本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域，具體涉及2,5-二(取代氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑類化合物在抑制藍(lán)藻生長中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：近年來，各地不斷大規(guī)模暴發(fā)藍(lán)藻水華事件，藻害直接影響周邊地區(qū)生活用水和工業(yè)用水，嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境，給漁業(yè)生產(chǎn)和旅游業(yè)發(fā)展帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也給公眾健康帶來極大隱患。使用化學(xué)殺藻劑具有經(jīng)濟(jì)、高效、方便、起效快等優(yōu)點(diǎn)，一直是藻害綜合治理體系中不可缺少的重要組成部分，尤其是在藍(lán)藻水華大規(guī)模暴發(fā)期間，更是短期快速治理和控制藻害等緊急情況最主要的防治手段?，F(xiàn)有的化學(xué)殺藻劑主要有以硫酸銅及其絡(luò)合物為代表的重金屬化合物類殺藻劑；以高錳酸鉀、高鐵酸鹽、過氧化物為代表的強(qiáng)氧化劑類殺藻劑；以三唑啉酮類、三嗪類等為代表的除草劑類殺藻劑等。但是這些殺藻劑存在選擇性差、藥劑用量大、對魚類毒性較大等問題，極大地限制了使用化學(xué)方法防治藻害效能的充分發(fā)揮。因此，選擇性差、毒性大、藍(lán)藻抗性日益增強(qiáng)是現(xiàn)代化學(xué)殺藻劑創(chuàng)制研究中亟待解決的的一個(gè)非常重要的問題，以藍(lán)藻中重要的酶為靶標(biāo)，探索發(fā)現(xiàn)對該酶具有抑制作用，同時(shí)也具有較高殺藻活性的化合物，是解決這一問題的途徑之一。研究表明，藍(lán)藻體內(nèi)普遍存在的果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶(cy-FBP/SBPase)在藍(lán)藻Calvin循環(huán)碳代謝調(diào)控過程中處于非常重要的戰(zhàn)略性地位，是一個(gè)潛在的殺藻劑靶標(biāo)，若藍(lán)藻果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶受到抑制或發(fā)生突變，將導(dǎo)致藍(lán)藻無法生長甚至死亡。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供2,5-二(取代氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑類化合物在抑制藍(lán)藻果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶及抑制藍(lán)藻生長中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：2,5-二(取代氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑類化合物在藍(lán)藻果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶活性抑制中的應(yīng)用。一種藍(lán)藻果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶抑制劑，包含2,5-二(取代氨基甲酰基甲硫基)-1,3,4-噻二唑類化合物。2,5-二(取代氨基甲酰基甲硫基)-1,3,4-噻二唑類化合物在抑制藍(lán)藻生長中的應(yīng)用。2,5-二(取代氨基甲酰基甲硫基)-1,3,4-噻二唑類化合物在藍(lán)藻水華治理中的應(yīng)用。一種藍(lán)藻抑制劑，包含2,5-二(取代氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑類化合物。所述的藍(lán)藻抑制劑還包含水體中允許的載體和/或稀釋劑。所述的藍(lán)藻抑制劑的劑型包括水合劑、乳劑、水溶劑、可流動劑等。上述2,5-二(取代氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑類化合物的結(jié)構(gòu)如式Ⅰ所示：其中，R1、R2、R3、R4、R5優(yōu)選為氫、鹵素、烷基、羥基、三氟甲基或硝基中的任一個(gè)基團(tuán)。本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了式Ⅰ所示的2,5-二(取代氨基甲酰基甲硫基)-1,3,4-噻二唑類化合物對藍(lán)藻果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶具有較好的抑制效果，可用于藍(lán)藻果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶活性的抑制。藍(lán)藻果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶酶體實(shí)驗(yàn)表明：此類化合物對藍(lán)藻果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶有較好的抑制效果。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了式Ⅰ所示的2,5-二(取代氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑類化合物對藍(lán)藻有較好的抑制作用，可作為殺藻劑的有效成份運(yùn)用于藍(lán)藻水華的綜合治理中。式Ⅰ所示化合物作為抑藻劑使用的情況下，可以與水體中允許的載體或稀釋劑混合，借此將其調(diào)制成通常使用的各種劑型，如水合劑、乳劑、水溶劑、可流動劑等，作為抑藻劑使用。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。下面通過實(shí)施例1來具體地說明式Ⅰ所示的2,5-二(取代氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑類化合物的制備。式Ⅰ所示的化合物的制備方法包括如下步驟：(1)使2,5-二巰基-1,3,4-噻二唑與氯乙酸鈉在堿性條件下反應(yīng)，然后酸化得到反應(yīng)中間體(式Ⅱ所示化合物)；(2)用中間體與具有不同取代基的苯胺(式Ⅲ所示化合物，R1、R2、R3、R4、R5同上)在脫水劑DCC以及氬氣(Ar) 保護(hù)下反應(yīng)，經(jīng)后處理即可得到相應(yīng)的目標(biāo)產(chǎn)物。步驟(1)和(2)的反應(yīng)式如下：上述第(2)步反應(yīng)用DCC做脫水劑，將反應(yīng)液倒入水中后即可以除去副產(chǎn)物N,N'-二環(huán)己基脲，析出目標(biāo)產(chǎn)物。抽濾，乙醇重結(jié)晶，得到純的產(chǎn)物。實(shí)施例1化合物I-12,5-二(對碘苯氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑的制備(1)將20mmol2,5-二巰基-1,3,4-噻二唑溶解到8.0mL20％的氫氧化鈉溶液中，攪拌下滴加37.8mL30％的氯乙酸鈉溶液，控制pH值10～11之間，反應(yīng)6h。濃鹽酸酸化至pH＝2，得大量白色沉淀。抽濾，水洗，烘干后用乙醇重結(jié)晶，再次烘干后得到純的化合物Ⅱ。(2)將1.5mmol化合物Ⅱ和3.3mmol對碘苯胺加入到3.0mL無水DMF中，氬氣保護(hù)，冰水浴冷至0～5℃。0.31gDCC溶于1.0mL無水DMF中，再把DCC溶液加入到上述混合液，3min加完。室溫?cái)嚢?h，靜置過夜。過濾，濾液倒入40mL水中，析出白色沉淀。再次過濾，水洗，烘干，乙醇重結(jié)晶，烘干后得到純的2,5-二(對碘苯氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑，產(chǎn)率23.4％，m.p.237-238℃。分子式：C18H14I2N4O2S3；1HNMR(600MHz,DMSO)δ10.47(s,2H),7.65(d,J＝8.6Hz,4H),7.40(d,J＝8.6Hz,4H),4.25(s,4H)；MS(ESI):m/z＝667.89,calcdforC18H14I2N4O2S3,[M]+:667.84?；衔颕-2～I(xiàn)-19均按類似制備化合物I-1的方法制備，區(qū)別在于將步驟(2)中的對碘苯胺換成相應(yīng)取代基的苯胺?；衔颕-22,5-二(對溴苯氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑的制備所得純品為白色粉末，產(chǎn)率為6.2％，m.p.230-232℃。分子式：C18H14Br2N4O2S3；1HNMR(600MHz,DMSO)δ10.50(s,2H),7.54(d,J＝8.9Hz,4H),7.50(d,J＝8.7Hz,4H),4.25(s,4H)；MS(ESI):m/z＝574.15,calcdforC18H14Br2N4O2S3,[M]+:573.86?；衔颕-32,5-二(對三氟甲基苯氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑的制備所得純品為白色粉末，產(chǎn)率為9.5％，m.p.204-205℃。分子式：C20H14F6N4O2S3；1HNMR(600MHz,DMSO)δ10.73(s,2H),7.77(d,J＝8.6Hz,4H),7.68(d,J＝8.8Hz,4H),4.30(s,4H).MS(ESI):m/z＝552.20,calcdforC20H14F6N4O2S3,[M]+:552.02。化合物I-42,5-二(苯氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑的制備所得純品為白色粉末，產(chǎn)率為11.8％，m.p.182-183℃。分子式：C18H16N4O2S3；1HNMR(600MHz,DMSO)δ10.36(s,2H),7.56(s,4H),7.31(s,4H),7.07(s,2H),4.26(s,4H)；MS(ESI):m/z＝416.38,calcdforC18H16N4O2S3,[M+H]+:416.04。化合物I-52,5-二(對硝基苯氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑的制備所得純品為黃色粉末，產(chǎn)率為5.3％，m.p.226-228。分子式：C18H14N6O6S3；1HNMR(600MHz,DMSO)δ10.97(s,2H),8.24(t,J＝9.7Hz,4H),7.82(t,J＝11.1Hz,4H),4.33(s,4H)；MS(ESI):m/z＝505.74,calcdforC18H14N6O6S3,[M]+:506.01。化合物I-62,5-二(鄰氯苯氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑的制備所得純品為白色粉末，產(chǎn)率為12.7％，m.p.156-158℃。分子式：C18H14Cl2N4O2S3；1HNMR(600MHz,DMSO)δ9.94(s,2H),7.74(d,J＝7.4Hz,2H),7.49(d,J＝7.9Hz,2H),7.33(t,J＝7.7Hz,2H),7.20(t,J＝7.5Hz,2H),4.33(s,4H)；MS(ESI):m/z＝485.02,calcdforC18H14Cl2N4O2S3,[M]+:483.97?；衔颕-72,5-二(對氯苯氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑的制備所得純品為白色粉末，產(chǎn)率為13.8％，m.p.209-211℃。分子式：C17H10BrClN2O3；1HNMR(600MHz,DMSO)δ10.50(s,2H),7.59(d,J＝8.9Hz,4H),7.37(d,J＝8.8Hz,4H),4.26(s,4H)；MS(ESI):m/z＝485.32,calcdforC17H10BrClN2O3,[M]+:483.97?；衔颕-82,5-二(對羥基苯氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑的制備所得純品為白色粉末，產(chǎn)率為54.4％，m.p.216-218℃。分子式：C18H16N4O4S3；1HNMR(600MHz,DMSO)δ10.15(s,2H),9.27(s,2H),7.35(d,J＝8.7Hz,4H),6.70(d,J ＝8.7Hz,4H),4.20(s,4H)；MS(ESI):m/z＝448.9130,calcdforC18H16N4O4S3,[M]+:448.03?；衔颕-92,5-二(對氟苯氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑的制備所得純品為白色粉末，產(chǎn)率為11.1％，m.p.194-196℃。分子式：C17H10BrFN2O3；1HNMR(600MHz,DMSO)δ10.43(s,2H),7.58(dd,J＝8.6,5.0Hz,4H),7.16(t,J＝8.7Hz,4H),4.25(s,4H)；MS(ESI):m/z＝452.36,calcdforC17H10BrFN2O3[M]+:452.02。化合物I-102,5-二(間氯苯氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑的制備所得純品為白色粉末，產(chǎn)率為13.6％，m.p.195-197℃。分子式：C18H14Cl2N4O2S3；1HNMR(600MHz,DMSO)δ10.57(s,2H),7.78(s,2H),7.42(d,J＝8.1Hz,2H),7.35(t,J＝8.0Hz,2H),7.14(d,J＝7.7Hz,2H),4.27(s,4H)；MS(ESI):m/z＝385.0189,calcdforC18H14Cl2N4O2S3,[M]+:483.97?；衔颕-112,5-二(鄰甲基苯氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑的制備所得純品為白色粉末，產(chǎn)率為10.3％，m.p.180-181℃。分子式：C20H20N4O2S3；1HNMR(400MHz,dmso)δ9.69(s,2H),7.47–7.02(m,8H),4.28(s,4H),2.18(s,6H)；MS(ESI):m/z＝389.1120,calcdforC20H20N4O2S3,[M]+:444.07?；衔颕-122,5-二(鄰甲基對氯苯氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑的制備所得純品為白色粉末，產(chǎn)率為19.6％，m.p.207-209℃。分子式：C20H18N2O4；1HNMR(400MHz,dmso)δ9.74(s,2H),7.44(d,J＝8.6Hz,2H),7.29(s,2H),7.21(d,J＝8.5Hz,2H),4.28(s,4H),2.18(s,6H)；MS(ESI):m/z＝373.1161,calcdforC20H18N2O4,[M]+:512.00?；衔颕-132,5-二(對甲基苯氨基甲酰基甲硫基)-1,3,4-噻二唑的制備所得純品為白色粉末，產(chǎn)率為9.9％，m.p.200-202℃。分子式：C20H20N4O2S3；1HNMR(400MHz,DMSO)δ10.27(s,2H),7.44(d,J＝8.4Hz,4H),7.11(d,J＝8.3Hz,4H),4.23(s,4H),2.25(s,6H)；MS(ESI):m/z＝375.0964,calcdforC20H20N4O2S3,[M]+:444.07?；衔颕-142,5-二(間甲基對氯苯氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑的制備所得純品為白色粉末，產(chǎn)率為11.9％，m.p.201-203℃。分子式：C20H18Cl2N4O2S3；1HNMR(600MHz,DMSO)δ9.75(s,2H),7.36(dd,J＝8.6,5.7Hz,2H),7.12–7.04(m,2H),6.99(dd,J＝11.4,5.5Hz,2H),4.27(s,4H),2.18(s,6H)；MS(ESI):m/z＝367.1456,calcdforC20H18Cl2N4O2S3,[M]+:512.00?；衔颕-152,5-二(2,6-二甲基-對溴苯氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑的制備所得純品為白色粉末，產(chǎn)率為15.9％，m.p.246-248℃。分子式：C22H22Br2N4O2S3；1HNMR(600MHz,DMSO)δ9.73(s,2H),7.28(s,4H),4.27(s,4H),2.10(s,12H)；MS(ESI):m/z＝386.9980,calcdforC22H22Br2N4O2S3,[M]+:629.93?；衔颕-162,5-二(鄰甲基對溴苯氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑的制備所得純品為白色粉末，產(chǎn)率為9.3％，m.p.216-219℃。分子式：C20H18Br2N4O2S3；1HNMR(400MHz,DMSO)δ9.74(s,2H),7.54–7.27(m,6H),4.30(s,4H),2.20(s,6H)；MS(ESI):m/z＝399.0349,calcdforC20H18Br2N4O2S3,[M]+:601.89。化合物I-172,5-二(鄰甲基對氟苯氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑的制備所得純品為白色粉末，產(chǎn)率為19.0％，m.p.197-198℃。分子式：C20H18F2N4O2S3；1HNMR(600MHz,DMSO)δ10.44(s,2H),7.58(s,2H),7.41(s,2H),7.34(d,J＝7.3Hz,2H),4.26(s,4H),2.29(s,6H)；MS(ESI):m/z＝429.0632,calcdforC20H18F2N4O2S3,[M]+:480.06?；衔颕-182,5-二(間甲基苯氨基甲酰基甲硫基)-1,3,4-噻二唑的制備所得純品為白色粉末，產(chǎn)率為12.5％，m.p.186-187℃。分子式：C20H20N4O2S3；1HNMR(600MHz,DMSO)δ10.31(s,2H),7.44(s,2H),7.35(d,J＝7.5Hz,2H),7.19(t,J＝7.5Hz,2H),6.89(d,J＝6.8Hz,2H),4.26(s,4H),2.27(s,6H)；MS(ESI):m/z＝365.1517,calcdforC20H20N4O2S3,[M]+:444.07。實(shí)施例2對實(shí)施例1制備的2,5-二(取代氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑類化合物進(jìn)行藍(lán)藻果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶抑制試驗(yàn)。藍(lán)藻果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶水解果糖-1,6-二磷酸為果糖-6-磷酸和無機(jī)磷酸。因此可以通過測定無機(jī)磷酸的增加量來測定藍(lán)藻果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶的活性，進(jìn)而反映出上述2,5-二(取代氨基甲酰基甲硫基)-1,3,4-噻二唑類化合物作為抑制劑的抑制效率。具體操作如下：(1)預(yù)先稱量化合物，用DMSO溶解，配制0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30mM等不同濃度的上述的2,5-二(取代氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑類化合物。(2)測定果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶酶活性的反應(yīng)體系含：50mMTris-HCl(pH8.3)、10mM二硫蘇糖醇(DTT)、15mMMgCl2、0.04μg果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶。向96孔板的每個(gè)孔中加入100μL配制好的反應(yīng)體系，然后再加入0.5μL不同濃度的上述的2,5-二(取代氨基甲酰基甲硫基)-1,3,4-噻二唑類化合物。每個(gè)濃度的化合物平行做3組，同時(shí)設(shè)置不含化合物的空白對照(加入DMSO)和化合物背景對照(用DMSO溶解配制的化合物體系)。30℃孵育5分鐘。(3)加入20μL2.5mM底物果糖-1,6-二磷酸啟動酶對底物的催化反應(yīng)。30℃反應(yīng)5min。向96孔板的每個(gè)孔中加12.5μL高氯酸終止反應(yīng)。用多功能酶標(biāo)儀(BioteckSynergy2,USA)檢測反應(yīng)后體系在波長為620nm時(shí)的光吸收值，按下式計(jì)算相應(yīng)化合物對酶的抑制率。通過下述公式計(jì)算抑制率：抑制率＝(A0-Ai)/A0×100％其中，A0為沒有加抑制劑時(shí)體系的吸光度，Ai為加入抑制劑時(shí)體系的吸光度。以化合物的濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)作圖，在Origin里用公式logistic擬合，求得上述2,5-二(取代氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑類化合物對酶抑制的IC50值。結(jié)果列于表1。實(shí)施例3對實(shí)施例1制備的2,5-二(取代氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑類化合物進(jìn)行集胞藻PCC6803藻體水平生長抑制試驗(yàn)。集胞藻PCC6803是藍(lán)藻中最重要的一種模式藻類。因此選擇集胞藻PCC6803作為活體實(shí)驗(yàn)對象。集胞藻PCC6803培養(yǎng)于含不同濃度上述化合物的BG-11(+N)液體培養(yǎng)基中，在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)?？刂婆囵B(yǎng)箱溫度為28℃±1℃，濕度60％，光強(qiáng)為6000lx，12h(光照):12h(黑暗)，振動模式，另每日人工搖3次。具體操作如下：(1)預(yù)培養(yǎng)一批集胞藻PCC6803，待生長4-7天到對數(shù)期后，測OD680，接種待用。(2)用新鮮的BG-11(+N)培養(yǎng)基稀釋上述對數(shù)期藻液，獲得接種藻液，并控制藻細(xì)胞濃度約1×106個(gè)/mL。(3)向96孔板中的每個(gè)孔中加入200μL稀釋好的接種藻液，然后再加入配制好的1μL10mM上述2,5-二(取代氨基甲酰基甲硫基)-1,3,4-噻二唑類化合物。每種化合物平行做5組，同時(shí)設(shè)置不含化合物的空白對照(藻液體系中加入DMSO)和化合物背景對照(用DMSO溶解配制的化合物體系)。(4)在人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天后用酶標(biāo)儀測OD680，計(jì)算不同濃度化合物的抑制率；抑制率計(jì)算公式：生長抑制率＝[空白對照組OD680-(實(shí)驗(yàn)組OD680-化合物背景對照組OD680)]×100/空白對照組OD680。結(jié)果列于表1。表1.2,5-二(取代氨基甲?；琢蚧?-1,3,4-噻二唑類化合物對果糖-1,6-/景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶抑制的IC50及其在50μM時(shí)對藍(lán)藻的抑制率化合物R1R2R3R4R5IC50(μM)抑制率(％)I-1HHIHH6.28±0.3283.57I-2HHBrHH3.82±0.5094.14I-3HHCF3HH2.02±0.2668.81I-4HHHHH1.40±0.4382.91I-5HHNO2HH2.30±0.5271.28I-6ClHHHH6.23±0.4185.34I-7HHClHH2.44±0.5466.18I-8HHOHHH4.98±1.4190.13I-9HHFHH3.31±0.9265.00I-10HClHHH5.52±1.8486.39I-11CH3HHHH0.37±0.0968.07I-12CH3HClHH0.26±0.1160.64I-13HHCH3HH11.41±1.8286.25I-14HCH3ClHH6.28±0.3278.07I-15CH3HBrHCH33.82±0.5060.64I-16CH3HBrHH2.02±0.2687.07I-17CH3HFHH1.40±0.4369.64I-18HCH3HHH2.30±0.5278.07上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3