和EPA)。因此，這個(gè)基因集在一些實(shí)施方案中相比于其他PUFA合酶基因集，可導(dǎo)致植物中產(chǎn)生顯著更多的DHA和EPA。

本文中還描述了各種構(gòu)建體設(shè)計(jì)的實(shí)用性，包括不同的種子特異性啟動(dòng)子和終止子的多樣化、間隔元件的使用、轉(zhuǎn)錄取向的改變、基因在TDNA之內(nèi)的不同相對(duì)定位、以及天然和修飾的基因序列的使用?？梢岳眠@些構(gòu)建體設(shè)計(jì)進(jìn)一步提高回收的產(chǎn)LC-PUFA-事件的數(shù)目、以及ω-3 LC-PUFA性狀在后續(xù)世代中的遺傳力。

在本文的實(shí)例中，用載體轉(zhuǎn)化芥花、大豆、和擬南芥植物，所述載體包含編碼來自破囊壺菌裂殖壺菌藻的PUFA合酶的三個(gè)組分多肽(即，PFA1、PFA2、和PFA3)、以及來自念珠藻屬的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(HetI)的基因。在一些實(shí)例中，所有四種基因都被包含在一個(gè)構(gòu)建體中，處于種子特異性啟動(dòng)子的控制之下，并且由處于不同構(gòu)型的多個(gè)種子特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。植物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)生成了包含所有四種轉(zhuǎn)基因并在種子中表達(dá)所有四種多肽的事件。在來自所 得轉(zhuǎn)基因事件的種子脂質(zhì)中產(chǎn)生ω-3 LC-PUFA的DHA和EPA。還檢測(cè)到ω-6LC-PUFA DPA?；厥樟嗽赥₁種子的批量分析中含有高達(dá)2.9％DHA和1.0％EPA(3.9％的總ω-3 LC-PUFA)、以及1.1％DHA+2.0％EPA的芥花事件。在T₁芥花種子的單種子分析中檢測(cè)到高達(dá)4.6％的DHA和3.7％的EPA。根據(jù)對(duì)T₁種子的單種子分析，回收的大豆事件含有高達(dá)1.9％的DHA和2.2％的EPA。

II.縮寫

ACS 乙酰CoA合成酶

DGAT 二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶

DHA 二十二碳六烯酸

DPA 二十二碳五烯酸

EPA 二十碳五烯酸

FAME 脂肪酸甲酯

HPLC 高效液相色譜法

LC-PUFA 長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸

LPAT 溶血磷脂酸酰基轉(zhuǎn)移酶

LPCAT 溶血卵磷脂?；D(zhuǎn)移酶

P1P2P3H 與HetI一起表達(dá)的PFA1、PFA2、和PFA3基因

P1P2P3H-ACS 與HetI和SzACS2一起表達(dá)的PFA1、PFA2、和PFA3基因

PDAT 磷脂:二脂酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶

PL 磷脂

PPT酶 磷酸泛酰巰基乙胺轉(zhuǎn)移酶

PTU 植物轉(zhuǎn)錄單位

PUFA 多不飽和脂肪酸

SzACS2 裂殖壺菌脂酰CoA合成酶同工酶2

TAG 三?；视?/p>

III.術(shù)語

回交：回交方法可用于將核酸序列導(dǎo)入植物。回交技術(shù)已數(shù)十年廣泛用于將新的性狀導(dǎo)入植物。Jensen，N，Ed.Plant Breeding Methodology，John Wiley&Sons，Inc，1988。在典型的回交方案中，使感興趣的原始品種(輪回親本) 與攜帶要被轉(zhuǎn)移的感興趣基因的第二個(gè)品種(非輪回親本)雜交。然后使從這種雜交得到的子代再與所述輪回親本雜交，并重復(fù)該過程，直到獲得植物時(shí)為止，其中除了來自非輪回親本的轉(zhuǎn)移的基因之外，所述輪回植物的基本上所有的所希望的形態(tài)學(xué)和生理學(xué)特性被回收在轉(zhuǎn)換的植物中。

分離的：“分離的”生物組分(例如，核酸或蛋白質(zhì))已經(jīng)與該組分天然存在的生物細(xì)胞中的其它生物組分(即，其它染色體或染色體外DNA和RNA、和蛋白質(zhì))實(shí)質(zhì)上分離、與之分別產(chǎn)生、或從之純化出來，在分離、產(chǎn)生和純化的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了該組分的化學(xué)或功能變化(例如核酸可以通過斷裂連接該核酸與染色體中其余DNA的化學(xué)鍵而從染色體分離)。已經(jīng)“分離的”核酸分子和蛋白質(zhì)包括通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸分子和蛋白質(zhì)。該術(shù)語還包括通過在宿主細(xì)胞內(nèi)重組表達(dá)制備的核酸分子和蛋白質(zhì)，以及化學(xué)合成的核酸分子、蛋白質(zhì)和肽。

核酸分子：如本文中使用的，術(shù)語“核酸分子”可以是指核苷酸的聚合物形式，可包括RNA、cDNA、基因組DNA的有義和反義鏈，以及上述情形的合成形式和混合聚合物。核苷酸可以是指核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、或這兩種類型核苷酸的任一者的修飾形式。如本文中使用的“核酸分子”與“核酸”和“多核苷酸”是同義詞。除非另外指明，核酸分子通常在長(zhǎng)度上具有至少10個(gè)堿基。所述術(shù)語包括DNA的單鏈和雙鏈形式。核酸分子可以包括天然存在的核苷酸和通過天然存在和/或非天然存在的核苷酸連接而連接在一起的修飾核苷酸的任一者或兩者。

正如本領(lǐng)域技術(shù)人員易于理解的，核酸分子可被化學(xué)修飾或生物化學(xué)修飾，或者可以含有非天然或衍生的核苷酸堿基。這些修飾包括，例如，標(biāo)記物、甲基化、用類似物取代一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾(例如，如不帶電連接(uncharged linkage)的修飾：例如甲基膦酸鹽、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；帶電連接(charged linkage)的修飾：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；懸垂部分的修飾：例如肽類；嵌入劑修飾：例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等；螯合劑修飾；烷化劑(alkylator)修飾；和修飾的連接：例如α異頭核酸等)。術(shù)語“核酸分子”還包括任何拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，包括單鏈的、雙鏈的、部分雙鏈體的、三鏈體的、發(fā)夾形的(hairpinned)、圓形的、掛鎖形的結(jié)構(gòu)。

可操作連接：當(dāng)?shù)谝缓怂嵝蛄兄糜谂c第二核酸序列的功能性關(guān)系中時(shí)，第一核酸序列與第二核酸序列是可操作連接的。當(dāng)以重組方式產(chǎn)生時(shí)，可操作 連接的核酸序列通常是連續(xù)的，并且在這種情況下必需將兩個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)連接在同一個(gè)閱讀框內(nèi)(例如，在多順反子ORF中)。然而，可操作連接的核酸序列不必是連續(xù)的。

在有關(guān)調(diào)節(jié)序列和編碼序列的情況下使用時(shí)，術(shù)語“可操作連接”意味著該調(diào)節(jié)序列影響該連接的編碼序列的表達(dá)?！罢{(diào)節(jié)序列”或“控制元件”是指影響轉(zhuǎn)錄的周期和水平/量、RNA加工或穩(wěn)定性、或相關(guān)編碼序列的翻譯的核苷酸序列。調(diào)節(jié)序列可包括：?jiǎn)?dòng)子；翻譯前導(dǎo)序列；內(nèi)含子；增強(qiáng)子；莖環(huán)結(jié)構(gòu)；抑制子結(jié)合序列；終止序列；和多腺苷酸化識(shí)別序列。特定的調(diào)節(jié)序列可位于與其可操作連接的編碼序列的上游和/或下游。并且，與編碼序列可操作連接的特定調(diào)節(jié)序列可位于雙鏈核酸分子的相關(guān)互補(bǔ)鏈上。

啟動(dòng)子：如本文中使用的，術(shù)語“啟動(dòng)子”是指可以在轉(zhuǎn)錄起始上游的、且可能涉及RNA聚合酶與其他蛋白質(zhì)的識(shí)別和結(jié)合而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的DNA區(qū)域。啟動(dòng)子可與用于在細(xì)胞中表達(dá)的編碼序列可操作連接，或者啟動(dòng)子可與編碼信號(hào)序列的核苷酸序列可操作連接，所述核苷酸序列可與用于在細(xì)胞中表達(dá)的編碼序列可操作連接?！爸参飭?dòng)子”可以是能夠啟動(dòng)植物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。在發(fā)育控制下的啟動(dòng)子的實(shí)例包括優(yōu)先啟動(dòng)某些組織中的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，所述組織例如葉、根、種子、纖維、木質(zhì)部導(dǎo)管、管胞、或厚壁組織。這樣的啟動(dòng)子稱為“組織優(yōu)先”啟動(dòng)子。僅啟動(dòng)某些組織中的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子被稱為“組織特異性”啟動(dòng)子?！凹?xì)胞類型特異性”啟動(dòng)子主要驅(qū)動(dòng)一個(gè)或多個(gè)器官中某些細(xì)胞類型(例如，根或葉中的維管細(xì)胞)中的表達(dá)?！罢T導(dǎo)型”啟動(dòng)子可以是可以在環(huán)境控制之下的啟動(dòng)子。可通過誘導(dǎo)型啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實(shí)例包括厭氧條件和光的存在。組織特異性啟動(dòng)子、組織優(yōu)先啟動(dòng)子、細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子、和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子構(gòu)成“非組成型”啟動(dòng)子類別。“組成型”啟動(dòng)子是在大多數(shù)環(huán)境條件下在生物的大多數(shù)細(xì)胞中可具有活性的啟動(dòng)子。

任何誘導(dǎo)型啟動(dòng)子均可以在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中使用。參見Ward等人，(1993)Plant Mol.Biol.22:361-366。利用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，轉(zhuǎn)錄速率響應(yīng)于誘導(dǎo)劑而增加。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于：來自響應(yīng)于銅的ACEI系統(tǒng)的啟動(dòng)子；響應(yīng)于苯磺酰胺除草劑安全劑的來自玉米的In2基因啟動(dòng)子；來自Tn10的Tet抑制子；和來自甾體激素基因的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，其轉(zhuǎn)錄活性可通過糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)(Schena等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:0421)。

組成型啟動(dòng)子的實(shí)例例如包括，但不限于：來自植物病毒的啟動(dòng)子，例 如來自CaMV的35S啟動(dòng)子；來自水稻肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子；泛素啟動(dòng)子；pEMU；MAS；玉米H3組蛋白啟動(dòng)子；和ALS啟動(dòng)子，歐洲油菜ALS3結(jié)構(gòu)基因5'的Xba1/NcoI片段(或與所述Xba1/NcoI片段相似的核苷酸序列)(國(guó)際專利公開No.WO 96/30530)。

另外，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中可以利用任何組織特異性或組織優(yōu)先啟動(dòng)子。用包含與組織特異性啟動(dòng)子可操作連接的編碼序列的核酸分子轉(zhuǎn)化的植物可唯一地或優(yōu)先地在特異性組織中產(chǎn)生所述編碼序列的產(chǎn)物。示例性的組織特異性或組織優(yōu)先啟動(dòng)子包括但不限于：根特異性啟動(dòng)子，如來自菜豆蛋白基因的啟動(dòng)子；葉特異性和光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如來自cab或rubisco的啟動(dòng)子；花藥特異性啟動(dòng)子，如來自LAT52的啟動(dòng)子；花粉特異性啟動(dòng)子，如來自Zm13的啟動(dòng)子；小孢子優(yōu)先啟動(dòng)子，如來自apg的啟動(dòng)子；以及種子特異性啟動(dòng)子(例如，來自PvDlec2、LfKCS3、FAE1、BoACP、或BnaNapinC的啟動(dòng)子)。

異源的：本文中適用于核酸(例如，多核苷酸、DNA、RNA、和基因)的術(shù)語“異源”意味著不同來源。例如，如果宿主細(xì)胞是用在自然界中不存在于未轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞中的核酸轉(zhuǎn)化的，則該核酸對(duì)于所述宿主細(xì)胞而言是異源的(并且是外源的)。而且，轉(zhuǎn)化核酸的不同元件(例如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、編碼序列、終止子，等)彼此之間和/或相對(duì)于轉(zhuǎn)化的宿主而言可以是異源的。如本文中使用的術(shù)語“異源”還可適用于一種或多種核酸，所述核酸的序列與已經(jīng)存在于宿主細(xì)胞中的核酸相同，但是當(dāng)前與不同的其他序列連接和/或以不同的拷貝數(shù)存在，等等。

天然的：如本文中使用的，術(shù)語“天然的”是指在自然界中發(fā)現(xiàn)的生物中或在生物的基因組中處于其天然位置的、與其自身的調(diào)節(jié)序列(如果存在的話)在一起的多核苷酸或基因形式。

內(nèi)源的：如本文中使用的，術(shù)語“內(nèi)源的”是指位于生物或基因組中的多核苷酸、基因、或多肽，所述生物或基因組在自然界中通常包含所述分子。

轉(zhuǎn)化：如本文中使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)導(dǎo)”是指將一個(gè)或多個(gè)核酸分子轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。當(dāng)核酸分子通過核酸分子組入細(xì)胞基因組中、或通過附加型復(fù)制，而被該細(xì)胞穩(wěn)定地復(fù)制時(shí)，則稱細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)到該細(xì)胞中的核酸分子“轉(zhuǎn)化”。如本文中使用的，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”涵蓋所有可將核酸分子導(dǎo)入這種細(xì)胞中的技術(shù)。實(shí)例包括但不限于：用病毒載體轉(zhuǎn)染；用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化；電穿孔(Fromm等人，(1986)Nature 319:791-3)；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(Felgner等人，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 84:7413-7)；顯微注射(Mueller等人，(1978)Cell 15:579-85)；土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移(Fraley等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:4803-7)；直接DNA攝?。缓臀⒘＾Z擊(Klein等人，(1987)Nature 327:70)。

轉(zhuǎn)基因：整合到宿主基因組中的外源核酸序列。在一些實(shí)例中，轉(zhuǎn)基因可含有與該轉(zhuǎn)基因的編碼序列可操作連接的調(diào)節(jié)序列(例如，啟動(dòng)子)。

載體：引入到細(xì)胞中，例如產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的核酸分子。載體可以包含允許其在宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列，諸如復(fù)制起點(diǎn)。載體的實(shí)例包括但不限于：質(zhì)粒；粘粒；噬菌體；和攜帶外源DNA進(jìn)入細(xì)胞中的病毒。載體還可包括一種或多種基因、反義分子、和/或選擇標(biāo)志物基因和本領(lǐng)域已知的其他遺傳元件。載體可以轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或感染細(xì)胞，由此引起細(xì)胞表達(dá)核酸分子和/或由該載體編碼的蛋白質(zhì)。任選地，載體包括輔助核酸分子實(shí)現(xiàn)進(jìn)入細(xì)胞中的物質(zhì)(例如脂質(zhì)體、和蛋白質(zhì)包衣等)。

表達(dá)：如本文中使用的，術(shù)語“表達(dá)”可以是指由多核苷酸編碼的mRNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積累、或這樣的mRNA翻譯成多肽。如本文中使用的，術(shù)語“過表達(dá)”是指高于相同或密切相關(guān)基因的內(nèi)源表達(dá)的表達(dá)。如果異源基因的表達(dá)高于與之密切相關(guān)的內(nèi)源基因(例如，同源物)，則所述異源基因被過表達(dá)。

外源的：術(shù)語“外源的”，如適用于本文中的核酸(例如，多核苷酸、DNA、RNA、和基因)的，是指在其特有的環(huán)境或背景中通常不存在的一種或多種核酸。例如，如果宿主細(xì)胞是用在自然界中不存在于未轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞中的核酸轉(zhuǎn)化的，則該核酸對(duì)于所述宿主細(xì)胞而言是外源的。如本文中使用的術(shù)語“外源的”還指一種或多種核酸，所述核酸的序列與已經(jīng)存在于宿主細(xì)胞中的核酸相同，但是與已經(jīng)存在于宿主細(xì)胞中的具有相同序列的核酸相比，位于不同的細(xì)胞或基因組背景中。例如，與通常整合在宿主細(xì)胞基因組中的具有相同序列的核酸相比，整合在宿主細(xì)胞基因組中不同位置的核酸對(duì)于宿主細(xì)胞而言是外源的。而且，當(dāng)具有相同序列的核酸通常只存在于宿主細(xì)胞基因組中時(shí)，存在于宿主細(xì)胞中的質(zhì)粒或載體中的核酸(例如，DNA分子)對(duì)于宿主細(xì)胞而言是外源的。

序列同一性：在兩個(gè)核酸或多肽序列的情況下，如本文中使用的術(shù)語“序列同一性”或“同一性”可以是指在指定比較窗口上比對(duì)最大對(duì)應(yīng)性時(shí)在這兩個(gè)序列中相同的殘基。

如本文中使用的，術(shù)語“序列同一性百分比”可以是指通過在比較窗口上 比較兩個(gè)最優(yōu)比對(duì)序列(例如核酸序列、和氨基酸序列)確定的值，其中在該比較窗口中的序列部分可以包含相比于參考序列(不包含添加或缺失)的添加或缺失(即，空位)，用于這兩個(gè)序列的最優(yōu)比對(duì)。通過確定相同核苷酸或氨基酸殘基出現(xiàn)在兩個(gè)序列中的位置的數(shù)目而產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，用該匹配位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置的總數(shù)，將結(jié)果乘以100而產(chǎn)生序列同一性的百分比，從而計(jì)算出該百分比。

用于比較的序列比對(duì)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。各種程序和比對(duì)算法例如描述于Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins和Sharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpet等人，(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang等人，(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson等人，(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana等人，(1999)FEMS Microbiol.Lett.174:247-50。序列比對(duì)方法和同源性計(jì)算的詳細(xì)考慮事項(xiàng)可見于例如，Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215:403-10。

美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)基本局部比對(duì)搜索工具(BLAST^TM；Altschul等人，(1990))可從幾個(gè)來源獲得，包括美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(Bethesda,MD)、以及在因特網(wǎng)上，其與幾種序列分析程序結(jié)合使用。怎樣使用該程序確定序列同一性的描述可在因特網(wǎng)的BLAST^TM的“幫助”部分獲得。為了比較核酸序列，可以采用利用默認(rèn)參數(shù)的BLAST^TM(Blastn)程序的“Blast 2序列”函數(shù)。在用這種方法評(píng)估時(shí)，與參考序列具有較大相似性的核酸序列將顯示出同一性百分比的增加。

如本文中使用的，術(shù)語“基本上相同”可以是指85％以上相同的核苷酸序列。例如，基本上相同的核苷酸序列可以與參考序列至少85.5％；至少86％；至少87％；至少88％；至少89％；至少90％；至少91％；至少92％；至少93％；至少94％；至少95％；至少96％；至少97％；至少98％；至少99％；或至少99.5％相同。

在一些實(shí)施方案中，可通過使用核酸探針檢測(cè)植物中異源核酸的存在。探針可以是DNA分子或RNA分子?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的手段合成RNA探針，例如，使用DNA分子模板。探針可含有異源核酸的核苷酸序列的全部或部分、以及來自植物基因組的其他毗鄰核苷酸序列。這在本文中被稱為“毗鄰探針”。 如常規(guī)理解的那樣，取決于來自植物染色體的毗鄰核苷酸序列是在異源核酸的5’側(cè)還是在3’側(cè)，所述另外的毗鄰核苷酸序列稱為異源核酸的“上游”或“下游”。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公認(rèn)的，獲得包含在探針中的另外的毗鄰核苷酸序列的過程可以幾乎無限地重復(fù)(僅僅受到染色體長(zhǎng)度的限制)，由此沿著染色體鑒定出另外的核酸。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中可以使用上述各種探針的任一者和全部。

探針可含有與異源核酸不毗鄰的核苷酸序列；在本文中將這種探針稱為“非毗鄰探針”。非毗鄰探針的序列的位置充分靠近染色體上的異源核酸的序列，使得所述非毗鄰探針與所述異源核酸遺傳連鎖。探針還可以是有待檢測(cè)的異源核酸的精確拷貝。探針還可以是包含或其組成為與染色體DNA的克隆區(qū)段基本上相同的核苷酸序列的核酸分子，所述克隆區(qū)段包含有待檢測(cè)的異源核酸。

可以合成方式或通過克隆制備寡核苷酸探針序列。適合的克隆載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。寡核苷酸探針可以是標(biāo)記的或未標(biāo)記的。存在多種用于標(biāo)記核酸分子的技術(shù)，例如包括，但不限于：借助于切口平移的放射性標(biāo)記術(shù)；隨機(jī)引物法(random priming)；借助于末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶的加尾法，等等，其中所采用的核苷酸是標(biāo)記的，例如，用放射性³²P標(biāo)記?？梢允褂闷渌麡?biāo)記物，例如包括，但不限于：熒光團(tuán)；酶；酶底物；輔酶；酶抑制劑；等等?；蛘撸峁┛蓹z測(cè)信號(hào)的標(biāo)記物的使用(單獨(dú)地或與其他反應(yīng)劑結(jié)合使用)，可以用與受體結(jié)合的配體代替，其中所述受體被標(biāo)記(例如，借助于以上指示的標(biāo)記物)，以便通過它們自身或與其他試劑結(jié)合而提供可檢測(cè)信號(hào)。參見，例如，Leary等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:40459。

探針還可以是與待檢測(cè)的核酸(“DNA靶”)的精確拷貝“可特異性雜交”或“特異性互補(bǔ)”的核酸分子。術(shù)語“可特異性雜交”和“特異性互補(bǔ)”表明有足夠程度的互補(bǔ)性，使得核酸分子與DNA靶之間發(fā)生穩(wěn)定且特異的結(jié)合。核酸分子與其可特異性雜交的靶序列不必是100％互補(bǔ)的。當(dāng)有足夠的互補(bǔ)程度時(shí)，核酸分子可特異性地雜交，以便避免核酸在特異性結(jié)合是期望的情況下(例如在嚴(yán)格雜交條件下)與非靶序列的非特異性結(jié)合。

導(dǎo)致特定嚴(yán)格程度的雜交條件會(huì)根據(jù)選擇的雜交方法的性質(zhì)和雜交的核酸序列的組成和長(zhǎng)度而變化。通常，雜交溫度和雜交緩沖液的離子強(qiáng)度(尤其是Na⁺和/或Mg⁺⁺濃度)決定雜交的嚴(yán)格性，但洗滌時(shí)間也影響嚴(yán)格性。關(guān)于計(jì)算需要的獲得特定嚴(yán)格性程度的雜交條件是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的，并且 在例如Sambrook等人(ed.)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2^nd ed.,vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989,chapters9 and 11；以及Hames和Higgins(eds.)Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,Oxford,1985中有論述。關(guān)于核酸雜交的進(jìn)一步詳細(xì)說明和指導(dǎo)例如可見于Tijssen,“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays,”in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part I,Chapter 2,Elsevier,NY,1993；和Ausubel等人，Eds.,Current Protocols in Molecular Biology,Chapter 2,Greene Publishing and Wiley-Interscience,NY,1995。

如本文中使用的，“嚴(yán)格條件”涵蓋如下的條件，在此條件下，只有當(dāng)雜交分子與DNA靶之間的錯(cuò)配小于25％時(shí)才發(fā)生雜交?！皣?yán)格條件”包括另外的特殊嚴(yán)格性水平。因此，如本文中使用的，“中度嚴(yán)格性”條件為具有25％以上序列錯(cuò)配的分子不會(huì)雜交的條件；“中等嚴(yán)格性”條件為具有15％以上錯(cuò)配的分子不會(huì)雜交的條件；并且“高嚴(yán)格性”條件為具有10％以上錯(cuò)配的序列不會(huì)雜交的條件?！皹O高嚴(yán)格性”條件為具有6％以上錯(cuò)配的序列不會(huì)雜交的條件。

在具體的實(shí)施方案中，嚴(yán)格條件為在65℃在6x鹽水檸檬酸鈉(SSC)緩沖液、5x鄧哈特溶液溶液、0.5％SDS、和100μg剪切的鮭睪丸DNA中雜交，然后在65℃在2x SSC緩沖液和0.5％SDS中連續(xù)洗滌15--30分鐘，隨后用1x SSC緩沖液和0.5％SDS，最后用0.2x SSC緩沖液和0.5％SDS洗滌。

關(guān)于上文論述的所有探針，探針可包含額外的核酸序列，例如，啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄信號(hào)、和/或載體序列。

優(yōu)化的：如本文中使用的，在編碼蛋白質(zhì)的核酸的語境中，術(shù)語“優(yōu)化的”是指這樣的核酸，其中異源核苷酸序列已經(jīng)被改變，以反映靶宿主生物的密碼子偏好。在一些實(shí)施方案中，可進(jìn)一步改變核苷酸序列，以去除可能干擾基因表達(dá)的遺傳元件。

應(yīng)當(dāng)理解，由于遺傳密碼的冗余，可設(shè)計(jì)多個(gè)DNA序列來編碼單個(gè)氨基酸序列。因此，例如，優(yōu)化的DNA序列可以被設(shè)計(jì)為去除多余的限制性位點(diǎn)和不希望的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，同時(shí)優(yōu)化編碼區(qū)的核苷酸序列，使得密碼子組成近似于其中將要表達(dá)DNA的宿主的總體密碼子組成。關(guān)于合成的DNA序列的設(shè)計(jì)和產(chǎn)生的指南可例如在國(guó)際專利申請(qǐng)WO2013016546、WO2011146524、和WO1997013402；以及美國(guó)專利6,166,302和5,380,831中找到。

保守性取代：如本文中使用的術(shù)語“保守性取代”是指其中氨基酸殘基被替換為相同類別的另一種氨基酸的取代。非保守性氨基酸取代為其中殘基不屬于相同類別的取代，例如，堿性氨基酸到中性或非極性氨基酸的取代?？蔀榱诉M(jìn)行保守性取代的目的而定義的氨基酸的類別是本領(lǐng)域已知的。

在一些實(shí)施方案中，保守性取代包括第一脂肪族氨基酸到第二種不同的脂肪族氨基酸的取代。例如，如果第一種氨基酸為Gly、Ala、Pro、Ile、Leu、Val、和Met之一，則該第一種氨基酸可被替換為選自Gly、Ala、Pro、Ile、Leu、Val、和Met的第二種不同的氨基酸。在特定的實(shí)例中，如果第一種氨基酸為Gly；Ala、Pro、Ile、Leu、和Val之一，則該第一種氨基酸可被替換為選自Gly；Ala、Pro、Ile、Leu、和Val的第二種不同的氨基酸。在涉及疏水性脂肪族氨基酸取代的具體實(shí)例中，如果第一種氨基酸為Ala、Pro、Ile、Leu、和Val之一，則該第一種氨基酸可被替換為選自Ala、Pro、Ile、Leu、和Val的第二種不同的氨基酸。

在一些實(shí)施方案中，保守性取代包括第一芳香族氨基酸到第二種不同的芳香族氨基酸的取代。例如，如果第一種氨基酸為His、Phe、Trp、和Tyr之一，則該第一種氨基酸可被替換為選自His、Phe、Trp、和Tyr的第二種不同的氨基酸。在涉及不帶電的芳香族氨基酸取代的具體實(shí)例中，如果第一種氨基酸為Phe、Trp、和Tyr之一，則該第一種氨基酸可被替換為選自Phe、Trp、和Tyr的第二種不同的氨基酸。

在一些實(shí)施方案中，保守性取代包括第一疏水性氨基酸到第二種不同的疏水性氨基酸的取代。例如，如果第一種氨基酸為Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、和Trp之一，則該第一種氨基酸可被替換為選自Ala、Val、Ile、Leu、Met、Phe、Tyr、和Trp的第二種不同的氨基酸。在涉及非芳香族疏水性氨基酸取代的具體實(shí)例中，如果第一種氨基酸為Ala、Val、Ile、Leu、和Met之一，則該第一種氨基酸可被替換為選自Ala、Val、Ile、Leu、和Met的第二種不同的氨基酸。

在一些實(shí)施方案中，保守性取代包括第一極性氨基酸到第二種不同的極性氨基酸的取代。例如，如果第一種氨基酸為Ser、Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、Pro、Arg、His、Lys、Asp、和Glu之一，則該第一種氨基酸可被替換為選自Ser、Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、Pro、Arg、His、Lys、Asp、和Glu的第二種不同的氨基酸。在涉及不帶電的極性氨基酸取代的具體實(shí)例中，如果第一種氨基酸 為Ser、Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、和Pro之一，則該第一種氨基酸可被替換為選自Ser、Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、和Pro的第二種不同的氨基酸。在涉及帶電的極性氨基酸取代的具體實(shí)例中，如果第一種氨基酸為His、Arg、Lys、Asp、和Glu之一，則該第一種氨基酸可被替換為選自His、Arg、Lys、Asp、和Glu的第二種不同的氨基酸。在涉及帶電的極性氨基酸取代的其他實(shí)例中，如果第一種氨基酸為Arg、Lys、Asp、和Glu之一，則該第一種氨基酸可被替換為選自Arg、Lys、Asp、和Glu的第二種不同的氨基酸。在涉及帶正電的(堿性的)極性氨基酸取代的具體實(shí)例中，如果第一種氨基酸為His、Arg、和Lys之一，則該第一種氨基酸可被替換為選自His、Arg、和Lys的第二種不同的氨基酸。在涉及帶正電的極性氨基酸取代的其他實(shí)例中，如果第一種氨基酸為Arg或Lys，則該第一種氨基酸可被替換為Arg和Lys中的另一個(gè)氨基酸。在涉及帶負(fù)電的(酸性的)極性氨基酸取代的具體實(shí)例中，如果第一種氨基酸為Asp或Glu，則該第一種氨基酸可被替換為Asp和Glu中的另一種氨基酸。

在一些實(shí)施方案中，保守性取代包括第一電中性氨基酸到第二種不同的電中性氨基酸的取代。例如，如果第一種氨基酸為Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、和Tyr之一，則該第一種氨基酸可被替換為選自Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、和Tyr的第二種不同的氨基酸。

在一些實(shí)施方案中，保守性取代包括第一非極性氨基酸到第二種不同的非極性氨基酸的取代。例如，如果第一種氨基酸為Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、和Met之一，則該第一種氨基酸可被替換為選自Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、和Met的第二種不同的氨基酸。

在許多實(shí)例中，可以選擇在保守性取代中用來替換第一種氨基酸的具體的第二種氨基酸，以使得第一種和第二種氨基酸屬于盡可能多的相同的前述類別。因此，如果第一種氨基酸是Ser(極性的非芳香族的電中性氨基酸)，則第二種氨基酸可以是另一種極性氨基酸(即，Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、Pro、Arg、His、Lys、Asp、或Glu)；另一種非芳香族氨基酸(即，Thr、Asn、Gln、Cys、Gly、Pro、Arg、His、Lys、Asp、Glu、Ala、Ile、Leu、Val、或Met)；或另一種電中性氨基酸(即，Gly、Thr、Cys、Asn、Gln、或Tyr)。然而，可能優(yōu)選的是，在這種情況下的第二種氨基酸為Thr、Asn、Gln、Cys、和Gly之一，因?yàn)檫@些氨基酸按照極性、非芳香性、和電中性的分類均相同。本領(lǐng)域已知有其他的標(biāo)準(zhǔn)，可以任選用來選擇保守性取代中使用的特定的第二種氨基酸。例 如，當(dāng)Thr、Asn、Gln、Cys、和Gly可用于保守性取代為Ser時(shí)，可從選擇中排除Cys，以避免形成不希望的交聯(lián)鍵和/或二硫鍵。同樣，可從選擇中排除Gly，因?yàn)樗狈ν榛鶄?cè)鏈。在這種情形下，例如，可以選擇Thr，以便保留側(cè)鏈羥基基團(tuán)的功能性。然而，在保守性取代中要使用的具體的第二種氨基酸的選擇最終都屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的裁量。

PUFA：如本文中使用的，術(shù)語“多不飽和脂肪酸”或“PUFA”是指碳鏈長(zhǎng)度至少為16個(gè)碳(例如，至少18個(gè)碳、至少20個(gè)碳、和22個(gè)或更多個(gè)碳)、具有至少3個(gè)或更多個(gè)雙鍵(例如，4個(gè)或更多個(gè)雙鍵、5個(gè)或更多個(gè)雙鍵、以及6個(gè)或更多個(gè)雙鍵)的脂肪酸，其中所有雙鍵都處于順式構(gòu)型。

如本文中使用的，術(shù)語“長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸”或“LC-PUFA”是指這樣的脂肪酸，其碳鏈長(zhǎng)度為20或更多個(gè)碳，含有3個(gè)更多個(gè)雙鍵；或者為22個(gè)或更多個(gè)碳，含有3個(gè)更多個(gè)雙鍵(例如，4個(gè)或更多個(gè)雙鍵、5個(gè)或更多個(gè)雙鍵、以及6個(gè)或更多個(gè)雙鍵)。ω-6系列的LC-PUFA包括，例如，但不限于，二-均-γ-亞麻酸(C20:3 n-6)、花生四烯酸(C20:4 n-6)、腎上腺酸(也稱為二十二碳四烯酸或DTA；C22:4 n-6)、和二十二碳五烯酸(C22:5 n-6)。ω-3系列的LC-PUFA包括，例如，但不限于，二十碳三烯酸(C20:3 n-3)、二十碳四烯酸(C20:4 n-3)、二十碳五烯酸(C20:5 n-3)、二十二碳五烯酸(C22:5 n-3)、和二十二碳六烯酸(C22:6 n-3)。LC-PUFA還包括具有多于22個(gè)碳和4個(gè)或更多個(gè)雙鍵的脂肪酸，例如但不限于，C28:8(n-3)。

如本文中使用的術(shù)語“PUFA合酶”或“PFA”是指產(chǎn)生PUFA(例如，LC-PUFA)的酶、以及在系統(tǒng)或復(fù)合物中的這種酶的結(jié)構(gòu)域。術(shù)語PUFA合酶包括，例如但不限于，用于產(chǎn)生PUFA的PUFA PKS系統(tǒng)或PKS-樣系統(tǒng)。本文通過另外的表示法來命名一些特異性PUFA合酶(“裂殖壺菌PUFA合酶”、PFA1、PFA2、和PFA3；例如，來自裂殖壺菌屬物種ATCC登錄號(hào)PTA-9695)。術(shù)語“PUFA合酶系統(tǒng)”是指一種或多種PUFA合酶和能夠影響PUFA合酶的功能的任何異源輔助酶(例如，PPT酶和ACS)。

PPT酶：如本文中使用的術(shù)語“磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶”或“PPT酶”是指這樣的酶，它通過將輔因子(例如，4-磷酸泛酰巰基乙胺)從輔酶A(CoA)轉(zhuǎn)移到PUFA合酶中的一個(gè)或多個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域而激活PUFA合酶。能夠激活本文實(shí)施方案中所用的PUFA合酶的一個(gè)或多個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域的PPT酶的一個(gè)實(shí)例是念珠藻屬物種的HetI蛋白(例如，來自PCC 7120、以前稱為魚腥藻屬物種PCC 7120的HetI)，在本文中命名為“NoHetI”。

ACS：如本文中使用的術(shù)語“脂酰CoA合成酶”、“ACoAS”或“ACS”，是指這樣的酶，它催化長(zhǎng)鏈多不飽和游離脂肪酸(FFA)轉(zhuǎn)化為脂酰CoA。本文的具體實(shí)施方案中采用的來源于裂殖壺菌ATCC登錄號(hào)20888的特異性脂酰CoA合成酶用附加標(biāo)記來稱謂；例如，“SzACS2”。

植物：本文中使用的術(shù)語“植物”包括其任何后代、細(xì)胞、組織、種子、種子油、或部分。

性狀或表型：術(shù)語“性狀”和“表型在本文中可互換使用。為本公開的目的，特別感興趣的性狀包括可以例如在油料作物中表達(dá)的ω-3 LC-PUFA性狀。

功能性食品：如本文中使用的術(shù)語“功能性食品”是指基于一般存在于常規(guī)食品的未改變的源材料中的組分比例的改變、作為平常飲食的一部分消費(fèi)并且具有提高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和/或特殊飲食益處的在外觀上類似于常規(guī)食品的食品。

除非特別指明或暗示，如本文中使用的術(shù)語“一個(gè)”、“一種”和“該”表示“至少一個(gè)/種”。

除非另外特別地解釋，本文中使用的全部技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與屬于本公開的領(lǐng)域之內(nèi)的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義?？梢栽谝韵鲁霭嫖镏邪l(fā)現(xiàn)分子生物學(xué)中常見術(shù)語的定義：例如，Lewin B，Genes V，Oxford University Press，1994(ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew等人(eds.)，The Encyclopedia of Molecular Biology，Blackwell Science Ltd，1994(ISBN0-632-02182-9)；和Meyers R.A.(ed.)，Molecular Biology and Biotechnology:A Comprehensive Desk Reference，VCH Publishers，Inc，1995(ISBN1-56081-569-8)。除非另有說明，所有百分比均以重量計(jì)，所有溶劑混合物比例以體積計(jì)。所有溫度以攝氏度計(jì)。

IV.異源PUFA合酶系統(tǒng)

裂殖壺菌PUFA合酶

本文中的實(shí)施方案包括經(jīng)過遺傳修飾從而表達(dá)PUFA合酶的宿主生物(例如，植物)。在一些實(shí)施方案中，生物經(jīng)過修飾而表達(dá)異源PUFA合酶系統(tǒng)，例如，包含PUFA合酶及其至少一種輔助蛋白的功能性異源蛋白質(zhì)系統(tǒng)。本文中的遺傳修飾在一些實(shí)施方案中也可以用來在以內(nèi)源方式表達(dá)PUFA合酶的宿主生物中提高PUFA的產(chǎn)量。

PUFA合酶系統(tǒng)可包含若干多功能蛋白(并且可包括單功能蛋白)，所述蛋白可一起發(fā)揮作用進(jìn)行脂肪酸鏈的迭代加工以及非迭代加工，包括在選定循環(huán)中的反式-順式異構(gòu)化和烯酰還原反應(yīng)。這些蛋白質(zhì)在本文中被稱為核心PUFA合酶酶系統(tǒng)或核心PUFA合酶。關(guān)于包含在這些蛋白質(zhì)中的結(jié)構(gòu)域和基序的一般信息和詳情可見于，例如：美國(guó)專利6,140,486和6,566,583；美國(guó)專利公開2002/0194641、2004/0235127、和2005/0100995；國(guó)際專利公開WO 2006/135866；和Metz等人,(2001)Science 293:290-3。功能性PUFA合酶結(jié)構(gòu)域可作為單一蛋白質(zhì)出現(xiàn)(例如，結(jié)構(gòu)域和蛋白質(zhì)為同義詞)，或作為單一蛋白質(zhì)中的兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)構(gòu)域之一出現(xiàn)。

本領(lǐng)域已知有眾多具有PUFA合酶活性的多肽的實(shí)例(以及多核苷酸及其編碼基因)，可以在包含本文中公開的異源PUFA合酶的經(jīng)過遺傳修飾的宿主中組合它們。這樣的PUFA合酶蛋白(或結(jié)構(gòu)域)包括細(xì)菌和非細(xì)菌PUFA合酶。非細(xì)菌PUFA合酶可以是真核PFA。某些細(xì)菌PUFA合酶描述例如于美國(guó)專利公開2008/0050505?？僧a(chǎn)生本發(fā)明的遺傳修飾的植物，所述植物將非細(xì)菌PUFA合酶功能結(jié)構(gòu)域與細(xì)菌PUFA合酶功能結(jié)構(gòu)域整合，并整合來自其他PKS系統(tǒng)(例如，I型迭代或模塊化的、II型、和III型)和/或FAS系統(tǒng)的PUFA合酶功能結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)。

在一些實(shí)施方案中，異源PUFA合酶包含選自下組的生物活性結(jié)構(gòu)域，所述生物活性結(jié)構(gòu)域通常包含在三種、四種、或更多種蛋白質(zhì)上：至少一個(gè)烯酰基ACP還原酶(ER)結(jié)構(gòu)域；多個(gè)?；d體蛋白(ACP)結(jié)構(gòu)域(例如，至少一個(gè)到四個(gè)，或至少五個(gè)ACP結(jié)構(gòu)域，并且在一些實(shí)施方案中多達(dá)六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)、或十個(gè)以上ACP結(jié)構(gòu)域)；至少兩個(gè)β酮脂?；鵄CP合酶(KS)結(jié)構(gòu)域；至少一個(gè)?；D(zhuǎn)移酶(AT)結(jié)構(gòu)域；至少一個(gè)β酮脂?；?ACP還原酶(KR)結(jié)構(gòu)域；至少兩個(gè)FabA樣β羥脂?；?ACP脫水酶(DH)結(jié)構(gòu)域；至少一個(gè)鏈長(zhǎng)因子(CLF)結(jié)構(gòu)域；以及至少一個(gè)丙二酰CoA:ACP?；D(zhuǎn)移酶(MAT)結(jié)構(gòu)域。在具體的實(shí)施方案中，異源PUFA合酶還包括含脫水酶保守性活性部位基序的至少一個(gè)區(qū)域。

在一些實(shí)施方案中，異源PUFA合酶系統(tǒng)包括來自破囊壺菌——裂殖壺菌藻的PUFA合酶(例如，PFA1、PFA2、和PFA3)。例如，根據(jù)本文中實(shí)施方案的異源PUFA合酶系統(tǒng)可包括，例如但不限于，至少一種包含與SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:7；和/或SEQ ID NO:14具有至少80％(例如，至少81％；至少82％；至少83％；至少84％；至少85％；至少86％；至少87％；至少88％；至少89％；至少90％；至少91％；至少92％；至少93％；至少94％；至少95％；至少96％；至少97％；至少98％；和至少99％)同一性之氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在具體實(shí)例中，異源PUFA合酶系統(tǒng)包括至少一種含有SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:7；和/或SEQ ID NO:14的蛋白質(zhì)。在具體實(shí)例中，異源PUFA合酶系統(tǒng)包括至少一種具有選自SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:7；和SEQ ID NO:14之氨基酸序列的蛋白質(zhì)。

一些實(shí)施方案包括含有SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:7；和/或SEQ ID NO:14的至少一個(gè)功能等同物的異源PUFA合酶系統(tǒng)。例如，該系統(tǒng)可包括SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:7；和/或SEQ ID NO:14的變體、部分、片段、或衍生物，其中這樣的多肽具有PUFA合酶活性。例如，可以在本領(lǐng)域中可得的文獻(xiàn)和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定其他PUFA合酶多肽的序列(及其編碼基因)。例如，可以通過以已知的PUFA合酶基因或多肽序列對(duì)公眾可訪問的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST搜索來鑒定這樣的序列。在這樣的方法中，同一性可基于使用默認(rèn)參數(shù)的Clustal W比對(duì)方法，所述默認(rèn)參數(shù)為空位罰分＝10，空位長(zhǎng)度罰分＝0.1，和Gonnet 250系列的蛋白質(zhì)權(quán)重矩陣。

另外，本文中公開的PUFA合酶基因或多肽序列可用來鑒定自然界中的其他PUFA合酶同源物。例如，本文中公開的每個(gè)PUFA合酶核酸片段都可用來分離編碼同源蛋白質(zhì)的基因。使用序列依賴性方案分離同源基因是本領(lǐng)域熟知的。序列依賴性方案的實(shí)例包括，例如但不限于：核酸雜交方法；DNA和RNA擴(kuò)增方法，如通過核酸擴(kuò)增技術(shù)的不同用途例示的(例如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、和鏈置換擴(kuò)增(SDA)；以及借助于互補(bǔ)的文庫(kù)構(gòu)建與篩選方法。

在一些實(shí)施方案中，異源PUFA合酶包含裂殖壺菌PUFA合酶結(jié)構(gòu)域(例如、ER結(jié)構(gòu)域、ACP結(jié)構(gòu)域、KS結(jié)構(gòu)域、AT結(jié)構(gòu)域、KR結(jié)構(gòu)域、DH結(jié)構(gòu)域、CLF結(jié)構(gòu)域、MAT結(jié)構(gòu)域、和脫水酶保守性活性部位基序)，其中所述結(jié)構(gòu)域與來自不同的PUFA合酶的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)域結(jié)合而形成具有PUFA合酶活性的完整的PUFA合酶。

在一些實(shí)施方案中，包含異源PUFA合酶的經(jīng)過遺傳修飾的生物可進(jìn)一步用另一種PUFA合酶的至少一個(gè)結(jié)構(gòu)域或其生物活性片段進(jìn)行修飾。在具體的實(shí)施方案中，PUFA合酶的任何結(jié)構(gòu)域可在它們的天然結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上被修飾，以 改變或增強(qiáng)所述結(jié)構(gòu)域在PUFA合酶系統(tǒng)中的功能(例如，改變由所述系統(tǒng)產(chǎn)生的PUFA類型或其比率)。

磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶

磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(PPT酶)是一個(gè)家族的酶，它們涉及脂肪酸合成、聚酮化合物合成、和非核糖體肽合成。具體地說，PUFA合酶酶類中存在的ACP結(jié)構(gòu)域需要通過輔因子(4-磷酸泛酰巰基乙胺)從輔酶A附接到?；d體蛋白(ACP)上而活化。這種輔因子的附接由PPT酶來執(zhí)行。如果宿主生物的內(nèi)源PPT酶不能活化PUFA合酶ACP結(jié)構(gòu)域，就有必要提供能夠執(zhí)行這個(gè)功能的PPT酶。

PPT酶的一個(gè)實(shí)例是念珠藻屬物種的HetI蛋白，其已被證明可識(shí)別ACP結(jié)構(gòu)域作為底物。HetI存在于念珠藻屬的一個(gè)基因簇中，已知該簇基因負(fù)責(zé)這種生物中某些脂肪酸的合成。Black和Wolk(1994)J.Bacteriol.176:2282-92；Campbell等人，(1997)Arch.Microbiol.167:251-8。HetI可能活化該簇中的蛋白質(zhì)HglE的ACP結(jié)構(gòu)域。

在實(shí)施方案中，PUFA合酶系統(tǒng)包括至少一個(gè)PPT酶或4'-磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，作為PUFA合酶的輔助結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)。許多具有PPT酶活性的多肽的實(shí)例在本領(lǐng)域中已知，如果它們能夠活化所使用的特定PUFA合酶的ACP結(jié)構(gòu)域的話，就可用于本文中的遺傳修飾生物。在這樣的異源PUFA合酶系統(tǒng)中可包括的多肽的實(shí)例包括，例如但不限于，包含與由SEQ ID NO:10編碼的多肽(NoHetI蛋白)具有至少80％(例如，至少81％；至少82％；至少83％；至少84％；至少85％；至少86％；至少87％；至少88％；至少89％；至少90％；至少91％；至少92％；至少93％；至少94％；至少95％；至少96％；至少97％；至少98％；和至少99％)同一性的氨基酸序列的至少一種蛋白質(zhì)。在具體的實(shí)例中，異源PUFA合酶系統(tǒng)包括由SEQ ID NO:10編碼的多肽。

一些實(shí)施方案包括含有由SEQ ID NO:10編碼的多肽的功能等同物的異源PUFA合酶系統(tǒng)。例如，該系統(tǒng)可包括由SEQ ID NO:10編碼的多肽的變體、部分、片段、或衍生物，其中這樣的多肽具有磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶活性。例如，可在本領(lǐng)域可得的文獻(xiàn)和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定其他PPT酶的序列(及其編碼基因)。這樣的序列例如可以通過用已知的PPT酶基因或多肽序列對(duì)公眾可訪問的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST搜索來鑒定。在這樣的方法中，同一性可基 于使用默認(rèn)參數(shù)的Clustal W比對(duì)方法，所述默認(rèn)參數(shù)為空位罰分＝10，空位長(zhǎng)度罰分＝0.1，和Gonnet 250系列的蛋白質(zhì)權(quán)重矩陣。本文中公開的PPT酶序列可用來鑒定自然界中的其他PPT酶同源物。例如，本文中的PPT酶核酸(例如，SEQ ID NO:10)可用來分離編碼同源蛋白的基因。

根據(jù)上文，在一些實(shí)施方案中，遺傳修飾生物(例如，植物)和/或其后代、細(xì)胞、組織、或部分包含異源PUFA合酶(例如，來自破囊壺菌裂殖壺菌藻的PUFA合酶)和異源PPT酶(例如，NoHetI PPT酶)。

脂酰CoA合成酶

脂酰CoA合成酶(ACS，或者ACoAS)蛋白催化長(zhǎng)鏈PUFA游離脂肪酸(FFA)轉(zhuǎn)化為脂酰CoA。具有ACoAS活性的多肽的許多實(shí)例在本領(lǐng)域中已知，并可用于本文中的實(shí)施方案。例如，裂殖壺菌屬物種ATCC登錄號(hào)20888具有一種或多種AcoAS，包括由SEQ ID NO:11編碼的多肽(SzACS2蛋白)，它們能夠?qū)⑵銹UFA合酶的游離脂肪酸產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為脂酰CoA。

在一些實(shí)施方案中，異源PUFA合酶系統(tǒng)包括，例如但不限于，至少一種包含與由SEQ ID NO:11編碼的多肽具有至少80％(例如，至少81％；至少82％；至少83％；至少84％；至少85％；至少86％；至少87％；至少88％；至少89％；至少90％；至少91％；至少92％；至少93％；至少94％；至少95％；至少96％；至少97％；至少98％；和至少99％)同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。在具體的實(shí)例中，異源PUFA合酶系統(tǒng)包括由SEQ ID NO:11編碼的多肽。

一些實(shí)施方案包括含有由SEQ ID NO:11編碼的多肽的功能等同物的異源PUFA合酶系統(tǒng)。例如，該系統(tǒng)可包括由SEQ ID NO:11編碼的多肽的變體、部分、片段、或衍生物，其中這樣一種多肽具有脂酰CoA合成酶活性。例如，可在本領(lǐng)域可得的文獻(xiàn)和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出其他ACoAS的序列(及其編碼基因)。這樣的序列例如可以通過用已知的ACoAS基因或多肽序列對(duì)公眾可訪問的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST搜索來鑒定。在這樣的方法中，同一性可基于使用默認(rèn)參數(shù)的Clustal W比對(duì)方法，所述默認(rèn)參數(shù)為空位罰分＝10，空位長(zhǎng)度罰分＝0.1，和Gonnet 250系列的蛋白質(zhì)權(quán)重矩陣。本文中公開的ACoAS序列可用來鑒定自然界中的其他ACoAS同源物。例如，本文中的ACoAS核酸(例如，SEQ ID NO:11)可用來分離編碼同源蛋白的基因。

根據(jù)上文，在一些實(shí)施方案中，遺傳修飾的生物(例如植物)和/或其后代、 細(xì)胞、組織、或部分包含異源PUFA合酶(例如，來自破囊壺菌裂殖壺菌屬物種的PUFA合酶)；異源PPT酶(例如，NoHetI PPT酶)；和異源ACoAS(例如，來自ATCC登錄號(hào)20888的裂殖壺菌ACoAS)。

功能等同物包括但不限于，在參考氨基酸序列(即，SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:7；由SEQ ID NO:10編碼的多肽；由SEQ ID NO:11編碼的多肽；或SEQ ID NO:14)中添加或取代氨基酸殘基，但導(dǎo)致沉默變化，從而產(chǎn)生在功能上等同的基因產(chǎn)物。例如，可以基于涉及的殘基在極性、電荷、可溶性、疏水性、親水性、和/或兩親性方面的相似性來進(jìn)行保守性氨基酸取代。

可以對(duì)PUFA合酶、PPT酶、和/或ACoAS進(jìn)行定點(diǎn)突變(采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的隨機(jī)誘變技術(shù))，并分析所得的突變酶以證實(shí)預(yù)期的活性。例如，可將SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:7；由SEQ ID NO:10編碼的多肽；由SEQ ID NO:11編碼的多肽；或SEQ ID NO:14與同源物和其他相關(guān)蛋白進(jìn)行比對(duì)，其中指明相同的氨基酸殘基和保守性殘基。在可變化的位置處可以構(gòu)建保守性改變以產(chǎn)生保留功能的多肽；所述功能例如，PUFA合酶活性、磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶活性、和脂酰CoA合成酶活性。

本文中的實(shí)施方案通過，例如，提供一種或多種包含編碼異源PUFA合酶系統(tǒng)之至少一個(gè)組分的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因生物(例如，植物)，實(shí)現(xiàn)異源PUFA合酶系統(tǒng)的表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，編碼異源PUFA合酶系統(tǒng)之至少一個(gè)組分的異源多核苷酸包括編碼來自破囊壺菌裂殖壺菌屬物種的PUFA合酶的至少一種多核苷酸。例如，本文中實(shí)施方案的異源多核苷酸可編碼，例如但不限于，包含與SEQ ID NO:1；SEQ ID NO:4；SEQ ID NO:7；和/或SEQ ID NO:14具有至少80％(例如，至少81％；至少82％；至少83％；至少84％；至少85％；至少86％；至少87％；至少88％；至少89％；至少90％；至少91％；至少92％；至少93％；至少94％；至少95％；至少96％；至少97％；至少98％；至少99％；和至少100％)同一性的氨基酸序列的至少一種蛋白質(zhì)。

在一些實(shí)例中，編碼來自破囊壺菌裂殖壺菌屬物種的PUFA合酶的多核苷酸包含與SEQ ID NO:2；SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:5；SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:8；SEQ ID NO:9；和/或SEQ ID NO:13具有至少70％(例如，至少71％；至少72％；至少73％；至少74％；至少75％；至少76％；至少77％；至少78％；至少79％；至少80％；至少81％；至少82％；至少83％；至少84％；至少85％；至 少86％；至少87％；至少88％；至少89％；至少90％；至少91％；至少92％；至少93％；至少94％；至少95％；至少96％；至少97％；至少98％；至少99％；和100％)同一性的核苷酸序列。

在具體的實(shí)例中，編碼來自破囊壺菌——裂殖壺菌屬物種的PUFA合酶的異源多核苷酸在嚴(yán)格條件下(例如，極嚴(yán)格條件)與SEQ ID NO:2和/或SEQ ID NO:3；SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:6；SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、和/或SEQ ID NO:13雜交。

在一些實(shí)施方案中，編碼異源PUFA合酶系統(tǒng)的至少一個(gè)組分的異源多核苷酸包括編碼來自藍(lán)藻細(xì)菌屬——念珠藻屬的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(HetI)的多核苷酸。例如，本文中實(shí)施方案的異源多核苷酸可編碼，例如但不限于，包含與由SEQ ID NO:10編碼的多肽(即，NoHetI)具有至少80％(例如，至少81％；至少82％；至少83％；至少84％；至少85％；至少86％；至少87％；至少88％；至少89％；至少90％；至少91％；至少92％；至少93％；至少94％；至少95％；至少96％；至少97％；至少98％；至少99％；和100％)同一性的氨基酸序列的至少一種蛋白質(zhì)。

在一些實(shí)例中，編碼來自藍(lán)藻細(xì)菌屬——念珠藻屬的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(HetI)的多核苷酸包含與SEQ ID NO:10具有至少70％(例如，至少71％；至少72％；至少73％；至少74％；至少75％；至少76％；至少77％；至少78％；至少79％；至少80％；至少81％；至少82％；至少83％；至少84％；至少85％；至少86％；至少87％；至少88％；至少89％；至少90％；至少91％；至少92％；至少93％；至少94％；至少95％；至少96％；至少97％；至少98％；至少99％；和100％)同一性的核苷酸序列。

在具體實(shí)例中，編碼念珠藻屬磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(NoHetI)的多核苷酸在嚴(yán)格條件下(例如，極嚴(yán)格條件下)與SEQ ID NO:10雜交。

在一些實(shí)施方案中，編碼異源PUFA合酶系統(tǒng)的至少一個(gè)組分的異源多核苷酸包括編碼來自裂殖壺菌的ACoAS的多核苷酸。例如，本文中實(shí)施方案的異源多核苷酸可編碼，例如但不限于，至少一種包含與由SEQ ID NO:11編碼的多肽(即，SzACS2)具有至少80％(例如，至少81％；至少82％；至少83％；至少84％；至少85％；至少86％；至少87％；至少88％；至少89％；至少90％；至少91％；至少92％；至少93％；至少94％；至少95％；至少96％；至少97％；至少98％；至少99％；和100％)同一性的氨基酸序列的蛋白質(zhì)。

在一些實(shí)例中，編碼來自裂殖壺菌(例如，ATCC登錄號(hào)20888)的異源ACoAS的多核苷酸包含與SEQ ID NO:11具有至少70％(例如，至少71％；至少72％；至少73％；至少74％；至少75％；至少76％；至少77％；至少78％；至少79％；至少80％；至少81％；至少82％；至少83％；至少84％；至少85％；至少86％；至少87％；至少88％；至少89％；至少90％；至少91％；至少92％；至少93％；至少94％；至少95％；至少96％；至少97％；至少98％；至少99％；和100％)同一性的核苷酸序列。

在具體實(shí)例中，編碼異源ACoAS的多核苷酸在嚴(yán)格條件下(例如，極嚴(yán)格條件下)與SEQ ID NO:11雜交。

在實(shí)施方案中，編碼異源PUFA合酶的至少一個(gè)組分的一種或多種多核苷酸可以包括編碼來自破囊壺菌——裂殖壺菌屬物種的PUFA合酶至少一種多核苷酸，并且具有或沒有編碼來自藍(lán)藻細(xì)菌屬——念珠藻屬的磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶(HetI)的多核苷酸和/或編碼來自裂殖壺菌屬的ACoAS的異源多核苷酸。在一些實(shí)例中，編碼前述組分的至少一種多核苷酸存在于單個(gè)核酸分子中。在一些實(shí)例中，所述至少一種多核苷酸存在于多個(gè)核酸分子中。

一些實(shí)施方案包括含有編碼異源PUFA合酶的至少一個(gè)組分的一種或多種多核苷酸的載體(例如，質(zhì)粒)。在實(shí)例中，這樣的載體包括與多核苷酸可操作連接的調(diào)節(jié)序列，以實(shí)現(xiàn)所述多核苷酸在靶宿主生物中表達(dá)。這樣的載體的具體實(shí)例包括重組表達(dá)載體，如pDAB101429(SEQ ID NO:15)；pDAB101454(SEQ ID NO:16)；pDAB101496(SEQ ID NO:17)；pDAB109525(SEQ ID NO:18)；pDAB109584(SEQ ID NO:19)；pDAB109588(SEQ ID NO:20)；pDAB112210(SEQ ID NO:21)；pDAB112206(SEQ ID NO:22)；pDAB107962(SEQ ID NO:23)；pDAB109591(SEQ ID NO:24)；pDAB109592(SEQ ID NO:25)；pDAB107960(SEQ ID NO:26)；pDAB110132(SEQ ID NO:27)；pDAB107961(SEQ ID NO:28)；pDAB110151(SEQ ID NO:29)；pDAB112285(SEQ ID NO:30)；pDAB117501(SEQ ID NO:31)；pDAB117502(SEQ ID NO:32)；pDAB112200(SEQ ID NO:33)；pDAB112201(SEQ ID NO:34)；pDAB112203(SEQ ID NO:35)；pDAB112205(SEQ ID NO:36)；pDAB112208(SEQ ID NO:37)；和pDAB112209(SEQ ID NO:38)。

可以在某些實(shí)施方案中使用重組DNA技術(shù)中的已知技術(shù)，例如但不限于，通過操縱多核苷酸在宿主細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)；通過操縱多核苷酸的轉(zhuǎn)錄效率；通 過操縱所得轉(zhuǎn)錄物的翻譯效率；以及通過操縱翻譯后修飾的效率來提高異源多核苷酸的表達(dá)控制。作為進(jìn)一步的實(shí)例，可以對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行基因工程改造，使其與參考啟動(dòng)子相比在宿主中的表達(dá)水平提高。因此，可用于控制核酸分子表達(dá)的技術(shù)包括，例如但不限于，將核酸分子穩(wěn)定整合到一個(gè)或多個(gè)宿主細(xì)胞染色體中，向質(zhì)粒添加載體穩(wěn)定性序列，替換或修飾轉(zhuǎn)錄控制信號(hào)(例如，啟動(dòng)子、操縱基因、和增強(qiáng)子)，替換或修飾翻譯控制信號(hào)(例如，核糖體結(jié)合位點(diǎn)和Shine-Dalgarno序列)，修飾核酸分子使其與宿主細(xì)胞的密碼子利用率相應(yīng)，和刪除導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄物不穩(wěn)定的序列。

V.制造遺傳修飾的生物的方法

為了產(chǎn)生顯著高產(chǎn)量的一種或多種期望的多不飽和脂肪酸，可對(duì)宿主生物(例如，植物)進(jìn)行遺傳修飾，以將異源PUFA合酶系統(tǒng)導(dǎo)入生物中。在一些實(shí)施方案中，利用這種過程來產(chǎn)生包含異源PUFA合酶系統(tǒng)的遺傳修飾植物。一些實(shí)例還包括提高或增加這種遺傳修飾的效果的方法，例如，提高或增加PUFA合酶系統(tǒng)的最終產(chǎn)物(例如LC-PUFA，如DHA和EPA)的產(chǎn)生和/或積累的方法。本文中的具體實(shí)施方案可導(dǎo)致如上文所述的一種或多種裂殖壺菌屬PUFA合酶和PPT酶的表達(dá)，從而增加PUFA在異源宿主中的產(chǎn)生和/或積累。特定的實(shí)施方案還可導(dǎo)致ACS在宿主中表達(dá)。

在遺傳修飾的生物(包括，例如但不限于，植物)中表達(dá)基因的方法在本領(lǐng)域中是已知的。在一些實(shí)施方案中，可針對(duì)目標(biāo)宿主細(xì)胞，對(duì)編碼要表達(dá)的PUFA合酶系統(tǒng)組分的異源多核苷酸的編碼區(qū)進(jìn)行密碼子優(yōu)化。在重組宿主細(xì)胞(包括，例如但不限于，植物細(xì)胞)中的基因表達(dá)可能需要與感興趣編碼區(qū)可操作連接的啟動(dòng)子、和/或轉(zhuǎn)錄終止子。在一些實(shí)施方案中，編碼PUFA合酶系統(tǒng)組分的異源多核苷酸與種子特異性啟動(dòng)子(例如，PvDlec2、LfKCS3、FAE1、BoACP、和BnaNapinC)可操作連接。在一些實(shí)施方案中，編碼PUFA合酶系統(tǒng)組分的異源多核苷酸與葉特異性啟動(dòng)子(例如，泛素和CsVMV)可操作連接?？稍谀承?shí)施方案中使用的啟動(dòng)子的其他非限制性實(shí)例包括?；d體蛋白啟動(dòng)子(國(guó)際專利公開WO 1992/18634)和菜豆β菜豆蛋白啟動(dòng)子(及截短形式)。參見，例如，Slightom等人，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:1897-1901；Sengupta-Gopalan等人，(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.82:3320-4；van der Geest等人，(1997)Plant Mol.Biol.33:553-7；和Bustos等人，(1991)EMBO J.10:1469-79。

一些實(shí)施方案包括含有編碼PUFA合酶系統(tǒng)組分的一種或多種異源多核苷酸的重組載體(例如，質(zhì)粒)。重組載體是工程化的(例如，人工產(chǎn)生的)核酸分子，其用作操縱選擇的核酸序列、和/或?qū)⑦@樣的核酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的工具。因此，重組載體可適合用于克隆、測(cè)序、和/或以別的方式操縱在其中的多核苷酸，例如通過表達(dá)該多核苷酸和/或?qū)⒃摱嗪塑账徇f送到宿主細(xì)胞中形成重組細(xì)胞。載體可含有這樣的核苷酸序列：其在自然條件下不出現(xiàn)在要克隆或遞送的多核苷酸的鄰近。載體還可含有這樣的調(diào)節(jié)性核酸序列(例如，啟動(dòng)子、非翻譯區(qū))：調(diào)節(jié)性核酸序列在自然條件下出現(xiàn)在所述多核苷酸鄰近，或者對(duì)該多核苷酸的表達(dá)有用。整合的多核苷酸可受到染色體啟動(dòng)子的控制、天然或質(zhì)粒啟動(dòng)子的控制、或幾種啟動(dòng)子的聯(lián)合控制。載體可以是RNA或DNA，并且可以是原核的或真核的。載體可作為染色體外元件(例如，質(zhì)粒)維持，或者可以整合到重組生物(例如，微生物、和植物細(xì)胞)的染色體中。完整的載體可保持在宿主細(xì)胞中的適當(dāng)位置，或者在某些條件下，可以刪除外來DNA(例如，不需要的質(zhì)粒序列)，留下編碼PUFA合酶系統(tǒng)組分的一種或多種異源多核苷酸。單個(gè)或多個(gè)異源多核苷酸拷貝可整合到宿主基因組中。本發(fā)明的重組載體可含有至少一種選擇標(biāo)志物。

在一些實(shí)施方案中，包含編碼PUFA合酶系統(tǒng)組分的一種或多種異源多核苷酸的重組載體是表達(dá)載體，例如，植物表達(dá)載體。在這樣的實(shí)施方案中，可以將至少一個(gè)編碼要生成的產(chǎn)物(例如，裂殖壺菌屬PUFA合酶、NoHetI、和SzACS2)的多核苷酸以一定方式插入重組載體中，使得多核苷酸與載體中的調(diào)節(jié)序列可操作連接，使重組宿主細(xì)胞內(nèi)的核酸序列能夠轉(zhuǎn)錄和翻譯?？捎糜谵D(zhuǎn)化多種宿主生物和細(xì)胞的載體是本領(lǐng)域中已知的。通常，載體含有選擇標(biāo)志物、以及允許在期望宿主中自主復(fù)制或染色體整合的序列。

用于宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的適合方法包括任何能將DNA導(dǎo)入細(xì)胞中的方法，如通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(參見，例如，美國(guó)專利5,508,184)，通過干燥/抑制介導(dǎo)的DNA攝取(參見，例如，Potrykus等人.(1985)Mol.Gen.Genet.199:183-8)，通過電穿孔(參見，例如，美國(guó)專利5,384,253)，通過用碳化硅纖維攪拌(參見，例如，美國(guó)專利5,302,523和5,464,765)，通過土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(參見，例如，美國(guó)專利5,563,055；5,591,616；5,693,512；5,824,877；5,981,840；和6,384,301)，以及通過加速DNA包被的顆粒(參見，例如，美國(guó)專利5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861；和6,403,865)。通過應(yīng)用諸如此類的這些技 術(shù)，幾乎任何物種的細(xì)胞都可被穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，包括單子葉植物和雙子葉植物兩者。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)化DNA被整合到宿主細(xì)胞的基因組中。在多細(xì)胞物種的情況下，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可再生為轉(zhuǎn)基因生物。任何這些技術(shù)可用來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉或雙子葉植物，其包含例如在轉(zhuǎn)基因植物基因組中編碼PUFA合酶系統(tǒng)組分的一種或多種異源多核苷酸。

最廣泛使用的將表達(dá)載體導(dǎo)入植物中的方法是基于土壤桿菌的天然轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌是將植物細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化的植物致病性土壤細(xì)菌。根癌土壤桿菌和發(fā)根土壤桿菌的Ti和Ri質(zhì)粒分別攜帶負(fù)責(zé)植物遺傳轉(zhuǎn)化的基因。Ti(腫瘤誘導(dǎo)性)質(zhì)粒含有一個(gè)被稱為T-DNA的大片段，該片段可被轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)化的植物中。Ti質(zhì)粒的另一個(gè)片段，vir區(qū)，負(fù)責(zé)T-DNA的轉(zhuǎn)移。T-DNA區(qū)的邊界為末端重復(fù)序列。在修飾的雙元載體中，已刪除腫瘤誘導(dǎo)基因，利用vir區(qū)的功能來轉(zhuǎn)移與T-DNA邊界序列毗鄰的外來DNA。T區(qū)還可含有選擇標(biāo)志物，用于高效地回收轉(zhuǎn)基因植物和細(xì)胞，以及多克隆位點(diǎn)，用于插入供轉(zhuǎn)移的序列，諸如編碼核酸的dsRNA。

因此，在一些實(shí)施方案中，植物轉(zhuǎn)化載體來源于根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒(參見，例如，美國(guó)專利4,536,475、4,693,977、4,886,937、和5,501,967；以及歐洲專利EP 0 122 791)或發(fā)根土壤桿菌的Ri質(zhì)粒。其他的植物轉(zhuǎn)化載體包括，例如但不限于，由Herrera-Estrella等人，(1983)Nature 303:209-13；Bevan等人，(1983)Nature 304:184-7；Klee等人，(1985)Bio/Technol.3:637-42；以及在歐洲專利EP 0 120 516中所描述的那些載體，以及從任何前述文獻(xiàn)來源的那些載體?？梢孕揎椞烊坏嘏c植物相互作用的其他細(xì)菌，如中華根瘤菌屬、根瘤菌屬、和中慢生根瘤菌屬，以介導(dǎo)到許多各種各樣的植物中的基因轉(zhuǎn)移。通過獲取卸甲Ti質(zhì)粒和適合的雙元載體，可以使這些植物相關(guān)的共生細(xì)菌能夠勝任基因轉(zhuǎn)移。

在提供外源DNA到受體細(xì)胞之后，通常鑒定出轉(zhuǎn)化的細(xì)胞用于進(jìn)一步培養(yǎng)和植物再生。為了提高鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力，可能期望在用來再生轉(zhuǎn)化體的轉(zhuǎn)化載體中采用選擇標(biāo)志物或篩選標(biāo)志物基因，如前文所述的。在采用選擇標(biāo)志物的情況下，通過使細(xì)胞暴露于選擇劑或藥劑，鑒定出在潛在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞群中的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在采用篩選標(biāo)志物的情況下，可針對(duì)期望的標(biāo)志物基因性狀來篩選細(xì)胞。

暴露于選擇劑后存活的細(xì)胞、或者在篩選測(cè)定中已被評(píng)分為陽性的細(xì)胞，可以在支持植物再生的介質(zhì)中進(jìn)行培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，可通過包含其他 物質(zhì)，如生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑來改良任何適合的植物組織培養(yǎng)基(例如，MS和N6培養(yǎng)基)?？蓪⒔M織維持在具有生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的基本培養(yǎng)基上，直到可得到足夠的組織開始植物再生的努力時(shí)為止，或者在重復(fù)輪的手動(dòng)選擇之后，直到組織形態(tài)適合于再生時(shí)為止(例如，至少2周)，然后轉(zhuǎn)移到有助于莖芽形成的介質(zhì)中。定期轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物，直到已經(jīng)出現(xiàn)充分的莖芽形成時(shí)為止。一旦莖芽形成，將它們轉(zhuǎn)移到有助于根形成的介質(zhì)中。一旦形成足夠的根，可將植物轉(zhuǎn)移到土壤中，以便進(jìn)一步生長(zhǎng)和成熟。

為了證實(shí)在再生植物中感興趣核酸分子(例如，編碼PUFA合酶系統(tǒng)組分的異源多核苷酸)的存在，可進(jìn)行多種測(cè)定。這樣的測(cè)定例如包括：分子生物學(xué)測(cè)定，如Southern和northern印跡、PCR、和核酸測(cè)序；生物化學(xué)測(cè)定，如檢測(cè)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的存在，例如通過免疫學(xué)手段(ELISA和/或western印跡)或借助于酶功能；植物部分測(cè)定，如葉或根測(cè)定；和再生的全植物的表型分析。

可例如通過使用對(duì)感興趣核酸分子特異的寡核苷酸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增來分析整合事件。PCR基因分型應(yīng)當(dāng)理解為包括但不限于，來源于分離的宿主植物愈傷組織的基因組DNA的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，所述愈傷組織預(yù)期含有整合到基因組中的感興趣核酸分子，然后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)克隆和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列分析。PCR基因分型方法已得到詳盡描述(例如Rios,G等人，(2002)Plant J.32:243-53)，并可應(yīng)用于來源于任何植物物種(例如，玉米或大豆)或組織類型(包括細(xì)胞培養(yǎng)物)的基因組DNA。

采用依賴于土壤桿菌的轉(zhuǎn)化方法形成的轉(zhuǎn)基因植物一般含有插入一個(gè)染色體中的單個(gè)重組DNA序列。所述單個(gè)重組DNA序列被稱為“轉(zhuǎn)基因事件”或“整合事件”。這樣的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)于插入的外源序列而言是雜合的。在一些實(shí)施方案中，通過含有單個(gè)外源基因序列的獨(dú)立分離的轉(zhuǎn)基因植物與自身(例如T₀植物)有性交配(自交)，可獲得相對(duì)于轉(zhuǎn)基因?yàn)榧兒系霓D(zhuǎn)基因植物，以產(chǎn)生T_l種子。所產(chǎn)生的T_l種子的四分之一相對(duì)于所述轉(zhuǎn)基因是純合的。萌發(fā)T_l種子將產(chǎn)生可測(cè)試雜合性的植物，所述測(cè)試一般使用SNP測(cè)定或熱擴(kuò)增測(cè)定，使得允許在雜合子和純合子之間進(jìn)行區(qū)分(即，接合型測(cè)定)。

除了用重組核酸分子直接轉(zhuǎn)化植物之外，可通過使具有至少一個(gè)轉(zhuǎn)基因事件的第一植物與缺乏這種事件的第二植物雜交來制造轉(zhuǎn)基因植物。例如，可將包含編碼PUFA合酶系統(tǒng)組分的一種或多種異源多核苷酸的重組核酸分子導(dǎo)入易于轉(zhuǎn)化的第一植物品系中而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，其中轉(zhuǎn)基因植物可與第二植 物品系雜交而使多核苷酸滲入到第二植物品系中。

一些實(shí)施方案包括將異源PUFA合酶系統(tǒng)多肽的表達(dá)靶向到宿主的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞器上。例如，在一些實(shí)施方案中，異源PUFA合酶系統(tǒng)的表達(dá)被靶向到植物的質(zhì)體上。多種質(zhì)體靶向序列是本領(lǐng)域中已知的，并且可以在宿主為植物或植物細(xì)胞的實(shí)施方案中使用，其中靶向到質(zhì)體上是期望的。在一些實(shí)施方案中，異源PUFA合酶系統(tǒng)的表達(dá)被靶向到細(xì)胞質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，脂酰-CoA合成酶(ACoAS)在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，以將LC-PUFA游離脂肪酸轉(zhuǎn)化為脂酰-CoA，脂酰-CoA進(jìn)而被?；D(zhuǎn)移酶利用。在一些實(shí)施方案中，異源PUFA合酶系統(tǒng)的表達(dá)被靶向到植物的質(zhì)體和細(xì)胞質(zhì)兩者。

具體的實(shí)施方案包括將至少一種裂殖壺菌屬PUFA合酶與NoHetI PPT酶一道靶向到細(xì)胞器(例如，靶向到植物中的質(zhì)體或葉綠體)的應(yīng)用。位于各種蛋白質(zhì)的氨基端的信號(hào)序列控制基因產(chǎn)物靶向到質(zhì)體或葉綠體，這種信號(hào)序列在導(dǎo)入(import)的過程中被切除，從而產(chǎn)生成熟蛋白。參見，例如，Comai等人，(1988)J.Biol.Chem.263:15104-9。為了將異源產(chǎn)物導(dǎo)入葉綠體中，可以將這些信號(hào)序列融合到異源基因產(chǎn)物上。van den Broeck等人，(1985)Nature313:358-63。例如，可以從編碼RUBISCO蛋白、CAB蛋白、EPSP合酶、EPSP合酶、GS2蛋白、和許多其他已知的葉綠體定位蛋白質(zhì)的cDNA分離出編碼適當(dāng)信號(hào)序列的DNA。

在具體實(shí)施方案中采用的將基因定位到葉綠體或質(zhì)體的替代手段包括葉綠體或質(zhì)體轉(zhuǎn)化?？梢援a(chǎn)生在其中僅僅葉綠體DNA被改變?yōu)榻Y(jié)合異源PUFA合酶系統(tǒng)多肽的重組植物。在葉綠體中起作用的啟動(dòng)子是本領(lǐng)域中已知的。Hanley-Bowden等人，(1987)Trends in Biochem.Sci.12:67-70。用于獲得含有在其中已經(jīng)插入異源DNA的葉綠體的細(xì)胞的方法和組合物描述于，例如，美國(guó)專利5,693,507和5,451,513中。

重組宿主的前述遺傳操作可使用標(biāo)準(zhǔn)遺傳技術(shù)和篩選來實(shí)施，并且可以在任何適合于遺傳操作的宿主細(xì)胞中進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，重組宿主是高等植物，包括雙子葉植物和單子葉植物兩者，以及消費(fèi)性植物，包括使用其油脂的作物和植物。因此，可以選擇如以下進(jìn)一步描述的任何植物物種或植物細(xì)胞。

VI.轉(zhuǎn)基因植物

任何表達(dá)異源PUFA合酶系統(tǒng)，例如包含PUFA合酶及其至少一種輔助蛋白的功能性異源蛋白質(zhì)系統(tǒng)，的植物或植物細(xì)胞都被包括在本文具體的實(shí)施方案中。具體的實(shí)施方案包括含有編碼裂殖壺菌屬PUFA合酶的異源多核苷酸與編碼NoHetI PPT酶的多核苷酸的植物細(xì)胞，其中植物細(xì)胞還可含有編碼裂殖壺菌屬ACoAS的多核苷酸。在一些實(shí)例中，這樣的轉(zhuǎn)基因植物已被進(jìn)一步遺傳修飾，以表達(dá)另一種多肽(例如，ACoAS、GPAT、LPAAT、DAGAT、和乙酰CoA羧化酶(ACCase))，以便改善宿主對(duì)PUFA或PUFA合酶的其他生物活性產(chǎn)物的產(chǎn)生和/或累積。

在一些實(shí)施方案中，遺傳修飾的植物(和/或其植物細(xì)胞)選自例如但不限于：高等植物；雙子葉植物；單子葉植物；可消費(fèi)植物(例如，使用其油脂的作物和植物)；大豆；油菜籽；亞麻子；玉米；紅花；向日葵；煙草；豆科植物(豆科(Leguminosae)、豆科(legume family)、豆科(pea family)、豆科(bean family)、豆科(pulse family)；大豆屬植物(例如，變白大豆(G.albicans)、G.aphyonota、沙生大豆(G.arenari)、G.argyrea、灰毛大豆(G.canescens)、澎湖大豆(G.clandestine)、彎莢大豆(G.curvata)、彎裂片大豆(G.cyrtoloba)、鐮莢大豆(G.falcate)、G.gracei、硬毛莖大豆(G.hirticaulis)、G.hirticaulis subsp.leptosa、乳綠大豆(G.lactovirens)、寬葉大豆(G.latifolia)、紫色大豆(G.latrobeana)、小葉大豆(G.microphylla)、G.montis-douglas、G.peratosa、G.pescadrensis、新擬大豆(G.pindanica)、G.pullenii、G.rubiginosa、G.stenophita、G.syndetika、煙豆(G.tabacina)、短絨野大豆(G.tomentella)、野生大豆(G.soja)、和大豆(G.max)(黃豆)；花生；菜豆(Phaseolus vulgaris)、蠶豆(Vicia faba)；以及豌豆(Pisum sativum)。

在一些實(shí)施方案中，遺傳修飾的植物為已知產(chǎn)生用作藥劑、調(diào)味劑、營(yíng)養(yǎng)劑、功能性食物成分或化妝品活性劑的化合物的植物，或經(jīng)過基因工程改造以產(chǎn)生這些化合物/作用劑的植物。

在一些實(shí)施方案中，遺傳修飾的植物為油料植物，其中油料種子、和/或來自油料種子的油含有異源PUFA合酶系統(tǒng)所產(chǎn)生的LC-PUFA。在具體的實(shí)施方案中，這樣的油含有可檢出量的至少一種目標(biāo)或主要的(primary)LC-PUFA，所述LC-PUFA為PUFA合酶的產(chǎn)物(例如，DHA和EPA)。在一些實(shí)施方案中，這樣的油可以基本上不含這樣的中間產(chǎn)物或副產(chǎn)物：所述中間產(chǎn)物或副產(chǎn)物不是目標(biāo)或主要的PUFA產(chǎn)物，并且在自然狀態(tài)下并非由野生型植物中的內(nèi)源FAS系統(tǒng)產(chǎn)生(例如，野生型植物經(jīng)由FAS系統(tǒng)產(chǎn)生一些較短鏈的或中鏈的PUFA，如18碳PUFA，但是由于異源PUFA合酶的遺傳修飾，該植物中會(huì)有新的或另外的脂肪酸)。

在一些實(shí)施方案中，表達(dá)本文中描述的異源PUFA合酶系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植物或種子也可在其基因組中包含至少一個(gè)其他的轉(zhuǎn)基因事件，包括但不限于：編碼殺蟲蛋白(例如，蘇云金芽孢桿菌殺蟲蛋白)的基因；耐除草劑基因(例如，提供草甘膦耐受性的基因)；以及促成轉(zhuǎn)基因植物中的期望表型的基因，所述期望表型例如產(chǎn)量增加、脂肪酸代謝改變、或細(xì)胞質(zhì)雄性不育的恢復(fù)。在具體的實(shí)施方案中，編碼至少一種裂殖壺菌屬PUFA合酶的多核苷酸與此類另外的轉(zhuǎn)基因的組合是通過重組DNA技術(shù)，或通過與已經(jīng)包含該另外轉(zhuǎn)基因的植物進(jìn)行常規(guī)育種而實(shí)現(xiàn)的。

在一些實(shí)施方案中還包括表達(dá)如本文中描述的異源PUFA合酶系統(tǒng)的植物部分。這樣的植物部分包括任何植物部分，例如但不限于，種子(包括成熟種子和未成熟種子)；組織；花粉；胚；花；果實(shí)；莖芽；葉；根；莖；和外植體。具體的實(shí)施方案包括表達(dá)如本文中描述的異源PUFA合酶系統(tǒng)的植物后代。

VII.商業(yè)產(chǎn)品

本文實(shí)施方案包括本文描述的植物、后代、植物部分、或細(xì)胞所產(chǎn)生或來源的產(chǎn)品，包括，例如但不限于從其產(chǎn)生的油類。因此，一些實(shí)施方案包括含有一種或多種本文描述的異源PUFA合酶系統(tǒng)的多肽和/或多核苷酸的商業(yè)產(chǎn)品，其中所述商業(yè)產(chǎn)品是從表達(dá)異源PUFA合酶系統(tǒng)的重組植物或種子產(chǎn)生的。含有一種或多種本文描述的異源PUFA合酶系統(tǒng)的多肽和/或多核苷酸的商業(yè)產(chǎn)品包括，例如但不限于：含有一種或多種多肽和/或多核苷酸的重組植物或種子的粕、油類、碾碎的或完整的籽?；蚍N子，以及任何包含粕、油類、或碾碎的或完整的籽粒的食品。在本文考慮到的一種或多種植物商業(yè)產(chǎn)品或植物商業(yè)產(chǎn)品中檢出含有本文描述的異源PUFA合酶系統(tǒng)的多肽和/或多核苷酸，則事實(shí)上證明該商業(yè)產(chǎn)品或商業(yè)產(chǎn)品由表達(dá)所述異源PUFA合酶系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植物構(gòu)成。例如，若在油中檢出本文描述的異源PUFA合酶系統(tǒng)的多肽和/或多核苷酸的污染，則事實(shí)上證明該油是表達(dá)異源PUFA合酶系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生的。

本文中的實(shí)施方案通過利用異源PUFA合酶系統(tǒng)開發(fā)出遺傳修飾植物，這這些植物產(chǎn)生該植物物種原本不產(chǎn)生的PUFA，使得產(chǎn)生富含一種或多種期望的(目標(biāo)或主要)PUFA的商業(yè)上有價(jià)值的脂質(zhì)成為可能。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的遺傳修飾的生物產(chǎn)生一種或多種多不飽和脂肪酸，包括但不限于EPA(C20:5，n-3)、DHA(C22:6，n-3)、DPA(C22:5，n-6或n-3)、及其任何組合。本文中的一些實(shí)施方案特別地包括獲自包含這些PUFA的如本文描述的遺傳修飾植物的油料種子和油。

尚未知曉有植物內(nèi)源性地含有PUFA合酶，因此，本文中的實(shí)施方案為人們提供了培育具有獨(dú)特的脂肪酸產(chǎn)生能力的植物的機(jī)會(huì)。一些實(shí)施方案可幫助人們創(chuàng)造各種各樣的“設(shè)計(jì)師油”，這些油包含由來自植物的不同形式的脂肪酸以各種比例配合的新穎組合。在一些實(shí)施方案中，應(yīng)用本文中描述的異源PUFA合酶系統(tǒng)可擴(kuò)展PUFA生產(chǎn)的范圍，并且能夠在大多數(shù)作物的種植溫度范圍內(nèi)成功地產(chǎn)生這樣的PUFA。

在一些實(shí)施方案中，植物商業(yè)產(chǎn)品“基本上不含”PUFA合成系統(tǒng)的中間產(chǎn)物或副產(chǎn)物。如在本文中的該語境中使用的，術(shù)語“基本上不含”意指由于異源PUFA系統(tǒng)的導(dǎo)入或存在，在遺傳修飾的植物(和/或植物部分和/或種子油部分)中產(chǎn)生的任何中間產(chǎn)物或副產(chǎn)物脂肪酸(非目標(biāo)PUFA)(例如，不為野生型植物或用作指示的遺傳修飾的受體的親本植物所產(chǎn)生的脂肪酸)存在的量為，例如但不限于：按總脂肪酸的重量計(jì)小于10％；按總脂肪酸的重量計(jì)小于9％；按總脂肪酸的重量計(jì)小于8％；按總脂肪酸的重量計(jì)小于7％；按總脂肪酸的重量計(jì)小于6％；按總脂肪酸的重量計(jì)小于5％；按總脂肪酸的重量計(jì)小于4％；按總脂肪酸的重量計(jì)小于3％；按總脂肪酸的重量計(jì)小于2％；按總脂肪酸的重量計(jì)小于1％；以及按總脂肪酸的重量計(jì)小于0.5％。

在一些實(shí)施方案中，表達(dá)異源PUFA合酶系統(tǒng)的遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分，或從遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分獲得的油或種子，包含可檢出量的DHA(二十二碳六烯酸(C22:6，n-3))、DPA(n-6)(二十二碳五烯酸(C22:5，n-6))、和/或EPA(二十碳五烯酸(C20:5，n-3))。

在具體的實(shí)施方案中，表達(dá)異源PUFA合酶系統(tǒng)的遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分，或從遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分獲得的油或種子包含，例如但不限于，按總脂肪酸的重量計(jì)至少0.01％、至少0.02％、至少0.03％、至少0.04％、至少0.05％、至少0.06％、至少0.07％、至 少0.08％、至少0.09％、至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少5.5％、至少6％、至少6.5％、至少7％、至少7.5％、至少8％、至少8.5％、至少9％、至少9.5％、至少10％、至少10.5％、至少11％、至少11.5％、至少12％、至少12.5％、至少13％、至少13.5％、至少14％、至少14.5％或至少15％的DHA?？稍谌魏芜@些值之間選擇有用的范圍，例如，按總脂肪酸的重量計(jì)0.01％到15％、0.05％到10％以及1％到5％的DHA。

在具體的實(shí)施方案中，表達(dá)異源PUFA合酶系統(tǒng)的遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分，或從遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分獲得的油或種子包含，例如但不限于，按總脂肪酸的重量計(jì)至少0.01％、至少0.02％、至少0.03％、至少0.04％、至少0.05％、至少0.06％、至少0.07％、至少0.08％、至少0.09％、至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少5.5％、至少6％、至少6.5％、至少7％、至少7.5％、至少8％、至少8.5％、至少9％、至少9.5％、和/或至少10％的EPA?？稍谌魏芜@些值之間選擇有用的范圍，例如，按總脂肪酸的重量計(jì)0.01％到10％、0.05％到5％以及0.1％到5％的EPA。

在具體的實(shí)施方案中，表達(dá)異源PUFA合酶系統(tǒng)的遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分，或從遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分獲得的油或種子包含，例如但不限于，按總脂肪酸的重量計(jì)至少0.01％、至少0.02％、至少0.03％、至少0.04％、至少0.05％、至少0.06％、至少0.07％、至少0.08％、至少0.09％、至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、至少4％、至少4.5％、至少5％、至少5.5％、至少6％、至少6.5％、至少7％、至少7.5％、至少8％、至少8.5％、至少9％、至少9.5％、和/或至少10％的DPA(n-6)?？稍谌魏芜@些值之間選擇有用的范圍，例如，按總脂肪酸的重量計(jì)0.01％到10％、0.01％到5％、0.01％到1％、0.01％到0.05％、0.05％到5％以及0.1％到5％的DPA(n-6)。

除非另有說明，PUFA的百分比量為按提取的總脂肪酸的重量計(jì)的百分比。在一些實(shí)施方案中，通過脂肪酸甲酯(FAME)制備物的氣相色譜(GC)分析測(cè)定 總脂肪酸，但總脂肪酸的測(cè)定并不限于這種方法。

在具體的實(shí)施方案中，表達(dá)異源PUFA合酶系統(tǒng)的遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分，或從遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分獲得的油或種子包含的EPA:DHA為，例如但不限于，按總脂肪酸的重量計(jì)至少10:1、至少9.5:1、至少9:1、至少8.5:1、至少8:1、至少7.5:1、至少7:1、至少6.5:1、至少6:1、至少5.5:1、至少5:1、至少4.5:1、至少4:1、至少3.5:1、至少3:1、至少2.5:1、至少2:1、至少1.5:1、至少1:1、至少1:1.5、至少1:2、至少1:2.5、至少1:3、至少1:3.5、至少1:4、至少1:4.5、至少1:5、至少1:5.5、至少1:6、至少1:6.5、至少1:7、至少1:7.5、至少1:8、至少1:8.5、至少1:9、至少1:10、至少1:11、至少1:12、至少1:13、至少1:14、至少1:15、至少1:16、至少1:17、至少1:18、至少1:19、至少1:20、至少1:21、至少1:22、至少1:23、至少1:24、至少1:25、至少1:26、至少1:27、至少1:28、至少1:29、或至少1:30?？稍谌魏芜@些值之間選擇有用的范圍，例如，按總脂肪酸的重量計(jì)10:1、5:1到1:1、2:1到1:1、1到1:30、1:1到1:25、1:1到1:20、1:1到1:15、1:1到1:10、1:1到1:5、1:1到1:3、以及1:1到1:2的EPA:DHA比率。

在具體的實(shí)施方案中，表達(dá)異源PUFA合酶系統(tǒng)的遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分，或從遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分獲得的油或種子包含的DPA(n-6):DHA的比率為，例如但不限于，按總脂肪酸的重量計(jì)至少1:1、至少1:1.5、至少1:2、至少1:2.5、至少1:3、至少1:3.5、至少1:4、至少1:4.5、至少1:5、至少1:5.5、至少1:6、至少1:6.5、至少1:7、至少1:7.5、至少1:8、至少1:8.5、至少1:9、或至少1:10。可在任何這些值之間選擇有用的范圍，例如，按總脂肪酸的重量計(jì)1:1到1:10、1:1到1:5、1:1到1:3和1:1到1:2的DPA(n-6):DHA比率。

在具體的實(shí)施方案中，表達(dá)異源PUFA合酶系統(tǒng)的遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分，或從遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分獲得的油或種子，包含例如但不限于：按油的重量計(jì)至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或至少99％的甘油三酯。在一些實(shí)施方案中，從本發(fā)明的遺傳修飾的植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分或種子獲得的油包含按油的重量計(jì)70％到99％的甘油三酯、按油的重量計(jì)75％到99％的甘油三酯、按油的重量計(jì)80％到99％的甘油三酯、按油的重量計(jì)85％到99％的甘油三酯、或按油的重量計(jì)90％到99％的甘油三酯。這樣的甘油三酯可包含 由異源PUFA合酶系統(tǒng)產(chǎn)生的LC-PUFA。

在具體的實(shí)施方案中，當(dāng)異源PUFA合酶系統(tǒng)的目標(biāo)產(chǎn)物是LC-PUFA，諸如DHA、DPA(n-6或n-3)、或EPA等時(shí)，不以顯著量存在于表達(dá)該系統(tǒng)的遺傳修飾的植物的總脂質(zhì)中的中間產(chǎn)物和副產(chǎn)物包括，例如但不限于：γ-亞麻酸(GLA；18:3,n-6)；十八碳四烯酸(STA或SDA；18:4,n-3)；二高-γ-亞麻酸(DGLA或HGLA；20:3,n-6)、花生四烯酸(ARA,C20:4,n-6)；二十碳三烯酸(ETA,20:3,n-9)，以及不同的其他中間產(chǎn)物或副產(chǎn)物，如20:0；20:1(Δ5)；20:1(Δ11)；20:2(Δ8,11)；20:2(Δ11,14)；20:3(Δ5,11,14)；20:3(Δ11,14,17)；米德酸(20:3；Δ5,8,11)；或20:4(Δ5,1,14,17)。

在一些實(shí)施方案中，通過純化過程從表達(dá)異源PUFA合酶系統(tǒng)的遺傳修飾的植物回收由所述系統(tǒng)產(chǎn)生的PUFA，所述純化過程從所述植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分提取化合物。在一些實(shí)施方案中，通過收獲所述植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分回收PUFA。在一些實(shí)施方案中，通過從所述植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分(例如，從油料種子)收獲油而回收PUFA。在一些實(shí)施方案中，所述植物、其后代、細(xì)胞、組織、或部分以其天然狀態(tài)被消費(fèi)，或者被進(jìn)一步加工成可消費(fèi)產(chǎn)品。

在本文的一些實(shí)施方案中，來自表達(dá)異源PUFA合酶系統(tǒng)的遺傳修飾植物的油可以在非烹調(diào)或非膳食過程和組合物中使用。這些用途包括工業(yè)、化妝品、或醫(yī)療行業(yè)等(例如，這些油可用于抗感染的保護(hù)性屏障中，以及用來提高移植物存活率(美國(guó)專利6,210,700))。來自表達(dá)異源PUFA合酶系統(tǒng)的遺傳修飾植物的油還可用于本發(fā)明的油適合的任何應(yīng)用中。一般而言，這些油可用來替代，例如，在多種應(yīng)用中的礦物油、酯類、脂肪酸、或動(dòng)物脂肪，如潤(rùn)滑劑、潤(rùn)滑添加劑、金屬加工液、液壓流體和阻燃液壓流體。這些油還可用作生產(chǎn)改性油過程中的材料。用于改性油的技術(shù)的實(shí)例包括，分餾、氫化、改變油的油酸或亞麻酸含量、以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他改性技術(shù)。

來自表達(dá)異源PUFA合酶系統(tǒng)的遺傳修飾植物的油的化妝品用途的實(shí)例包括：用作化妝品組合物中的軟化劑；用作凡士林替代品；用作肥皂的組成部分、用作生產(chǎn)肥皂過程中的材料；用作口服治療溶液的組成部分；用作衰老治療組合物的組成部分；以及用作皮膚或發(fā)用泡沫氣霧劑的組成部分。

提供以下實(shí)施例以展示某些具體特征和/或?qū)嵤┓桨?。不?yīng)將這些實(shí)施例解釋為將本公開限制為所例示的具體特征或?qū)嵤┓桨浮?/p>

實(shí)施例

實(shí)例1：材料和方法

除非另外指明，通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行后續(xù)實(shí)施例中描述的分子生物學(xué)和生物化學(xué)操作，所述方法公開于，例如，Ausubel等人，(1995)Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons；Sambrook等人，(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press；等等。

植物優(yōu)化的多核苷酸。

設(shè)計(jì)并合成了具有芥花密碼子偏好的多個(gè)DNA序列，以便在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生PUFA合酶蛋白。從保存在GenBank(可在互聯(lián)網(wǎng)上ncbi.nlm.nih.gov訪問)中的序列獲得蛋白質(zhì)編碼序列，根據(jù)該編碼序列計(jì)算芥花(歐洲油菜L.)的密碼子使用表。省略任何使用低于該氨基酸的密碼子總使用量約10％的同義密碼子之后，計(jì)算出重標(biāo)的(rescaled)芥花密碼子集。使用下列公式計(jì)算針對(duì)每一個(gè)密碼子的重設(shè)表示：

C1的重標(biāo)％＝1/(％C1+％C2+％C3…)x％C1 x 100,

其中C1為討論中的密碼子，％C1、％C2、和％C3…代表剩余同義密碼子的原始％使用值。

為了推導(dǎo)編碼SEQ ID NO:1的PFA1蛋白、SEQ ID NO:4的PFA2蛋白、和SEQ ID NO:7的PFA3蛋白的氨基酸的芥花密碼子優(yōu)化的DNA序列，針對(duì)以實(shí)驗(yàn)確定的(天然的)PFA1 DNA序列(SEQ ID NO:2)、PFA2 DNA序列(SEQ ID NO:5)、和PFA3 DNA序列(SEQ ID NO:8)進(jìn)行密碼子置換，使得所得的DNA序列具有芥花優(yōu)化的密碼子偏好表的總體密碼子組成。

進(jìn)一步精修序列，以消除不期望的限制酶識(shí)別位點(diǎn)、潛在的植物內(nèi)含子剪接位點(diǎn)、A/T或C/G殘基的長(zhǎng)段、以及可能干擾編碼區(qū)在植物細(xì)胞中的mRNA穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄或翻譯的其他基序。進(jìn)行其他改變以導(dǎo)入期望的限制酶識(shí)別位點(diǎn)，以及消除長(zhǎng)的內(nèi)部開放閱讀框(除+1之外的框)。進(jìn)行這些改變時(shí)均遵守約束，即保留芥花偏好的重標(biāo)密碼子組成。合成了包含所得的芥花密碼子優(yōu)化的DNA核苷酸序列的多核苷酸。表1。

表1.密碼子優(yōu)化的序列

脂質(zhì)提取與分析

通過FAME分析法對(duì)分離的種子進(jìn)行分析，以鑒定包含LC-PUFA的轉(zhuǎn)基因植物事件(從大豆、芥花、和擬南芥獲得)，與在相同條件下培養(yǎng)的對(duì)照植物進(jìn)行比較。將LC-PUFA含量(按重量計(jì)％FAME)定量并將其與陰性對(duì)照植物進(jìn)行比較。對(duì)單個(gè)種子進(jìn)行FAME分析，或在來自每個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)基因事件的成批種子進(jìn)行FAME分析，測(cè)定采用下文描述的方法進(jìn)行。

擬南芥和芥花種子分析。使用鋼球磨，在含有作為三酰基甘油內(nèi)標(biāo)的十七碳酸三甘油酯(Nu-Chek^TM Prep，Elysian，MN)的庚烷中將轉(zhuǎn)基因種子樣品(單一的芥花種子或批量擬南芥種子樣品)均質(zhì)化。在均質(zhì)化之前，加入0.25M的新鮮配制的甲醇鈉(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)甲醇溶液。在40℃在不斷振搖下進(jìn)行提取和衍生化。FAME提取重復(fù)三次，并在分析之前合并庚烷層。擬南芥和芥花種子批量分析分別包括10mg等份的擬南芥或8-12粒芥花種子。為了促使衍生化反應(yīng)完成，首先用庚烷將來自批量芥花種子和單一大豆種子的油提取三次。然后，取一等份合并的油提取物在FAME中衍生化。在第四次提取/衍生化中檢測(cè)內(nèi)源FAME的存在，以核實(shí)反應(yīng)的完成。使用Agilent 6890氣相色譜儀(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)和SGE(Austin，TX)產(chǎn)的毛細(xì)管柱BPX 70^TM(15m x 0.25mm x 0.25μm)，通過GC-FID分析所得的FAME。根據(jù)保留時(shí)間鑒別每種FAME，并通過注射添加有適當(dāng)?shù)拈L(zhǎng)鏈脂肪酸(Nu-Chek Prep，Elysian MN)的菜籽油參考混合物(作為校正標(biāo)準(zhǔn)品，產(chǎn)自Matreya LLC(Pleasant Gap，PA))對(duì)FAME定量。下文描述了在擬南芥、大豆、和芥花中產(chǎn)生DHA和其他LC-PUFA的結(jié)果。

實(shí)例2：PUFA合酶基因在植物中的表達(dá)

構(gòu)建含有植物轉(zhuǎn)錄單位(PTU)的雙元載體，這些植物轉(zhuǎn)錄單位包含天然的 和密碼子優(yōu)化的PUFA合酶系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因(PFA1、PFA2、和PFA3)，與啟動(dòng)子和3’-UTR可操作連接。所得的雙元載體還包括一個(gè)包含與啟動(dòng)子和3’-UTR可操作連接的HetI轉(zhuǎn)基因的PTU。僅有一個(gè)雙元載體包含與啟動(dòng)子和3’-UTR可操作連接的SzACS2轉(zhuǎn)基因(pDAB101429)。將啟動(dòng)子和3’-UTR序列的不同組合納入雙元載體中，以驅(qū)動(dòng)PUFA合酶系統(tǒng)和HetI轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。在PTU的設(shè)計(jì)中采用這些不同的調(diào)節(jié)基因元件是為了改變和變化轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平。同樣，將PTU以不同的取向定位在雙元載體中，以測(cè)試PTU的取向是否改變或變化了轉(zhuǎn)基因的表達(dá)水平。

測(cè)試了三種不同的PTU取向。包含以第一種取向布置的PTU的雙元載體是頭對(duì)尾構(gòu)型。

包含以第二種取向布置的PTU的雙元載體是利用3’UTR的雙方向性來構(gòu)建的。PFA1和HetI PTU共享一個(gè)3’UTR，并以下列構(gòu)型取向：?jiǎn)?dòng)子::感興趣基因::3’UTR::感興趣基因::啟動(dòng)子。同樣，PFA3和PFA2 PTU共享一個(gè)3’UTR，并以下列構(gòu)型取向：?jiǎn)?dòng)子::感興趣基因::3’UTR::感興趣基因::啟動(dòng)子。

最后，第三種取向納入了一個(gè)隨機(jī)DNA間隔序列(SEQ ID NO:12)。該DNA間隔區(qū)定位在兩個(gè)朝向隨機(jī)DNA間隔區(qū)上游的PTU和兩個(gè)朝向該隨機(jī)DNA間隔區(qū)下游的PTU之間。這兩組PTU均以構(gòu)建為頭對(duì)頭取向。相應(yīng)地，取向如下：←PFA1 PTU::HetI PTU→::隨機(jī)DNA間隔區(qū)::←PFA3 PTU::PFA 2 PTU→。

第一種取向

pDAB101429.pDAB101429質(zhì)粒(SEQ ID NO:15)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)脂酰CoA合成酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有截短的菜豆植物凝集素L基因啟動(dòng)子(Dlec2啟動(dòng)子v2；GenBank登錄號(hào)X06336)，擬南芥AT2S3基因5'非翻譯區(qū)(2S 5'UTR；GenBank登錄號(hào)M_118850)、裂殖壺菌屬物種多不飽和脂肪酸合酶PFA1 v2和擬南芥2S白蛋白基因3'非翻譯區(qū)終止子v1(At2S SSP終止子v1；GenBank登錄號(hào)M22035)。第二PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2、2S 5'UTR、裂殖壺菌屬物種多不飽和脂肪酸合酶PFA2 v2、和At2S SSP終止子v1。第三PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2、2S 5'UTR、裂殖壺菌屬物種多不飽和脂肪酸合酶PFA3 v2、和At2S SSP終止子v1。脂酰CoA合成酶PTU 含有PvDlec2啟動(dòng)子v2、2S 5'UTR、裂殖壺菌屬物種脂酰CoA合成酶(SzACS-2v3)和At2S SSP終止子v1。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2、2S 5'UTR、念珠藻屬物種4'磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶HetI(NoHetI v3)和At2S SSP終止子v1。這五個(gè)PTU以頭對(duì)尾取向置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體(pDAB7333)的T鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)?；虻捻樞?yàn)椋篜FA1 v2、PFA2 v2、PFA3 v2、SzACS-2 v3、NoHetI v3。植物轉(zhuǎn)化雙元載體含有膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU:木薯葉脈花葉病毒啟動(dòng)子(CsVMV啟動(dòng)子v2；Verdaguer等人，Plant Molecular Biology 31:1129-1139；1996)、膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT v5；Wohlleben等人，Gene 70:25-37；1988)和根癌土壤桿菌ORF1 3’非翻譯區(qū)(AtuORF1 3'UTR v4；Huang等人，J.Bacteriol.172:1814-1822；1990)，以及過驅(qū)動(dòng)(Overdrive)(Toro等人，PNAS 85(22):8558-8562；1988)和T-鏈邊界序列(T-DNA邊界A和T-DNA邊界B；Gardner等人，Science 231:725–727；1986以及國(guó)際公開No.WO 2001/025459 A1)等其他調(diào)節(jié)元件。分離重組質(zhì)粒，并通過限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試PTU是否摻入。

pDAB101454.pDAB101454質(zhì)粒(SEQ ID NO:16)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA1 v2；和At2S SSP終止子v1。第二PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA2 v2；和At2S SSP終止子v1。第三PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA3 v2；和At2S SSP終止子v1。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；NoHetI v3；和At2S SSP終止子v1。上述這四個(gè)PTU以頭對(duì)尾取向置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)?；虻捻樞?yàn)椋篜FA1 v2、PFA2 v2、PFA3 v2、NoHetI v3。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有PTU摻入。

pDAB101496.pDAB101496質(zhì)粒(SEQ ID NO:17)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA1 v2；和At2S SSP終止子v1。第二PUFA合酶PTU含有PvPhas啟動(dòng)子v4；PvPhas 5’UTR；裂殖壺菌屬物種PFA2 v2；和根癌土壤桿菌Ti質(zhì)粒pTi15955開放閱讀框23/24 3'非翻譯區(qū)(AtuORF23 3’-UTR v1GenBank登錄號(hào)AF242881.1)。 第三PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA3v3(SEQ ID NO:13，其編碼多肽SEQ ID NO:14)；和At2S SSP終止子v1。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有PvPhas啟動(dòng)子v5；PvPhas 5’UTR；NoHetI v3；和AtuORF23 3’-UTR v1。這四個(gè)PTU以頭對(duì)尾取向置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)?；虻捻樞?yàn)椋篜FA1 v2、PFA2 v2、PFA3 v3、NoHetI v3。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有PTU摻入。

pDAB109525.pDAB109525質(zhì)粒(SEQ ID NO:18)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA1 v1；和At2S SSP終止子v1。第二PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA2 v1；和At2S SSP終止子v1。第三PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA3 v3；和At2S SSP終止子v1。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；NoHetI v3；和At2S SSP終止子v1。這四個(gè)PTU以頭對(duì)尾取向置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)?；虻捻樞?yàn)椋篜FA1 v1、PFA2 v1、PFA3 v3、NoHetI v3。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。然后分離含有四個(gè)PTU的重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有所述四個(gè)PTU的摻入。

pDAB109584.pDAB109584質(zhì)粒(SEQ ID NO:19)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有歐洲油菜napin基因啟動(dòng)子(BnaNapinC啟動(dòng)子v1；GenBank登錄號(hào)M64633.1)、歐洲油菜napin基因5'非翻譯區(qū)(BnaNapinC 5'UTR v1；GenBank登錄號(hào)M64633.1)、裂殖壺菌屬物種PFA1 v2；和歐洲油菜napin基因3'非翻譯區(qū)(BnaNapinC 3’-UTR v1；GenBank登錄號(hào)M64633.1)。第二PUFA合酶PTU含有截短的菜豆β菜豆蛋白啟動(dòng)子(PvPhas啟動(dòng)子v4；GenBank登錄號(hào)J01263.1)；菜豆β菜豆蛋白5'非翻譯區(qū)(PvPhas 5’UTR；GenBank登錄號(hào)J01263.1)；裂殖壺菌屬物種PFA2 v2、菜豆β菜豆蛋白3'非翻譯區(qū)(PvPhas 3’-UTR v1；GenBank登錄號(hào)J01263.1)；和菜豆β菜豆蛋白3’MAR(PvPhas 3'MAR v2；GenBank登錄號(hào)J01263.1)。第三PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA3 v3；和At2S SSP終止子v1。磷酸泛酰巰基乙胺基 轉(zhuǎn)移酶PTU含有甘藍(lán)?；d體蛋白基因啟動(dòng)子(BoACP啟動(dòng)子v1；國(guó)際公開WO 1992/18634)；甘藍(lán)酰基載體蛋白基因5'非翻譯區(qū)(BoACP 5'UTR v2；國(guó)際公開WO 1992/18634)；NoHetI v3；和歐洲油菜?；d體蛋白基因3’非翻譯區(qū)(BnACP05 3’-UTR v1；GenBank登錄號(hào)X64114.1)。這四個(gè)PTU以頭對(duì)尾取向置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)。基因的順序?yàn)椋篜FA1v2、PFA2 v2、PFA3 v3、NoHetI v3。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有所述PTU的摻入。

pDAB109588.pDAB109588質(zhì)粒(SEQ ID NO:20)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有菜豆β菜豆蛋白啟動(dòng)子(PvPhas啟動(dòng)子v3；GenBank登錄號(hào)J01263.1)；PvPhas 5’UTR；裂殖壺菌屬物種PFA1 v2；PvPhas3’-UTR v1；和PvPhas 3'MAR v2。第二PUFA合酶PTU含有BnaNapinC啟動(dòng)子v1；BnaNapinC 5'UTR v1；裂殖壺菌屬物種PFA2 v2；和BnaNapinC 3’-UTR v1。第三PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA3v2；和At2S SSP終止子v1。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有BoACP啟動(dòng)子v1；甘藍(lán)酰基載體蛋白基因5'非翻譯區(qū)(BoACP 5'UTR v1；國(guó)際公開WO 1992/18634)；NoHetI v3；和AtuORF23 3’-UTR v1。這四個(gè)PTU以頭對(duì)尾取向置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)?；虻捻樞?yàn)椋篜FA1v2、PFA2 v2、PFA3 v2、NoHetI v3。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有所述PTU的摻入。

pDAB112210.pDAB112210質(zhì)粒(SEQ ID NO:21)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA1 v1；和At2S SSP終止子v1。第二PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA2 v1；和At2S SSP終止子v1。第三PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA3 v1；和At2S SSP終止子v1。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；NoHetI v3；和At2S SSP終止子v1。這四個(gè)PTU以頭對(duì)尾取向置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)。基因的順序?yàn)椋篜FA1 v1、PFA2 v1、PFA3 v1、NoHetI v1。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試四個(gè)PTU的摻入。

pDAB112206.pDAB112206質(zhì)粒(SEQ ID NO:22)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA1 v2；和At2S SSP終止子v1。第二PUFA合酶PTU含有PvPhas啟動(dòng)子v4；PvPhas 5’UTR；裂殖壺菌屬物種PFA2 v2；PvPhas 3’-UTR v1；和PvPhas 3'MARv2。第三PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA3 v3；和At2S SSP終止子v1。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有截短的菜豆β菜豆蛋白啟動(dòng)子(PvPhas啟動(dòng)子v6；GenBank登錄號(hào)J01263.1)；PvPhas5’UTR；NoHetI v3；PvPhas 3’-UTR v1；和PvPhas 3'MAR v2。上述這四個(gè)PTU以頭對(duì)尾取向置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)?；虻捻樞?yàn)椋篜FA1 v2、PFA2 v2、PFA3 v3、NoHetI v3。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試四個(gè)PTU的摻入。

第二種取向

pDAB107962.pDAB107962質(zhì)粒(SEQ ID NO:23)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA1 v2；和At2S SSP終止子v1。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有PvPhas啟動(dòng)子v6；PvPhas 5’UTR；NoHetI v3；PvPhas 3’-UTR v1；PvPhas 3'MAR v2；和AtuORF23 3’-UTR v1。第二PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA3 v2；和At2S SSP終止子v1。第三PUFA合酶PTU含有PvPhas啟動(dòng)子v6；PvPhas 5’UTR；裂殖壺菌屬物種PFA2 v1；PvPhas 3’-UTR v1；PvPhas 3'MAR v2；和AtuORF23 3’-UTR v1。PFA1 v2和NoHetI v3被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF23 3’UTR被置于兩個(gè)PTU之間；NoHetI v3和PFA3 v2被置于頭對(duì)頭取向；PFA3 v2和PFA2 v1被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF233’UTR被置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T-鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)的兩個(gè)PTU之間?；虻捻樞?yàn)椋篜FA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v2、PFA2 v1。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消 化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有所述PTU的摻入。

pDAB109591.pDAB109591質(zhì)粒(SEQ ID NO:24)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA1 v2；和At2S SSP終止子v1。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有PvPhas啟動(dòng)子v6；PvPhas啟動(dòng)子PvPhas 5’UTR；NoHetI v3；PvPhas 3’-UTR v1；PvPhas3'MAR v2；和AtuORF23 3’-UTR v1。第二PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA3 v3；和At2S SSP終止子v1。第三PUFA合酶PTU含有PvPhas啟動(dòng)子v6；PvPhas 5’UTR；裂殖壺菌屬物種PFA2 v2；PvPhas 3’-UTR v1；PvPhas 3'MAR v2；和AtuORF23 3’-UTR v1。PFA1 v2和NoHetI v3被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF23 3’UTR被置于兩個(gè)PTU之間；NoHetI v3和PFA3 v3被置于頭對(duì)頭取向；PFA3 v3和PFA2 v2被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF23 3’UTR被置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T-鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)的兩個(gè)PTU之間。基因的順序?yàn)椋篜FA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v3、PFA2 v2。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有所述PTU的摻入。

pDAB109592.pDAB109592質(zhì)粒(SEQ ID NO:25)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有BnaNapinC啟動(dòng)子v1；BnaNapinC 5'UTR v1；裂殖壺菌屬物種PFA1 v2；和BnaNapinC 3’-UTR v1。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有BoACP啟動(dòng)子v1；甘藍(lán)?；d體蛋白基因5'非翻譯區(qū)(BoACP 5'UTR v2；國(guó)際公開WO 1992/18634)；NoHetI v3；BnACP05 3’-UTR v1；和AtuORF23 3’-UTR v1。第二PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA3 v3；和At2S SSP終止子v1。第三PUFA合酶PTU含有PvPhas啟動(dòng)子v6；菜豆β菜豆蛋白5'非翻譯區(qū)(PvPhas啟動(dòng)子PvPhas 5’UTR；GenBank登錄號(hào)J01263.1)；裂殖壺菌屬物種PFA2 v2；PvPhas 3’-UTR v1；PvPhas3'MAR v2；和AtuORF23 3’-UTR v1。PFA1 v2和NoHetI v3被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF23 3’UTR被置于兩個(gè)PTU之間；NoHetI v3和PFA3 v3被置于頭對(duì)頭取向；PFA3 v3和PFA2 v2被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF23 3’UTR被置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T-鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)的兩個(gè)PTU之間。基因的順序?yàn)椋篜FA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v3、PFA2 v2。pDAB7333還含有如前所述 的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。然后分離含有四個(gè)PTU的重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試這四個(gè)PTU的摻入。

pDAB107960.pDAB107960質(zhì)粒(SEQ ID NO:26)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA1 v1；和At2S SSP終止子v1。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有PvPhas啟動(dòng)子v6；PvPhas啟動(dòng)子PvPhas 5’UTR；NoHetI v3；PvPhas 3’-UTR v1；PvPhas3'MAR v2；AtuORF23 3’-UTR v1。第二PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA3 v3；和At2S SSP終止子v1。第三PUFA合酶PTU含有PvPhas啟動(dòng)子v6；PvPhas 5’UTR；裂殖壺菌屬物種PFA2 v1；PvPhas3’-UTR v1；PvPhas 3'MAR v2；和AtuORF23 3’-UTR v1。PFA1 v1和NoHetI v3被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF23 3’UTR被置于兩個(gè)PTU之間；NoHetI v3和PFA3 v3被置于頭對(duì)頭取向；PFA3 v3和PFA2 v1被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF23 3’UTR被置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T-鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)的兩個(gè)PTU之間?；虻捻樞?yàn)椋篜FA1 v1、NoHetI v3、PFA3 v3、PFA2 v1。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有所述PTU的摻入。

pDAB110132.pDAB110132質(zhì)粒(SEQ ID NO:27)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有菜豆β菜豆蛋白啟動(dòng)子(PvPhas啟動(dòng)子v3；GenBank登錄號(hào)J01263.1)；菜豆β菜豆蛋白5'非翻譯區(qū)(PvPhas啟動(dòng)子PvPhas5’UTR；GenBank登錄號(hào)J01263.1)；裂殖壺菌屬物種PFA1 v2；PvPhas 3’-UTR v1；和PvPhas 3'MAR v2。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有BoACP啟動(dòng)子v1；BoACP 5'UTR v2；NoHetI v3；BnACP05 3’-UTR v1；和AtuORF23 3’-UTR v1。第二PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA3v2；和At2S SSP終止子v1。第三PUFA合酶PTU含有BnaNapinC啟動(dòng)子v1；BnaNapinC 5'UTR v1；裂殖壺菌屬物種PFA2 v1；BnaNapinC 3’-UTR v1；和AtuORF23 3’-UTR v1。PFA1 v2和NoHetI v3被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF233’UTR被置于兩個(gè)PTU之間；NoHetI v3和PFA3 v2被置于頭對(duì)頭取向；PFA3 v2和PFA2 v1被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF23 3’UTR被置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T-鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)的兩個(gè)PTU之間?；虻捻樞?yàn)椋篜FA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v2、PFA2 v1。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有所述PTU的摻入。

pDAB107961.pDAB107961質(zhì)粒(SEQ ID NO:28)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有PvPhas啟動(dòng)子v3；PvPhas啟動(dòng)子PvPhas 5’UTR；裂殖壺菌屬物種PFA1 v1；PvPhas 3’-UTR v1；和PvPhas 3'MAR v2。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有BoACP啟動(dòng)子v1；BoACP 5'UTR v2；NoHetI v3；BnACP05 3’-UTR v1；和AtuORF23 3’-UTR v1。第二PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA3 v3；和At2S SSP終止子v1。第三PUFA合酶PTU含有BnaNapinC啟動(dòng)子v1；BnaNapinC 5'UTR v1；裂殖壺菌屬物種PFA2 v1；BnaNapinC 3’-UTR v1；和AtuORF23 3’-UTR v1。PFA1v1和NoHetI v3被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF23 3’UTR被置于兩個(gè)PTU之間；NoHetI v3和PFA3 v3被置于頭對(duì)頭取向；PFA3 v3和PFA2 v1被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF23 3’UTR被置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T-鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)的兩個(gè)PTU之間?；虻捻樞?yàn)椋篜FA1 v1、NoHetI v3、PFA3 v3、PFA2 v1。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有所述PTU的摻入。

pDAB110151.pDAB110151質(zhì)粒(SEQ ID NO:29)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有BnaNapinC啟動(dòng)子v1；BnaNapinC 5'UTR v1；裂殖壺菌屬物種PFA1 v2；和BnaNapinC 3’-UTR v1。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有PvPhas啟動(dòng)子v6；PvPhas啟動(dòng)子PvPhas 5’UTR；NoHetI v3；PvPhas3’-UTR v1；PvPhas 3'MAR v2；和AtuORF23 3’-UTR v1。第二PUFA合酶PTU含有BnaNapinC啟動(dòng)子v1；BnaNapinC 5'UTR v1；裂殖壺菌屬物種PFA3 v2；和At2S SSP終止子v1。第三PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA2 v1；和At2S SSP終止子v1。PFA1 v2和NoHetI v3被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF23 3’UTR被置于兩個(gè)PTU之間；NoHetI v3和PFA3 v2被置于頭對(duì)頭取向；PFA3 v2和PFA2 v1被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF233’UTR被置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T-鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)的兩個(gè)PTU之間?；虻捻樞?yàn)椋篜FA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v2、PFA2 v1。pDAB7333還 含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有所述PTU的摻入。

pDAB112285.pDAB112285質(zhì)粒(SEQ ID NO:30)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA1 v2；和At2S SSP終止子v1。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有PvPhas啟動(dòng)子v6；PvPhas啟動(dòng)子PvPhas 5’UTR；NoHetI v3；PvPhas 3’-UTR v1；PvPhas3'MAR v2；和AtuORF25/26 3’-UTR v3。第二PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA3 v2；和At2S SSP終止子v1。第三PUFA合酶PTU含有PvPhas啟動(dòng)子v6；PvPhas 5’UTR；裂殖壺菌屬物種PFA2 v1；PvPhas 3’-UTR v1；PvPhas 3'MAR v2；和AtuORF23 3’-UTR v1。PFA1 v2和NoHetI v3被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF25/26 3’UTR被置于兩個(gè)PTU之間；NoHetI v3和PFA3 v2被置于頭對(duì)頭取向；PFA3 v2和PFA2 v1被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF23 3’UTR被置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T-鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)的兩個(gè)PTU之間?；虻捻樞?yàn)椋篜FA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v2、PFA2 v1。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。然后分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有所述PTU的摻入。

pDAB117501.pDAB117501質(zhì)粒(SEQ ID NO:31)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA1 v1；和At2S SSP終止子v1。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有PvPhas啟動(dòng)子v6；PvPhas啟動(dòng)子PvPhas 5’UTR；NoHetI v3；PvPhas 3’-UTR v1；PvPhas3'MAR v2；GenBank登錄號(hào)J01263.1；和AtuORF25/26 3’-UTR v3。第二PUFA合酶PTU含有大豆β伴大豆球蛋白α主要亞基基因啟動(dòng)子和5'非翻譯區(qū)(SSPRO2745.1；GenBank登錄號(hào)GU723691.1)；裂殖壺菌屬物種PFA3 v1；PvPhas3’-UTR v1；和PvPhas 3'MAR v2。第三PUFA合酶PTU含有BnaNapinC啟動(dòng)子v1；BnaNapinC 5'UTR v1；裂殖壺菌屬物種PFA2 v1；BnaNapinC 3’-UTR v1。PFA1 v1和NoHetI v3被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF25/26 3’UTR被置于兩個(gè)PTU之間；NoHetI v3和PFA3 v1被置于頭對(duì)頭取向；PFA3 v1和PFA2 v1被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF23 3’UTR被置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T-鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)的兩個(gè)PTU之間?；虻捻樞?yàn)椋篜FA1 v1、NoHetI v3、PFA3 v1、PFA2 v1。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有所述PTU的摻入。

pDAB117502.pDAB117502質(zhì)粒(SEQ ID NO:32)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有PvPhas啟動(dòng)子v3；PvPhas啟動(dòng)子PvPhas 5’UTR；裂殖壺菌屬物種PFA1 v1；PvPhas 3’-UTR v1；和PvPhas 3'MAR v2。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有BnaNapinC啟動(dòng)子v1；BnaNapinC 5'UTR v1；NoHetI v3；BnaNapinC 3’-UTR v1；和AtuORF25/26 3’-UTR v1。第二PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA3 v1；和At2SSSP終止子v1。第三PUFA合酶PTU含有SSPRO2745.1；裂殖壺菌屬物種PFA2 v1；PvPhas 3’-UTR v1；和PvPhas 3'MAR v2。PFA1 v1和NoHetI v3被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF25/26 3’UTR被置于兩個(gè)PTU之間；NoHetI v3和PFA3 v1被置于頭對(duì)頭取向；PFA3 v1和PFA2 v1被置于尾對(duì)尾取向，并且AtuORF23 3’UTR被置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T-鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)的兩個(gè)PTU之間?；虻捻樞?yàn)椋篜FA1 v1、NoHetI v3、PFA3 v1、PFA2 v1。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有所述PTU的摻入。

第三種取向

pDAB112200.pDAB112200質(zhì)粒(SEQ ID NO:33)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA1 v2；和At2S SSP終止子v1。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有PvPhas啟動(dòng)子v4；PvPhas 5’UTR；NoHetI v3；AtuORF23 3’-UTR v1；和隨機(jī)DNA間隔區(qū)。第二PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA3 v2；和At2S SSP終止子v1。第三PUFA合酶PTU含有PvPhas啟動(dòng)子v5；PvPhas 5’UTR；裂殖壺菌屬物種PFA2 v2；和AtuORF23 3’-UTR v1。PFA1 v2和NoHetI v3被置于頭對(duì)頭取向；NoHetI v3和PFA3 v2被置于尾對(duì)尾取向，其中隨機(jī)DNA間隔區(qū)被置于兩個(gè)PTU之間；PFA3 v2和PFA2 v2以頭對(duì)頭取向置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T-鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)。基因的順序?yàn)椋篜FA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v2、PFA2 v2。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn) 移酶PTU。分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有所述PTU的摻入。

pDAB112201.pDAB112201質(zhì)粒(SEQ ID NO:34)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有雷斯克勒(Lesquerella fendleri)3酮脂酰-CoA合成酶基因啟動(dòng)子和5'非翻譯區(qū)(LfKCS3啟動(dòng)子v2；GenBank登錄號(hào)AF367052.1)；裂殖壺菌屬物種PFA1 v2；和3酮脂酰-CoA合成酶基因3'非翻譯區(qū)(SSTER2742.1；GenBank登錄號(hào)AF367052.1)。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有BoACP啟動(dòng)子v1；BoACP 5'UTR v2；NoHetI v3；BnACP05 3’-UTR v1；和隨機(jī)DNA間隔區(qū)。第二PUFA合酶PTU含有LfKCS3啟動(dòng)子v2；裂殖壺菌屬物種PFA3 v2；和SSTER2742.1。第三PUFA合酶PTU含有BoACP啟動(dòng)子v1；BoACP 5'UTR v2；裂殖壺菌屬物種PFA2 v2；和BnACP05 3’-UTR v1。PFA1 v2和NoHetI v3被置于頭對(duì)頭取向；NoHetI v3和PFA3 v2被置于尾對(duì)尾取向，其中隨機(jī)DNA間隔區(qū)被置于兩個(gè)PTU之間；PFA3 v2和PFA2 v2以頭對(duì)頭取向置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T-鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)?；虻捻樞?yàn)椋篜FA1 v2、NoHetI v3、PFA3v2、PFA2 v2。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有所述PTU的摻入。

pDAB112203.pDAB112203質(zhì)粒(SEQ ID NO:35)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有SSPRO2745.1；裂殖壺菌屬物種PFA1 v2；PvPhas3’-UTR v1；和PvPhas 3'MAR v2。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有大豆Kunitz胰蛋白酶抑制劑3基因啟動(dòng)子和5'非翻譯區(qū)(SSPRO2743.1；GenBank登錄號(hào)AF233296.1)；NoHetI v3；大豆Kunitz胰蛋白酶抑制劑3基因3'非翻譯區(qū)(SSTER2744.1；GenBank登錄號(hào)AF233296.1)；和隨機(jī)DNA間隔區(qū)。第二PUFA合酶PTU含有SSPRO2745.1；裂殖壺菌屬物種PFA3 v2；PvPhas 3’-UTR v1；和PvPhas 3'MAR v2。第三PUFA合酶PTU含有SSPRO2743.1；裂殖壺菌屬物種PFA2 v2；和SSTER2744.1。PFA1 v2和NoHetI v3被置于頭對(duì)頭取向；NoHetI v3和PFA3 v2被置于尾對(duì)尾取向，其中隨機(jī)DNA間隔區(qū)被置于兩個(gè)PTU之間；PFA3 v2和PFA2 v2以頭對(duì)頭取向置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T-鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)?；虻捻樞?yàn)椋篜FA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v2、PFA2 v2。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。分離重組質(zhì)粒，并采 用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有所述PTU的摻入。

pDAB112205.pDAB112205質(zhì)粒(SEQ ID NO:36)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA1 v2；和At2S SSP終止子v1。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有BoACP啟動(dòng)子v1；BoACP 5'UTR v2；NoHetI v3；BnACP05 3’-UTR v1；和隨機(jī)DNA間隔區(qū)。第二PUFA合酶PTU含有SSPRO2743.1；裂殖壺菌屬物種PFA3 v2；和SSTER2744.1。第三PUFA合酶PTU含有SSPRO2745.1；裂殖壺菌屬物種PFA2 v2；PvPhas 3’-UTR v1；和PvPhas 3'MAR v2。PFA1 v2和NoHetI v3被置于頭對(duì)頭取向；NoHetI v3和PFA3 v2被置于尾對(duì)尾取向，其中隨機(jī)DNA間隔區(qū)被置于兩個(gè)PTU之間；PFA3 v2和PFA2 v2以頭對(duì)頭取向置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T-鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)?；虻捻樞?yàn)椋篜FA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v2、PFA2v2。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。然后分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有所述PTU的摻入。

pDAB112208.pDAB112208質(zhì)粒(SEQ ID NO:37)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有SSPRO2743.1；裂殖壺菌屬物種PFA1 v2；和SSTER2744.1。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有SSPRO2745.1；NoHetI v3；PvPhas 3’-UTR v1；PvPhas 3'MAR v2；和隨機(jī)DNA間隔區(qū)。第二PUFA合酶PTU含有SSPRO2743.1；裂殖壺菌屬物種PFA3 v2；和SSTER2744.1。第三PUFA合酶PTU含有SSPRO2745.1；裂殖壺菌屬物種PFA2 v2；和PvPhas 3'MAR v2。PFA1 v2和NoHetI v3被置于頭對(duì)頭取向；NoHetI v3和PFA3 v2被置于尾對(duì)尾取向，其中隨機(jī)DNA間隔區(qū)被置于兩個(gè)PTU之間；PFA3 v2和PFA2 v2以頭對(duì)頭取向置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T-鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)?；虻捻樞?yàn)椋篜FA1 v2、NoHetI v3、PFA3 v2、PFA2 v2。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有所述PTU的摻入。

pDAB112209.pDAB112209質(zhì)粒(SEQ ID NO:38)含有三個(gè)PUFA合酶PTU、一個(gè)磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU、和一個(gè)膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。具體地說，第一PUFA合酶PTU含有SSPRO2743.1；裂殖壺菌屬物種PFA1 v2；和SSTER2744.1。磷酸泛酰巰基乙胺基轉(zhuǎn)移酶PTU含有BoACP啟動(dòng)子v1；BoACP 5'UTR v2；NoHetI v3；BnACP05 3’-UTR v1；和隨機(jī)DNA間隔區(qū)。第二PUFA合酶PTU含有SSPRO2745.1；裂殖壺菌屬物種PFA3 v2；PvPhas 3’-UTR v1；和PvPhas 3'MAR v2。第三PUFA合酶PTU含有PvDlec2啟動(dòng)子v2；2S 5'UTR；裂殖壺菌屬物種PFA2 v2；和At2S SSP終止子v1。PFA1 v2和NoHetI v3被置于頭對(duì)頭取向；NoHetI v3和PFA3 v2被置于尾對(duì)尾取向，其中隨機(jī)DNA間隔區(qū)被置于兩個(gè)PTU之間；PFA3 v2和PFA2 v2以頭對(duì)頭取向置于植物轉(zhuǎn)化雙元載體pDAB7333的T-鏈DNA邊界區(qū)內(nèi)?；虻捻樞?yàn)椋篜FA1 v2、NoHetI v3、PFA3v2、PFA2 v2。pDAB7333還含有如前所述的膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶PTU。分離重組質(zhì)粒，并采用限制性酶消化和DNA測(cè)序測(cè)試是否有所述PTU的摻入。

根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化。

將選定的雙元構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到土壤桿菌菌株中用于植物轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化所選用的菌株為根癌土壤桿菌菌株EHA 105的衍生物。將下列兩個(gè)根癌土壤桿菌菌株AGL1和DA2552(參見國(guó)際專利公開WO2012016222)用雙元構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并通過限制酶消化和測(cè)序加以驗(yàn)證。

采用基本上如Clough和Bent(1998)Plant J.16(6):735-43中所述的花序浸漬法，用包含雙元質(zhì)粒的根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥而產(chǎn)生T₀事件，所述雙元質(zhì)粒編碼在如上所述的植物表達(dá)元件控制下的PUFA合酶基因和HetI(在一些情況下SzACS2)。獲得擬南芥T₀事件并加以選擇，培植至成熟并自花受精。收獲所得的T₁種子并種植之。通過噴施膦絲菌素選擇轉(zhuǎn)化的T₁植物，以選出那些含有作為選擇標(biāo)志物的功能性pat基因的植物。對(duì)存活的T₁植物采取葉組織樣品，通過pat基因特異性定量PCR反應(yīng)進(jìn)行分析，以鑒定出那些含有單拷貝選擇標(biāo)志物(以及相關(guān)的轉(zhuǎn)基因)的植物。將這些植物培植至成熟，收獲T₂種子并分析LC-PUFA含量(表示為總可提取FAME的％)。

芥花轉(zhuǎn)化。

種子萌發(fā)。將野生型芥花種子(品種DH12075；ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1456120/)在10％Clorox中進(jìn)行表面消毒10分鐘，并用無菌蒸餾水沖洗三次(在這個(gè)過程中種子盛放在鋼制濾網(wǎng)中)。將種子種植在容納在植物培養(yǎng)盒(PhytaTray)中的1/2MS芥花介質(zhì)(1/2X MS、2％蔗糖、0.8％瓊脂)上，每植物培養(yǎng)盒25粒種子，置于Percival Growth Chamber^TM中，培 植方案設(shè)置為25℃，16小時(shí)光照和8小時(shí)黑暗的光周期，萌發(fā)5天。

預(yù)處理。在第5天，無菌切下長(zhǎng)度約3mm的下胚軸節(jié)段，棄去根和芽段(通過在切除過程中將下胚軸節(jié)段放入10ml的無菌水中以防止下胚軸干燥)。將下胚軸節(jié)段平放在無菌濾紙上的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSK1D1(1X MS、1mg/L激動(dòng)素、1mg/L 2,4-D、3％蔗糖，0.7％)上，在Percival Growth Chamber^TM中預(yù)處理3天，培植方案設(shè)置為22--23℃、以及16小時(shí)光照和8小時(shí)黑暗的光周期。

與土壤桿菌共培養(yǎng)。在用土壤桿菌處理之前一天，接種含適當(dāng)抗生素的YEP培養(yǎng)基的燒瓶。將下胚軸節(jié)段從濾紙轉(zhuǎn)移到空的含10mL液體M培養(yǎng)基的100 x 25mm培養(yǎng)皿中，以防下胚軸節(jié)段干燥。在這個(gè)階段，使用刮鏟舀起節(jié)段并轉(zhuǎn)移。用移液管移除液體M培養(yǎng)基，添加40mL土壤桿菌懸液到培養(yǎng)皿中(500個(gè)節(jié)段，40mL土壤桿菌溶液)。通過對(duì)培養(yǎng)皿的周期性渦旋將節(jié)段處理30分鐘，使得下胚軸可保持浸沒在土壤桿菌溶液中。

在處理期結(jié)束時(shí)，將土壤桿菌溶液吸移到廢液燒杯中，高壓滅菌并丟棄(完全移除土壤桿菌溶液以防土壤桿菌生長(zhǎng)過度)。用鑷子將處理過的下胚軸轉(zhuǎn)移返回到含MSK1D1的具有濾紙的原平板上(仔細(xì)地確保節(jié)段不干燥)。在降低的光強(qiáng)度下(通過用鋁箔覆蓋平板)將下胚軸節(jié)段連同對(duì)照節(jié)段送回到Percival Growth Chamber^TM，并將處理過的下胚軸與土壤桿菌共培養(yǎng)3天。

在選擇培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。在共培養(yǎng)3天之后，用鑷子逐一地將下胚軸節(jié)段轉(zhuǎn)移到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSK1D1H1(1X MS、1mg/L激動(dòng)素、1mg/L2,4-D、0.5gm/L MES、5mg/L AgNo₃、300mg/L200mg/L Carbenicillin^TM、1mg/L Herbiace^TM、3％蔗糖、0.7％)上。將下胚軸節(jié)段固定在培養(yǎng)基上，但未包埋到培養(yǎng)基中。

選擇和芽再生。在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上7天之后，將形成愈傷組織的下胚軸節(jié)段轉(zhuǎn)移到具有選擇MSB3Z1H1的芽再生培養(yǎng)基1(1X MS、3mg/L BAP、1mg/L玉米素、0.5gm/L MES、5mg/L AgNo₃、300mg/L200mg/L Carbenicillin^TM、1mg/L Herbiace^TM、3％蔗糖、0.7％)上。14天之后，將具有芽的下胚軸轉(zhuǎn)移到具有增加的選擇MSB3Z1H3的再生培養(yǎng)基2(1X MS、3mg/L BAP、1mg/L玉米素、0.5gm/L MES、5mg/L AgNo₃、300mg/L 200mg/L Carbenicillin^TM、3mg/L Herbiace^TM、3％蔗糖、0.7％)上。

芽伸長(zhǎng)。14天之后，具有芽的節(jié)段轉(zhuǎn)移到芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基MSMESH5(1X MS、300mg/L5mg/L Herbiace^TM、2％蔗糖，0.7％TC Agar^TM)上。分離已經(jīng)伸長(zhǎng)的芽，并轉(zhuǎn)移到MSMESH5。14天之后，將其余在第一輪中伸長(zhǎng)了的芽放置在MSMESH5上，并轉(zhuǎn)移到具有相同組成的新鮮的選擇培養(yǎng)基。在這個(gè)階段，棄去所有剩余的下胚軸節(jié)段。分離在MSB3Z1H3培養(yǎng)基上2周后伸長(zhǎng)了的芽，并轉(zhuǎn)移到MSMESH5培養(yǎng)基。分離其余的在MSMESH5上的在第一輪中伸長(zhǎng)了的芽，并轉(zhuǎn)移到具有相同組成的新鮮的選擇培養(yǎng)基。在這個(gè)階段，棄去所有剩余的下胚軸節(jié)段。

根誘導(dǎo)。14天之后，將芽轉(zhuǎn)移到MSMEST培養(yǎng)基(1X MS、0.5g/L MES、300mg/L2％蔗糖、0.7％TC Agar^TM)上以進(jìn)行根誘導(dǎo)。在MSMEST培養(yǎng)基上的在第一次轉(zhuǎn)移中未生根的芽轉(zhuǎn)移到MSMEST培養(yǎng)基上進(jìn)行第二個(gè)或第三個(gè)循環(huán)，直到獲得生根的植物為止。

PCR分析。在MSMESH5培養(yǎng)基上培養(yǎng)芽至少14天之后，分離用于PCR的樣品。通過PCR測(cè)試來自綠色芽的葉組織是否存在pat選擇標(biāo)志物基因。所有萎黃的芽均棄去，不進(jìn)行PCR測(cè)定。保留PCR反應(yīng)為陽性的樣品，將芽留在MSMEST培養(yǎng)基上使其伸長(zhǎng)并產(chǎn)生根。棄去根據(jù)PCR測(cè)定為陰性的芽。將在MSMESH5或MSMEST上生根且為PCR陽性的植物移送種植到土壤中。煉苗之后，進(jìn)一步分析T₀芥花植物的含有所有轉(zhuǎn)基因PTU盒的事件，并將這些植物轉(zhuǎn)移到溫室，培植至成熟，收獲T₁種子進(jìn)行脂肪酸組成分析。

大豆轉(zhuǎn)化。

子葉節(jié)大豆。--按照Zeng等人，(2004)Plant Cell Rep.22(7):478-82的程序的修改版，使用含雙元載體的土壤桿菌菌株進(jìn)行土壤桿菌介導(dǎo)的大豆(Glycine max c.v.,Maverick)的轉(zhuǎn)化。該方案經(jīng)過修改，包含除草劑草銨膦作為選擇劑。另外，另一處修改包括讓消毒大豆種子在以3g/L Phytagel^TM(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo.)固化的B5基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Gamborg等人,1968)Exp Cell Res.50(1):151-8)上萌發(fā)。該方案的最后一處修改使用了子葉節(jié)外植體，所述子葉節(jié)外植體是從5-6日齡的苗制備的，并如由Zhang等人，(1999)Plant Cell Tiss.Org.56:37-46所述用土壤桿菌進(jìn)行了感染。如Zeng等人，(2004)所述的，在共培養(yǎng)培養(yǎng)基上進(jìn)行了5天的共培養(yǎng)。芽起始、芽伸長(zhǎng)、和生根培養(yǎng)基均補(bǔ)充有50mg/L Cefotaxime^TM、50mg/L和50mg/L萬可霉素^TM，并用3g/L Phytagel^TM固化。

分割種子大豆轉(zhuǎn)化方法。--通過Paz等人，(2005)Plant Cell Rep.25:206-13的程序的修改版，使用含雙元載體的土壤桿菌菌株進(jìn)行土壤桿菌介導(dǎo)的大豆(Glycine max c.v.,Maverick)的轉(zhuǎn)化。簡(jiǎn)要地說，將大豆種子沿種臍縱向?qū)Π肭虚_，分開種子并去除種皮。切下胚軸，并從子葉節(jié)點(diǎn)除去任何主芽(axial shoot/bud)。所得的半種子外植體用土壤桿菌感染。芽起始、芽伸長(zhǎng)、和生根培養(yǎng)基補(bǔ)充有50mg/L頭孢噻肟(Cefotaxime)^TM、50mg/L和50mg/L萬可霉素^TM，并用3g/L Phytagel^TM固化。利用草銨膦選擇來抑制非轉(zhuǎn)化芽(non-transformed shoot)的生長(zhǎng)。

利用具有部分胚軸的分裂種子進(jìn)行的大豆轉(zhuǎn)化方法。使用含雙元載體的土壤桿菌菌株，通過美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.61/739,349中描述的具有部分胚軸的分裂種子外植體的大豆轉(zhuǎn)化方案，進(jìn)行土壤桿菌介導(dǎo)的大豆(Glycine max c.v，Maverick)轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)化之后，使用美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No.61/739,349中描述的組織培養(yǎng)方法，培養(yǎng)大豆組織。利用草銨膦選擇來抑制非轉(zhuǎn)化芽的生長(zhǎng)。將選擇的芽轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上以使根發(fā)育，然后轉(zhuǎn)移到土壤預(yù)混物上以使小植株馴化。

對(duì)選定小植株的頂生小葉(terminal leaflet)用草銨膦局部處理(涂葉技術(shù)(leaf paint technique)，以篩選推定的轉(zhuǎn)化體。將篩選到的小植株轉(zhuǎn)移至溫室，馴化，然后用草銨膦涂葉以再次確認(rèn)耐受性。對(duì)這些推定轉(zhuǎn)化的T₀植物取樣，利用分子分析來確認(rèn)PTU內(nèi)轉(zhuǎn)基因的存在。讓鑒定的T₀植物在溫室中自花受精，以產(chǎn)生用于脂肪酸組成分析的T₁種子。

來自轉(zhuǎn)基因大豆事件的成熟T₁種子的脂質(zhì)分析。

將來自3個(gè)構(gòu)建體pDAB101454、pDAB101496和pDAB107960的T₀植物在溫室中培植至成熟。選擇含有PAT v5的拷貝和伴隨的四個(gè)基因的植物進(jìn)行DHA生產(chǎn)。使這些植物自花受精，在成熟時(shí)收獲生成的T₁種子。通過FAME GC-FID分析單顆的種子以確定T₁大豆種子中的LC-PUFA和DHA含量。逐一地分析每株植物的十二粒完整成熟種子，壓榨機(jī)碾碎種子，并使用鋼球和球磨(Spex SamplePrep，LLC)將其均質(zhì)化。用己烷將組織脫脂三次，對(duì)合并的己烷級(jí)分進(jìn)行蒸發(fā)至干燥，將殘?jiān)Q重，并在己烷中復(fù)原以進(jìn)行FAME分析。在替代物十七碳酸三甘油酯(Nu-Chek Prep，Elysian，MN)的存在下，用0.25M新鮮配制的甲醇鈉(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)甲醇溶液對(duì)已知量的油渣 實(shí)施轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)。在溫和加熱(40℃)和不斷震搖下進(jìn)行反應(yīng)，用庚烷提取所得的FAME。通過回收反應(yīng)的十七烷酸甲酯替代物核實(shí)反應(yīng)的完成。使用Agilent 6890氣相色譜儀(Agilent Technologies，Santa Clara，CA)和SGE(Austin，TX)產(chǎn)的15m x 0.25mm x 0.25μm BPX 70毛細(xì)管柱，通過GC-FID分析FAME提取物。根據(jù)每個(gè)FAME峰的保留時(shí)間鑒定每個(gè)FAME峰，并通過注入來自Matreya LLC(Pleasant Gap,PA)的菜籽油參照預(yù)混物對(duì)每個(gè)FAME峰進(jìn)行定量。校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品含有分別添加的標(biāo)準(zhǔn)品DHA(C22:6)、EPA(C20:5)、DPA(n-6)(C22:5)、γ-亞麻酸(C18:3)以及來自Nu-Chek的花生四烯酸甲酯。使用ChemStation4軟件(Agilent)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

DHA占那些含LC-PUFA的T₂種子中的LC-PUFA總含量的60％。在T₂大豆種子中僅檢測(cè)了兩種新的LC-PUFA：DHA和DPA(n-6)。預(yù)期會(huì)在大豆種子中出現(xiàn)的脂肪酸均以正常水平檢出，例外之處是由于LC-PUFA的存在，總C18脂肪酸成比例地偏低。在這些轉(zhuǎn)基因大豆種子中檢測(cè)出兩種其他的脂肪酸(γ亞麻酸和花生四烯酸)處于低水平(總共小于1％)。

植物轉(zhuǎn)化體的分子確認(rèn)。

編碼區(qū)的拷貝數(shù)分析和檢測(cè)。從上述轉(zhuǎn)化中鑒定和選擇了T₀植物。進(jìn)一步分析這些轉(zhuǎn)化體以鑒定含有每一個(gè)所述的轉(zhuǎn)基因PTU表達(dá)盒的植物。進(jìn)行了一種類似于的水解探針測(cè)定，以初步篩選和確認(rèn)PFA1、PFA2、PFA3、HetI、SzACS2、和pat轉(zhuǎn)基因的存在，以及VirD2土壤桿菌基因的不存在。如以前在國(guó)際專利公開WO2013016546和WO2011146524中描述來部署測(cè)定。使用從這些定量PCR研究產(chǎn)生的數(shù)據(jù)來確定轉(zhuǎn)基因的存在和拷貝數(shù)。選擇含有全部PTU的事件，以進(jìn)一步產(chǎn)生T₁植物。

芥花和擬南芥種子中PUFA合酶蛋白的檢測(cè)。開發(fā)了一種定量Western印跡法檢測(cè)來自芥花和擬南芥種子樣品的PUFA合酶多肽。重組表達(dá)具有N端HIS標(biāo)簽的全長(zhǎng)PFA1和PFA3的抗原，通過鈷親和色譜法進(jìn)行部分純化。全長(zhǎng)PFA2的抗原不含HIS標(biāo)簽，從包涵體分離。還重組了一個(gè)N端PFA2片段、以及一個(gè)與預(yù)期的ER結(jié)構(gòu)域重疊的PFA3片段作為抗原。以凝膠片的形式將所有這些片段交付用于在兔體內(nèi)產(chǎn)生多克隆抗體。在BL21(DE3)大腸桿菌細(xì)胞(Invitrogen；Carlsbad，CA)中重組表達(dá)具有N端6X His的全長(zhǎng)HetI的抗原，并通過鈷親和色譜法進(jìn)行高度純化?？乖訲BS緩沖的可溶蛋白的方式以約2mg/mL的濃度交 付用于在兔體內(nèi)產(chǎn)生多克隆抗體。通過蛋白G抗體親和色譜純化所有的抗血清。

在Arctic Express(DE3)RIL(Invitrogen；Carlsbad，CA)中異源表達(dá)和產(chǎn)生PFA1、PFA2、PFA3、和HetI的重組參照標(biāo)準(zhǔn)品，通過His-ComAC純化法來進(jìn)行純化。通過密度測(cè)定法來確定蛋白質(zhì)濃度，使用供凝膠中定量的BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線，變性SDS-PAGE，考馬斯亮藍(lán)染色。

制備用于分析的種子樣品：如上所述，在Kleco Bead Beater^TM(Garcia Machine，Visalia，CA)中利用兩個(gè)不銹鋼珠使干燥的擬南芥種子裂開，或加工批量芥花種子FAME分析所生成的脫脂餅。將提取緩沖液(50mM Tris，10mM EDTA，2％SDS)加入到種子樣品中，并將含有樣品和提取緩沖液的管輕輕搖動(dòng)15-30分鐘。樣品在3,000x g下離心30分鐘。收集上清液并用于分析。

使用Pierce 660nm Protein Assay^TM(Thermo Scientific，Rockford，IL)確定種子提取物中的總可溶蛋白的量。樣品經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化達(dá)到1.55mg/mL總可溶蛋白，在LDS樣品緩沖液(Invitrogen，Carlsbad，CA)中配制，緩沖液中含有40mM DTT，標(biāo)準(zhǔn)上樣量為每泳道20μg總可溶蛋白。樣品在3-8％Tris乙酸凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA)中電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。在封閉緩沖液中封閉印跡，利用針對(duì)不同PUFA合酶多肽(PFA1、PFA2、和PFA3)的抗體進(jìn)行探測(cè)。使用抗兔熒光標(biāo)記二抗——山羊抗兔(Goat Anti-Rabbit)AF 633^TM(Invitrogen，Carlsbad，CA)進(jìn)行檢測(cè)。在Typhoon Trio Plus Fluorescent Imager^TM(GE Healthcare，New Brunswick NJ)上將印跡可視化。所得到的來自成熟種子擬南芥T₂種子、大豆T₁種子、和芥花T₁種子的提取物的SDS-PAGE Western印跡當(dāng)用PFA1、PFA2、PFA3、和HetI特異性抗血清探測(cè)時(shí)，產(chǎn)生了正確大小的條帶。

用SDS-PAGE Western印跡檢測(cè)事件101454[267]-26702.001的T₁大豆種子提取物中的PUFA合酶多肽PFA1、PFA2、PFA3、和HetI，結(jié)果產(chǎn)生了具有預(yù)期分子量的條帶。

同樣，在下列事件：6580[2]-016.Sx001；6580[2]-017.Sx001；6580[2]-017.Sx002；6580[2]-018.Sx001；6580[2]-019.Sx001；6580[2]-020.Sx001；6580[2]-021.Sx001；6580[2]-021.Sx002；6580[2]-024.Sx001；6580[2]-039.Sx001；和6580[2]-039.Sx002的T₁芥花種子提取物中，用SDS-PAGE Western印跡檢測(cè)PUFA合酶多肽PFA1、PFA2、PFA3、和HetI均產(chǎn)生了具有預(yù)期分子量的條帶。

然后，利用針對(duì)每種多肽的5點(diǎn)(100ng、50ng、25ng、12.5ng和6.25ng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過SDS-PAGE Western印跡對(duì)PUFA合酶特異性蛋白定量。表2和 表3分別概述了擬南芥和芥花的結(jié)果。

表2.在批量T₂擬南芥種子中的PUFA合酶多肽含量的總結(jié)。

表3.在芥花事件的批量T₁種子中的PUFA合酶多肽含量的總結(jié)。

實(shí)施例3：在用PUFA合酶轉(zhuǎn)化的擬南芥種子中的LC-PUFA產(chǎn)生。

表4中總結(jié)了獲自用編碼PUFA合酶基因的構(gòu)建體產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因擬南芥T₁事件的種子的DHA和其他LC-PUFA油含量。使用真實(shí)的¹⁴C-標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)品鑒別DHA和EPA的HPLC保留時(shí)間。圖2.使用1-¹⁴C-標(biāo)記的DHA標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行PUFA的定量。分析的每個(gè)事件的LC-PUFA含量顯示在圖3中。這些數(shù)據(jù)表明，構(gòu)建體PTU的構(gòu)型類型，以及用于表達(dá)PUFA合酶和HetI基因的特定調(diào)節(jié)元件組合的用法，可以用來改變所獲得的在T₂擬南芥種子中產(chǎn)生LC-PUFA的轉(zhuǎn)基因事件的數(shù)目。

表4.用PUFA合酶和HetI轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的、且含有單拷貝的pat轉(zhuǎn)基因的擬南芥事件的T₂種子中的LC-PUFA含量的總結(jié)。

¹LC-PUFA含量>總種子FAME的1％的事件的數(shù)目，其中占總事件的百分比在括號(hào)中

²平均總LC-PUFA含量(DHA(n-3)+EPA(n-3)+DPA(n-6))，表示為總種子FAME的％

³分析的所有T2種子樣品的最大總LC-PUFA含量，表示為總FAME的％

⁴在所有產(chǎn)LC-PUFA的事件中的平均n-3 LC-PUFA(DHA+EPA)/總LC-PUFA含量

例如，pDAB101454的所有單拷貝事件僅有22％產(chǎn)生了DHA，而65％的pDAB101496事件和79％的pDAB112206事件產(chǎn)生了DHA。與pDAB101454比較，pDAB101496雙元載體含有更多樣化的調(diào)節(jié)元件。同樣，與pDAB101454比較， pDAB112206構(gòu)建體既有更多樣化的調(diào)節(jié)元件，又有改變的PTU結(jié)構(gòu)。另一構(gòu)建體，pDAB109584，包含額外的調(diào)節(jié)元件多樣化，并且含有PFA3基因的天然編碼序列形式，而非“植物優(yōu)化的”形式。在這種情況下，所有單拷貝事件的82％產(chǎn)生了LC-PUFA。

在第二種取向PTU結(jié)構(gòu)中，由于調(diào)節(jié)元件的進(jìn)一步修飾、構(gòu)建體結(jié)構(gòu)、以及天然基因序列的使用，結(jié)果獲得了這樣的構(gòu)建體，其產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因擬南芥植物的所有單拷貝事件中有61-80％產(chǎn)生LC-PUFA。而且，這些第二種取向的PTU結(jié)構(gòu)構(gòu)建體還產(chǎn)生了這樣的轉(zhuǎn)基因植物，它們中有更高比例的事件(41-62％)在T₂擬南芥種子中的LC-PUFA含量>1％。天然(相對(duì)于植物優(yōu)化的)的PUFA合酶基因序列的存在也提高了>1％LC-PUFA事件的比例。例如，含有天然基因序列的pDAB109525和pDAB112210分別有60％和54％的單拷貝事件是LC-PUFA>1％的。相比之下，包含所有植物優(yōu)化的基因(處于相同的形式并使用相同的調(diào)節(jié)元件)的pDAB101454僅僅有5％事件的LC-PUFA>1％。

來自利用不同構(gòu)建體產(chǎn)生的事件的T₂種子的最大LC-PUFA含量從0.71％到2.14％不等。最大DHA含量從0.39％到1.59％不等。最高水平的DHA是第二種取向PTU構(gòu)型的構(gòu)建體，例如pDAB109591、pDAB107962和pDAB107960獲得的。這些構(gòu)建體含有兩種不同的啟動(dòng)子/終止子組合來驅(qū)動(dòng)四個(gè)轉(zhuǎn)基因、以及一個(gè)或三個(gè)天然的PUFA合酶基因。

在產(chǎn)生的所有構(gòu)建體和事件中的最大EPA含量在0-1.17％的范圍。構(gòu)建體pDAB112203(第三種取向PTU構(gòu)型)、pDAB112200(第三種取向PTU構(gòu)型)、pDAB112201(第三種取向PTU構(gòu)型)和pDAB101496(第一種取向PTU構(gòu)型)可有效產(chǎn)生與其他構(gòu)建體相比相對(duì)高水平的EPA。來自這些構(gòu)建體的產(chǎn)LC-PUFA的事件含有與DHA(LC-PUFA的37-45％)相比相對(duì)高比例的EPA(39-56％的LC-PUFA)，而其他構(gòu)建體一般含有較低比例的EPA(LC-PUFA的9-27％)、以及較高比例的DHA(LC-PUFA的60-76％)。

這些數(shù)據(jù)顯示，構(gòu)建體構(gòu)型和基因調(diào)節(jié)元件的選擇可導(dǎo)致在擬南芥種子中產(chǎn)生兩種ω-3 LC-PUFA(DHA和EPA)的效率均提高，并且可以通過選擇構(gòu)建體結(jié)構(gòu)和基因調(diào)節(jié)元件來增加作物植物中產(chǎn)生兩種ω-3 LC-PUFA(DHA和EPA)的效率。

擬南芥T₃種子。

種植來自高產(chǎn)LC-PUFA的擬南芥事件的T₂種子，并通過針對(duì)pat基因和其他轉(zhuǎn)基因的定量PCR反應(yīng)來對(duì)T₂植物的葉組織取樣。鑒定含有轉(zhuǎn)基因的兩個(gè)拷貝的植物(即，純合子)，并使其生長(zhǎng)至成熟。收獲所得的T₃種子，并分析LC-PUFA含量。構(gòu)建體pDAB101454和pDAB101429，它們含有重復(fù)的啟動(dòng)子/終止子表達(dá)元件并使用所有“植物優(yōu)化的”PUFA合酶基因序列，在后續(xù)的T₃種子世代中展現(xiàn)出很差的LC-PUFA性狀穩(wěn)定性，在T₃種子后代中檢出極少的LC-PUFA或沒有LC-PUFA。用具有不同的PTU構(gòu)型和/或多樣化的表達(dá)元件的構(gòu)建體(pDAB109588、pDAB101496)轉(zhuǎn)化的其他事件產(chǎn)生了在T₃種子世代中具有不同的可檢出水平的LC-PUFA的轉(zhuǎn)基因擬南芥品系(表5，圖4)。來自具有完全多樣化的啟動(dòng)子/終止子組合的構(gòu)建體(pDAB109584)、或來自具有按照第一種取向PTU格式的完全天然的PUFA合酶基因序列的構(gòu)建體(pDAB109525)的品系在T₃種子世代中顯示出極好的穩(wěn)定性。組合使用多樣化的啟動(dòng)子/終止子、和/或使用一個(gè)或三個(gè)按照第二種取向或第三種取向的PTU格式的天然PUFA合酶序列，也導(dǎo)致T₃種子世代中一致的穩(wěn)定性(例如，對(duì)于構(gòu)建體pDAB107960和pDAB107961而言)。這產(chǎn)生了含有高達(dá)1.77％的DHA、高達(dá)1.1％的EPA、和高達(dá)2.57％的總LC-PUFA的個(gè)體T₃純合種子系。

表5.來自選定的轉(zhuǎn)基因擬南芥的產(chǎn)DHA T₂系的T₃種子后代的LC-PUFA分析。

總的LC-PUFA、DHA和EPA含量為總FAME的％

1.分析了來自5-20個(gè)單獨(dú)的純合植物的T3種子批次。

表6顯示了示例性的對(duì)于產(chǎn)DHA的轉(zhuǎn)基因?yàn)榧兒系膫€(gè)體擬南芥T₃品系的完整種子脂肪酸概貌，與T₃同胞無效事件(sibling nulls)的平均脂質(zhì)概貌相比較。由PUFA合酶驅(qū)動(dòng)的LC-PUFA的產(chǎn)生與天然長(zhǎng)鏈脂肪酸尤其是二十碳烯酸(22:1)含量的降低、以及油酸(18:1)和亞油酸(18:2)含量的輕度增加相關(guān)。飽和脂肪酸棕櫚酸(16:0)和硬脂酸(18:0)的含量沒有顯著變化。

表6.用PUFA合酶和HetI轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的擬南芥事件的純合T₃種子的脂肪酸概貌。

種植選定的高產(chǎn)DHA的純合T₃系，分析來自這些植物的T₄種子。分析了來自pDAB109591、pDAB109584、pDAB109525、pDAB109592、pDAB107960、和pDAB107961轉(zhuǎn)化的十個(gè)系。這些系在T₄種子世代中繼續(xù)產(chǎn)生DHA(高達(dá)1.85％)和EPA(高達(dá)1.00％)，表明ω-3 LC-PUFA性狀通過三個(gè)自交種子世代的穩(wěn)定傳遞。

實(shí)例4：在用裂殖壺菌屬PUFA合酶轉(zhuǎn)化的芥花種子中的LC-PUFA產(chǎn)生。

利用雙元構(gòu)建體pDAB101496、pDAB109584、pDAB109592、pDAB107960、pDAB107961、pDAB107962和pDAB117501(都含有PUFA合酶基因PFA1、PFA2、PFA3、和念珠藻屬PPT酶NoHetI)產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因芥花，并通過分子確認(rèn)證實(shí)其含有T-鏈轉(zhuǎn)基因的一個(gè)拷貝。

從單獨(dú)的T₀轉(zhuǎn)基因芥花植物收獲T₁種子，對(duì)來自每份T₁種子樣品的約10粒種子的批量種子樣品如前所述地分析LC-PUFA含量。

在針對(duì)每個(gè)構(gòu)建體分析的這些T₁樣品中，高比例(81-93％)的樣品含有LC-PUFA。表7。對(duì)于pDAB107960而言，在芥花T₁種子樣品中觀察到的最大DHA含量是3.04％。對(duì)于pDAB101496而言，觀察到的最大EPA含量為1.97％。對(duì)于pDAB107960而言，最大總ω-3 LC-PUFA含量(DHA+EPA)為4.20％。

表7.在用PUFA合酶和HetI轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化的芥花事件的T₁種子中的LC-PUFA含量的總結(jié)。

為了及早獲得轉(zhuǎn)基因性狀分離的指示，分析了來自選定的T₁種子樣品的48粒種子的LC-PUFA含量。由于孟德爾分離，在單個(gè)基因座處具有T-DNA插入的事件預(yù)期會(huì)產(chǎn)生大致25％的無效種子。在所分析的42個(gè)來自pDAB101496事件的T₁種子樣品中，發(fā)現(xiàn)24個(gè)樣品中有12％到35％的種子不含LC-PUFA(在所有24個(gè)樣品中無效種子的平均比例為24％)。表8。單個(gè)種子檢出的DHA最高達(dá)5.41％、EPA最高達(dá)3.72％、總ω-3 LC-PUFA(DHA+EPA)最高達(dá)7.33％。

表8.來自用pDAB101496轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因事件的純合的T₂芥花種子的LC-PUFA含量。

將選定的T₁芥花種子樣品種植在溫室中以產(chǎn)生約60-75株T₁植物。從4-5葉期的苗取得葉樣品用于DNA分析，以確定每株T₁分離植物中的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)?？截悢?shù)分析通過對(duì)轉(zhuǎn)基因的水解探針測(cè)定來進(jìn)行，使用如上所述的方案。通過這些分析，鑒定出就轉(zhuǎn)基因而言為純合的、雜合的、和無效的植物。對(duì)來自9個(gè)系的純合植物的葉樣品提取的基因組DNA進(jìn)行Southern分析，探測(cè)PFA1轉(zhuǎn)基因、pat轉(zhuǎn)基因(在T-DNA的每個(gè)末端)、和來自質(zhì)粒骨架的SpecR基因的存在。來自6580[1]-035.Sx001和6580[1]-035.Sx002的T₁植物的Southern帶型相似，表 明這些事件很可能為克隆起源，6580[1]-052.Sx001和6580[1]-057.Sx001亦然。Southern分析的結(jié)果顯示在表9中。

表9.來自用pDAB101496轉(zhuǎn)化的十二個(gè)T₁芥花產(chǎn)DHA-系的Southern分析的總結(jié)。

將對(duì)于pDAB101496轉(zhuǎn)基因?yàn)榧兒系慕婊ㄖ参?包括一些雜合和無效植物)培植至成熟，收獲T₂種子，并分析批量種子樣品的LC-PUFA含量。表10。所有十個(gè)選擇的pDAB101496芥花系均在T₂種子中產(chǎn)生了DHA和EPA。最大LC-PUFA含量為3.26％的DHA(6580[1]-035.Sx002系)和1.42％的EPA(6580[1]-035.Sx001系)。在這些系中的ω-3 LC-PUFA(DHA和EPA)的量為總LC-PUFA的80-88％(平均85％)，剩余12-20％為ω-6DPA。半合的T₁植物產(chǎn)生的LC-PUFA較少，原因是T₂種子中PUFA合酶性狀如預(yù)期的分離。圖5。芥花系6580[1]-035.Sx002的純合和無效種子的完整FAME概貌顯示在表10中。該系產(chǎn)生了3.3％的DHA和1.3％的EPA。α-亞麻酸(C18:3)和亞油酸(C18:2)有少許增加，而油酸(C18:1)含量降低。除了預(yù)期的LC-PUFA，DHA、EPA、和DPA之外，還可檢出低水平的新的ω-6脂肪酸，如γ-亞麻酸和花生四烯酸(分別為0.4％和0.7％)。

表10.來自芥花事件6580[1]-035.Sx002的無效和純合植物的批量T₂芥花種子的FAME概貌。每種脂肪酸的脂質(zhì)含量顯示為總FAME的％。

芥花系6580[1]-035.Sx002在批量種子分析中展現(xiàn)出較高水平的DHA和EPA產(chǎn)生，對(duì)于來自該系的同胞純合和半合植物的T₂種子批次進(jìn)行了單種子LC-PUFA分析。圖5。來自純合植物的種子的DHA含量相當(dāng)一致，變異系數(shù)(CV)低于14％。分析了來自對(duì)于轉(zhuǎn)基因?yàn)榧兒系闹参锏乃姆輼悠罚?8個(gè)單顆的種子，這四份樣品的平均DNA含量為3.70％(SD＝0.44，CV＝14％)、3.67％(SD＝0.31，CV＝8％)、3.11％(SD＝0.36，CV＝12％)、和3.11％(SD＝0.35，CV＝11％)。來自半合植物的種子每個(gè)48種子樣品含有平均15粒無效種子，接近于根據(jù)單基因座孟德爾分離預(yù)測(cè)的值，即12粒種子。這些半合植物的單獨(dú)種子的DHA含量可變化至最高達(dá)5.81％。圖5。

將來源于用pDAB101496轉(zhuǎn)化的四個(gè)芥花事件的純合系的T₂種子種植在溫室中，使其生長(zhǎng)產(chǎn)生T₃種子。所有的系均在收獲的T₃種子中繼續(xù)產(chǎn)生DHA和EPA。來源于[6]-274.Sx001和6580[1]-035.Sx002這兩個(gè)事件的系的LC-PUFA產(chǎn)生是特別穩(wěn)定的，在個(gè)體植物的T₃批量種子測(cè)量中分別產(chǎn)生平均：3.16％的DHA(范圍2.73％–3.61％，在來自三個(gè)T₂系的13株植物中)與0.78％的EPA(范圍0.48％–1.13％)；以及3.34％的DHA(范圍2.85％–3.89％，在來自8個(gè)T₂系的53株植物中)與1.12％的EPA(范圍0.75％–1.71％)。

實(shí)施例5：在用PUFA合酶轉(zhuǎn)化的大豆種子中的LC-PUFA產(chǎn)生。

利用雙元構(gòu)建體DAB101454(101454[16]-341.001和101454[267]26702.001)、pDAB101496(101454[330]33007.001、101454[333]33308.001、和101454[334]33402.001)、以及pDAB10796(107960[12]-626.001、107960[12]-641.001、107960[12]-644.001、107960[26]-655.001、和107960[26]-733.001)轉(zhuǎn)化植物而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因T₀大豆事件在溫室中生長(zhǎng)至成熟。選擇含有pat轉(zhuǎn)基因和伴隨的PUFA合酶和HetI轉(zhuǎn)基因的拷貝的大豆事件。使這些選擇的轉(zhuǎn)基因植物自花受精，在成熟時(shí)收獲生成的T₁種子。獲得單顆的種子并通過FAMEs GC-FID進(jìn)行分析，以確定LC-PUFA和DHA含量。通過如下方式逐一地分析每株植物的十二粒完整成熟種子：通 過壓榨機(jī)碾碎種子，并使用鋼球和球磨將其均質(zhì)化。用己烷將組織脫脂三次，合并己烷級(jí)分并蒸發(fā)至干燥，將殘?jiān)Q重，并在己烷中復(fù)原，如前面實(shí)施例中所述進(jìn)行FAME分析。與在相同時(shí)間在相同條件下培植在溫室中的非轉(zhuǎn)基因Maverick對(duì)照栽培種相比，轉(zhuǎn)基因種子的油含量(單獨(dú)的FAME的質(zhì)量的總和除以種子質(zhì)量)以及由轉(zhuǎn)基因T₁系產(chǎn)生的種子的數(shù)目并無顯著差異。選定事件的單顆T₁種子LC-PUFA含量的平均及最大水平(％)匯總于表11中。DHA含量最高達(dá)2.0％，總PUFA達(dá)5.1％。此外，在T₁大豆種子中檢出了3種新的非內(nèi)源LC-PUFA；DHA、EPA、和DPA(n-6)。表11.

表11.表達(dá)3種包含PFA1、PFA2、PFA3和NoHetI基因的構(gòu)建體的10個(gè)事件的T₁種子FAME分析。單顆種子分析結(jié)果表示為L(zhǎng)C-PUFA、EPA、DHA和DPA的最大含量，還加入了每個(gè)事件的所有T₁種子的平均值。計(jì)算了n3LC-PUFA(EPA和DHA)/總LC-PUFA的比率。

在那些含LC-PUFA的T₁種子中，DHA和EPA占LC-PUFA總含量的90％到99％。最高的LCPUFA含量(5.1％)是在構(gòu)建體107960的事件107960[12]-626.001中達(dá)到的。

來自大豆事件101454[16]-341.Sx001、pDAB101496{330}33007.001、107960[12]-626.001、和107960[12]-641.001的單顆T1種子的完整脂質(zhì)概貌顯示在表12中。加入來自Maverick對(duì)照的兩顆種子用于比較。列出了所有檢出的FAME。

表12.來自3個(gè)構(gòu)建體和對(duì)照WT Maverick的單顆種子T₁的脂肪酸甲酯分析。所有組成均以檢出脂肪酸的重量％表示。分析時(shí)未對(duì)全部脂肪酸定量(NA)。數(shù)值0對(duì)應(yīng)于在定量限之下的水平。

實(shí)施例6：來自轉(zhuǎn)基因大豆事件的成熟T₂種子的脂質(zhì)分析。

為了評(píng)估LC-PUFA性狀的遺傳及其跨世代的穩(wěn)定性，測(cè)試了來自三個(gè)構(gòu)建體101454[16]-341.Sx001、107960[12]-641.001、107960[12]-644.001和pDAB101496{334}33402.001的若干代表性事件，并且基于其LCPUFA含量選擇在溫室中培植。使T₁種子在溫室中萌發(fā)，并測(cè)定了T₁小植物的PAT、PFA1和NoHetI轉(zhuǎn)基因的存在。使具有這些轉(zhuǎn)基因的T₁植物生長(zhǎng)至成熟，收獲自交產(chǎn)生的T₂種子，用于進(jìn)一步油分析。通過實(shí)施例1中描述的方法，逐一地分析來自每個(gè)T₂植物的5到11粒T₂種子的FAME。表13中加入了T₁種子的結(jié)果，以粗體表示，作為參照。事件107960[12]-644.001和pDAB101496{334}33402.001的T₁系不是純合的，因此，一些T₂分離種子不含LC-PUFA(最小LC-PUFA為0)。事件101454[16]-341.Sx001的T₂種子顯示出穩(wěn)定的LC-PUFA含量(2.2％到5.6％)，與T₁相當(dāng)(3％)。觀察到平均PUFA的少量增加是由于選擇轉(zhuǎn)基因基因座純合的植物，從而消除了T₂子代中的同胞無效種子所致。大多數(shù)LC-PUFA是n3(比率＝0.9)，分為EPA(0.6到2.4％)和DHA(1.3到2.7％)。來自事件107960[12]-641.001的T₂種子與親本種子相比顯示出相似的趨勢(shì)。LC-PUFA含量(1.5％到2.1％)與T₁種子相當(dāng)(3.2％)。所有從事件pDAB101496{334}33402.001選出的系均具有無LC-PUFA的T₂種子，表明T₁植物的轉(zhuǎn)基因基因座未固定。T₂種子的平均LC-PUFA含量(0.1％到1.1％)與T₁相當(dāng)(0.6％)。所有這些構(gòu)建體的LC-PUFA性狀均被遺傳到下一代，累積的LC-PUFA的量沒有顯著性差異。

表13.選自三個(gè)構(gòu)建體的三個(gè)事件的T₂種子油分析。單顆種子的分析結(jié)果顯示為總LC-PUFA、EPA、DHA和DPA的最小和最大含量，并在所有分析的種子之間取平均。計(jì)算了n3LC-PUFA(EPA和DHA)/總LC-PUFA的比率。

實(shí)施例7：田間栽培的pDAB101496的芥花種子的LC-PUFA產(chǎn)生。

將來源于產(chǎn)生中等到高水平DHA的六個(gè)pDAB101496(SEQ ID NO:17)芥花事件(上述)的若干純合T1植物的T₂芥花種子獨(dú)立地合并批次。將該種子于2013年種植在明尼蘇達(dá)州和北達(dá)科他州的田間。將來自未轉(zhuǎn)化植物的入選芥花種子用作對(duì)照，用市售的芥花系用作核對(duì)(check)。每種入選種子播種四塊重復(fù)樣地(1.2 x 6m)，并且在成熟時(shí)從每塊樣地收獲所得的種子(在轉(zhuǎn)基因樣品的情況下為T₃種子)分析LC-PUFA含量。對(duì)來自四塊重復(fù)田間樣地中的每一塊的批量籽粒采取三份試樣，每份10粒，根據(jù)所述試樣的FAME提取物確定從每塊實(shí)驗(yàn)樣地收獲的芥花籽粒的LC-PUFA含量。表14.

在每種入選種子的四塊田間樣地中，事件6580[1]-035.Sx002的最大DHA和EPA含量分別為4.27％和0.65％。單塊樣地的最大DHA含量為4.54％。將每個(gè)事件用于田間種植的同一成批T₂種子系也在溫室中進(jìn)行培育，以比較所得T₃種子的LC-PUFA含量。排名最前的四種田間種植的pDAB101496系的DHA 含量比溫室中培育的等同系平均高22％。表14.

表14.在田間和溫室中培植的用pDAB101496轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因事件的T₃芥花種子的LC-PUFA含量(總FAME％)。

^*對(duì)于田間樣品為來自田間樣地的批量種子；對(duì)于溫室樣品為來自各單株植物的批量種子的數(shù)目

產(chǎn)DHA的轉(zhuǎn)基因芥花系相對(duì)于非轉(zhuǎn)基因DH12075植物籽粒產(chǎn)量沒有顯著性差異。表15。所有在田間培育的系產(chǎn)生的種子的平均油含量>40％g油/g種子。在轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩g，種子的葉綠素含量或提取油之后的每克菜籽粕的種子蛋白％沒有顯著性差異。花期和成熟時(shí)間(time to maturity)在轉(zhuǎn)基因系和對(duì)照植物之間沒有變化。

表15.用pDAB101496轉(zhuǎn)化的純合T2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)DHA芥花植物田間種植后的T₃種子產(chǎn)量，與非轉(zhuǎn)基因DH12075芥花比較。產(chǎn)量為每個(gè)位置四塊樣地的平均值(SD＝均值的標(biāo)準(zhǔn)差)。

合并來自田間試驗(yàn)的多批籽粒，碾碎用于提取含LC-PUFA的油，并使用標(biāo)準(zhǔn)方法通過精煉、漂白和脫臭進(jìn)行油處理。處理兩批種子，產(chǎn)生含3.02％DHA和1.0％EPA的1.2kg的RBD油，以及含4.1％DHA和0.7％EPA的1.0kg的RBD油。這證明，來自表達(dá)PUFA合酶和HetI的轉(zhuǎn)基因芥花植物的籽?？梢约庸ぎa(chǎn)生高度富含DHA和EPA的芥花油。

實(shí)例8：pDAB107960芥花事件在多個(gè)種子世代中的LC-PUFA性狀穩(wěn)定性。

對(duì)于質(zhì)粒pDAB107960，當(dāng)在擬南芥中進(jìn)行測(cè)試時(shí)，通過結(jié)合使用多樣化的啟動(dòng)子/終止子組合，以及在第二種取向PTU形式中的三個(gè)天然PUFA合酶序列，導(dǎo)致直到T₃種子世代LC-PUFA性狀都是一致穩(wěn)定的。表5。類似地測(cè)試了用pDAB107960產(chǎn)生的芥花事件經(jīng)過三個(gè)自交的作物種子世代的LC-PUFA性狀穩(wěn)定性。

通過如前所述的T₁種子單顆種子分析選定了九個(gè)pDAB107960芥花事件，將它們的T₁種子種植在溫室中。將pDAB107960轉(zhuǎn)基因純合且作為單個(gè)孟德爾基因座分離的植物培植至成熟，從植物收獲T₂種子，并分析種子樣品的LC-PUFA含量。所有來自九個(gè)選定的pDAB107960芥花事件的植物均在T₂種子中產(chǎn)生DHA和EPA。表16、將來自七個(gè)事件(113株植物)的T₂種子種植在溫室中，培植至成熟，從這些植物收獲T₃種子。再次分析來自每個(gè)子代植物的種子樣品的LC-PUFA含量。來自這七個(gè)選定的pDAB107960事件的所有113株T₂芥花植物均在T₃種子中產(chǎn)生DHA和EPA。表16。將來源于六個(gè)事件(137株植物)的T₃種子種植在溫室中，培植至成熟，從這些植物收獲T₄種子。來自該六個(gè)選定的pDAB107960事件的所有137株芥花T₃植物均在T₄種子中產(chǎn)生DHA和EPA。表16。測(cè)試的六個(gè)事件中的五個(gè)在每個(gè)種子世代中保持了相似 的高水平DHA，從而證明了在多個(gè)事件中的DHA性狀穩(wěn)定性。

表16.來自pDAB107960芥花事件的純合系的T₂、T₃、和T₄芥花種子的LC-PUFA含量。LC-PUFA含量顯示為總FAME的％。

如前所述地確定了在達(dá)到T4種子世代的六個(gè)單基因座pDAB107960芥花事件中的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)。事件107960[6]-106、107960[6]-107、107960[7]-111、和107960[6]-353含有所有轉(zhuǎn)基因的兩個(gè)拷貝，而事件107960[7]-085和107960[6]-352含有所有轉(zhuǎn)基因(PFA1、PFA2、PFA3、NoHetI)的一個(gè)拷貝。因此，LC-PUFA性狀與轉(zhuǎn)基因集的一個(gè)或兩個(gè)拷貝一起傳遞，并在三個(gè)種子世代中保持穩(wěn)定。

來源于兩個(gè)不同事件(107960[7]-085和107960[6]-353)的兩個(gè)T₃植物的批量T₄種子樣品的完整FAME概貌顯示在表17中。這些種子分別含有4.4％和4.6％的DHA、以及0.6％和0.7％的EPA。伴隨有油酸(C18:1)含量的增加(-8％)、和亞油酸(18:2)含量的稍微增加(+2％)，除此之外，該概貌并未由于新的LC-PUFA的存在而顯著改變。除了DHA、EPA、和DPA(n-6)這幾種預(yù)期的LC-PUFA之外，還可檢出低水平的新的ω-6脂肪酸——γ-亞麻酸(GLA，18:3)和花生四烯酸(ARA，20:4)(總計(jì)約1％)。

表17.來源于兩個(gè)pDAB107960事件的T4芥花種子的FAME概貌，與來自非轉(zhuǎn)基因的DH12075對(duì)照種子比較。脂肪酸含量以總FAME的％表示。

^*沒有質(zhì)粒

實(shí)施例9：田間栽培的來自pDAB107960的T₄芥花種子中的LC-PUFA產(chǎn)生。

將來源于六個(gè)不同的pDAB107960產(chǎn)生約3％DHA的芥花事件(上述)的純合T₂植物的T₃芥花種子各自獨(dú)立地合并批次。這種種子于2014年種植在北達(dá)科他州兩個(gè)地點(diǎn)的田間。來自未轉(zhuǎn)化的DH12075植物的入選芥花種子用作對(duì)照，并且市售的芥花系用作核對(duì)(check)。每種入選種子種植四塊重復(fù)樣地(1.2 x 6m)，從每塊樣地收獲所得的種子(用于轉(zhuǎn)基因樣品的T₄種子)，并通過FAME分析如前所述分析LC-PUFA含量。自四塊重復(fù)田間樣地的每一塊的批量籽粒采取三批技術(shù)重復(fù)，每批10粒種子，對(duì)技術(shù)重復(fù)進(jìn)行FAME提取。表18。

表18：在北達(dá)科他州田間培育的用pDAB107960轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因事件的T₄芥花種子的LC-PUFA含量(表示為總FAME的％)。各數(shù)值為每個(gè)地點(diǎn)的四塊重復(fù)樣地的平均值。

在地點(diǎn)1，事件107960[6]-353和107960[6]-106的最大DHA和EPA含量(每個(gè)項(xiàng)目的四塊樣地的平均值)分別為3.98％和0.88％。在地點(diǎn)1，事件107960[6]-353的來自單塊樣地的最大DHA含量為4.69％。將每個(gè)事件用于田間種植的同一成批T₃種子系也在溫室中進(jìn)行培育，以比較所得T₄種子的LC-PUFA含量。表16。在兩個(gè)地點(diǎn)的所有六個(gè)田間培植的pDAB107960事件中的平均DHA含量為3.24％，而在溫室中培植的所有等同事件中的平均DHA含量為3.06％。因此，田間培植的芥花的DHA含量比等同的溫室培植的材料平均高+6％。