本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)方法，具體為一種野生山桃稠李組織培養(yǎng)方法。

背景技術：
山桃稠李正名為斑葉稠李(學名：Padusmaackii(Rupr.)Kom)小喬木，高4-10m。葉橢圓形，菱狀卵形、稀有矩圓狀倒卵形，長4-8cm，葉緣具不規(guī)則帶腺銳鋸齒，背面沿中脈被短柔毛，被紫褐色腺體?？偁罨ㄐ?，基部無葉?；ò咨嗷芗?；花柱和雄蕊近等長。果近球形，徑5-7mm，紫褐色。花期4-5月，果期6-10月。潤肥沃的砂質壤土上生長良好，萌蘗力強，病蟲害少。喜光也耐陰，抗寒力較強，怕積水澇洼，不耐干旱瘠薄，在濕潤肥沃的砂質壤土上生長良好，萌蘗力強，病蟲害少。隨著對園林綠化樹種種類以及質量的需求與日俱增，山桃稠李的發(fā)展前景十分廣闊。黑龍江省林業(yè)科學研究所在2009年-2014年在黑龍江省內的林區(qū)進行了大量的調查，發(fā)現(xiàn)黑龍江省林區(qū)野生的山桃稠李具有良好的抗逆性，并且樹干筆直，枝葉茂盛，花期果期都很長，是優(yōu)良的園林綠化樹種。2009年在黑龍江省哈爾濱市區(qū)，黑龍江省林業(yè)科學研究所苗圃進行了扦插繁殖，成活率非常低。所以，又進行了種子繁殖實驗，成活率相對高些，但是，出苗率仍然很低，苗木成本非常高。而且，有性繁殖很難保存原生母本的優(yōu)良特性。國內目前，針對黑龍江省林區(qū)的野生山桃稠李的組織培養(yǎng)還沒有系統(tǒng)的研究。

技術實現(xiàn)要素：
針對上述問題，本發(fā)明的目的在于設計提供一種野生山桃稠李的組織培養(yǎng)方法的技術方案，該方法采用不定芽增殖途徑，經(jīng)過不定芽增殖、壯苗、生根過程，直接建立試管苗再生體系，該方法操作簡單，繁殖系數(shù)高，有效保存了野生山桃稠李的特異種質資源的母本遺傳信息，為選育山桃稠李的新品系奠定基礎。本發(fā)明的一種野生山桃稠李組織培養(yǎng)方法，它是按照以下步驟進行的：一、外植體的選?。和庵搀w選取野外山桃稠李植株；二、外植體消毒：取帶頂芽的側芽作為外植體剪成4～5cm的帶芽莖段，采用洗衣粉清洗干凈，然后再用清水沖洗1～2h；置于超凈工作臺上用體積百分含量為75％的乙醇浸泡30s，用無菌水沖洗3次，放在無菌濾紙上風干，再用質量百分含量為0.1％升汞消毒8min，然后用無菌水沖洗3次；三、初代培養(yǎng)：將消毒外植體剪成1cm左右的莖段接入初代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為20～24℃，光照強度為2000lx，光照時間每天12h，培養(yǎng)30天；所述初代培養(yǎng)基由改良WPS培養(yǎng)基+濃度為1.0mg/L的6-芐氨基腺嘌呤+濃度為0.5mg/L的萘乙酸組成；四、不定芽的增殖培養(yǎng)：將初代培養(yǎng)的帶芽莖段接入增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為20～24℃，光照強度為2000lx，光照時間每天12h，培養(yǎng)周期為40天；所述增殖培養(yǎng)基由改良WPS+濃度為1.5mg/L的6-芐氨基腺嘌呤+濃度為0.5mg/L的萘乙酸組成；五、壯苗培養(yǎng)：將在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)至長度達到1cm以上的不定芽逐個切下，接入1/2改良WPS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為20～24℃，光照強度為2000lx，光照時間每天12h，培養(yǎng)周期為40天；六、生根培養(yǎng)：將壯苗培養(yǎng)基中的健康健壯的芽接入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為20～24℃，光照強度為2000lx，光照時間每天12h，培養(yǎng)30天；所述的生根培養(yǎng)基由1/4改良WPS培養(yǎng)基+濃度為0.5mg/L的萘乙酸組成；所述的改良WPS培養(yǎng)基由大量元素、微量元素、鐵鹽和有機成分組成：所述的大量元素為：(1)濃度為400mg/L的硝酸銨、(2)濃度為190mg/L的硝酸鉀、(3)濃度為170mg/L的磷酸二氫鉀、(4)濃度為370mg/L的硫酸鎂、(5)濃度為684mg/L的硝酸鈣；所述的鐵鹽為：(1)濃度為27.85mg/L的硫酸亞鐵、(2)濃度為37.28mg/L的乙二胺四乙酸鹽；所述的微量元素為：(1)濃度為22.5mg/L的硫酸錳、(2)濃度為8.6mg/L的硫酸鋅、(3)濃度為0.25mg/L的硫酸銅、(4)濃度為6.2mg/L的硼酸、(5)濃度為0.25mg/L的鉬酸鈉；所述的有機成分為：(1)濃度為0.1mg/L的鹽酸硫胺素、(2)濃度為0.5mg/L的鹽酸吡哆辛、(3)濃度為0.5mg/L的煙酸、(4)濃度為2.0mg/L的甘氨酸、(5)濃度為100mg/L的肌醇。本發(fā)明包含以下有益效果：采用本發(fā)明的方法帶頂芽的側芽萌發(fā)率高達82.8％，無菌萌發(fā)率達到61.3％，增殖系數(shù)達到4.89，生根率91.2％。本發(fā)明的方法能較好的保持母本的抗逆性和觀賞性，大大縮短了育苗周期，5個月即可獲得生根苗木，有效提高了山桃稠李的繁殖系數(shù)；與種子繁殖相比，組織培養(yǎng)可以有效的提供低成本的高觀賞性的綠化苗木，能有效降低苗木成本，節(jié)省開支；與體胚發(fā)生組織培養(yǎng)方法相比，采用不定芽增殖并直接生根成苗的方法，大大降低了母本發(fā)生變異的風險，能更好的保持母本的抗逆性和觀賞性。具體實施方式具體實施方式一：本實施方式的一種野生山桃稠李組織培養(yǎng)方法，它是按照以下步驟進行的：一、外植體的選?。和庵搀w選取野外山桃稠李植株；二、外植體消毒：取帶頂芽的側芽作為外植體剪成4～5cm的帶芽莖段，采用洗衣粉清洗干凈，然后再用清水沖洗1～2h；置于超凈工作臺上用體積百分含量為75％的乙醇浸泡30s，用無菌水沖洗3次，放在無菌濾紙上風干，再用質量百分含量為0.1％升汞消毒8min，然后用無菌水沖洗3次；三、初代培養(yǎng)：將消毒外植體剪成1cm左右的莖段接入初代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為20～24℃，光照強度為2000lx，光照時間每天12h，培養(yǎng)30天；所述初代培養(yǎng)基由改良WPS培養(yǎng)基+濃度為1.0mg/L的6-芐氨基腺嘌呤+濃度為0.5mg/L的萘乙酸組成；四、不定芽的增殖培養(yǎng)：將初代培養(yǎng)的帶芽莖段接入增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為20～24℃，光照強度為2000lx，光照時間每天12h，培養(yǎng)周期為40天；所述增殖培養(yǎng)基由改良WPS+濃度為1.5mg/L的6-芐氨基腺嘌呤+濃度為0.5mg/L的萘乙酸組成；五、壯苗培養(yǎng)：將在增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)至長度達到1cm以上的不定芽逐個切下，接入1/2改良WPS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為20～24℃，光照強度為2000lx，光照時間每天12h，培養(yǎng)周期為40天；六、生根培養(yǎng)：將壯苗培養(yǎng)基中的健康健壯的芽接入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度為20～24℃，光照強度為2000lx，光照時間每天12h，培養(yǎng)30天；所述的生根培養(yǎng)基由1/4改良WPS培養(yǎng)基+濃度為0.5mg/L的萘乙酸組成；所述的改良WPS培養(yǎng)基由大量元素、微量元素、鐵鹽和有機成分組成：所述的大量元素為：(1)濃度為400mg/L的硝酸銨NH4NO3、(2)濃度為190mg/L的硝酸鉀KNO3、(3)濃度為170mg/L的磷酸二氫鉀KH2PO4、(4)濃度為370mg/L的硫酸鎂MgSO4·7H2O和(5)濃度為684mg/L的硝酸鈣Ca(NO3)2·4H2O；所述的鐵鹽為：(1)濃度為27.85mg/L的硫酸亞鐵FeSO4·7H2O和(2)濃度為37.28mg/L的乙二胺四乙酸鹽Na2EDTA；所述的微量元素為：(1)濃度為22.5mg/L的硫酸錳MnSO4·4H2O、(2)濃度為8.6mg/L的硫酸鋅ZnSO4·7H2O、(3)濃度為0.25mg/L的硫酸銅CuSO4·5H2O、(4)濃度為6.2mg/L的硼酸H3BO3和(5)濃度為0.25mg/L的鉬酸鈉Na2MOO4·2H2O；所述的有機成分為：(1)濃度為0.1mg/L的鹽酸硫胺素VB1、(2)濃度為0.5mg/L的鹽酸吡哆辛VB6、(3)濃度為0.5mg/L的煙酸VB5、(4)濃度為2.0mg/L的甘氨酸和(5)濃度為100mg/L的肌醇。具體實施方式二：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟一中選取野外山桃稠李植株是指：選取當年萌發(fā)的帶頂芽的側芽莖段為野外山桃稠李植株，將野外采集的山桃稠李植株置于低溫保溫箱里儲存，備用。其它與具體實施方式一相同。具體實施方式三：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟二中外植體消毒：將采集的小枝條去掉不用的部分，剪成4～5cm的帶芽莖段，置于放有洗衣粉水的燒杯里，用紗布網(wǎng)將燒杯口套住，用手不斷晃動燒杯5min，將燒杯用流水沖洗1～2h。其它與具體實施方式一相同。具體實施方式四：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟三、四和五中的培養(yǎng)基中分別加入濃度為20g/L蔗糖和濃度為6.5g/L瓊脂，pH用氫氧化鈉調節(jié)至6.0。其它與具體實施方式一相同。具體實施方式五：本實施方式與具體實施方式一不同的是：步驟三中所述的初代培養(yǎng)過程中進行預防褐化。其它與具體實施方式一相同。具體實施方式六：本實施方式與具體實施方式一不同的是：進行預防褐化是指在第一次接種至培養(yǎng)瓶內后，每隔3天就換瓶一次，一共三次。其它與具體實施方式一相同。具體實施方式七：本實施方式與具體實施方式一不同的是：1/4改良WPS培養(yǎng)基是指大量元素加入量為權利要求1改良WPS培養(yǎng)基的1/4體積，微量元素、鐵鹽和有機成分與權利要求1改良WPS培養(yǎng)基一致。其它與具體實施方式一相同。具體實施方式八：本實施方式與具體實施方式一不同的是：1/2改良WPS培養(yǎng)基是指大量元素加入量為權利要求1改良WPS培養(yǎng)基的1/2體積，微量元素、鐵鹽和有機成分與權利要求1改良WPS培養(yǎng)基一致。其它與具體實施方式一相同。本發(fā)明內容不僅限于上述各實施方式的內容，其中一個或幾個具體實施方式的組合同樣也可以實現(xiàn)發(fā)明的目的。通過以下實施例驗證本發(fā)明的有益效果：實施例11.實驗材料與方法：(1)外植體采集：試驗材料為2014年7月中旬采自黑龍江省哈爾濱市帽兒山的當年生帶芽莖段。(2)外植體消毒:將采集的小枝條去掉不用的部分，剪成4-5cm的帶芽莖段，置于放有洗衣粉水的燒杯里，用紗布網(wǎng)將燒杯口套住，用手不斷晃動燒杯5min,將燒杯用流水沖洗1-2h。之后，在超凈工作臺上用75％的乙醇浸泡30s，用無菌水沖洗3次，放在無菌濾紙上風干，分別用0.1％升汞消毒4、6、8、10、12min，用無菌水沖洗5次，12d后統(tǒng)計污染率。(3)不定芽的誘導：分別取頂芽、側芽和帶頂芽的側芽，經(jīng)消毒后接種于MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L的培養(yǎng)基中，每瓶接種一個莖段，每種組合接種60瓶，實驗重復3次。16d天后統(tǒng)計萌發(fā)率，萌發(fā)率＝萌發(fā)數(shù)/未污染個數(shù)。(4)不定芽的增殖：選取生長情況良好的組培苗開展增殖培養(yǎng)的實驗，采用2因素3水平的隨機實驗，基本培養(yǎng)基選用改良WPS，6-BA分別用0.5mg/L，1.0mg/L，1.5mg/L，一共三個水平，NAA選用0.25mg/L，0.5mg/L，0.75mg/L，一共三個水平。一共9種組合，每種組合接種10瓶，每瓶3個組培苗，實驗重復三次。40d后統(tǒng)計增殖情況和生長狀況。增殖系數(shù)＝增殖苗數(shù)/接種苗數(shù)。(5)壯苗培養(yǎng)：以生長健壯的2cm以上的增殖苗為材料，放入改良WPS、1/2改良WPS、1/4改良WPS，1/6改良WPS，1/8改良WPS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)40d。(6)生根培養(yǎng):以生長健壯的2cm以上的壯苗為材料，采用2因素3水平完全隨機設計，基本培養(yǎng)基選擇改良WPS、1/2改良WPS、1/4改良WPS，1/6改良WPS，1/8改良WPS；激素選擇NAA，分為0.5、1.0、1.5mg/L，3個水平。每個處理接種10瓶，每瓶3個增殖苗，實驗重復3次。40d后統(tǒng)計生根率及生長情況。以上培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度(22±2)℃，光照強度2000lx，光照時間每天12h。培養(yǎng)基均附加蔗糖20g/L、瓊脂6.5g/L，pH值為6.0。(7)實驗結果：表1不同的消毒方法對無菌體系的影響表2不同類型的芽對于誘導萌發(fā)的影響表3不同激素組合對于組培苗增殖的影響表4不同基本培養(yǎng)基對苗生長的影響表5不同基礎培養(yǎng)基及激素組合對組培苗生根的影響本實例建立的植株再生體系，帶頂芽的側芽萌發(fā)率高達82.8％，無菌萌發(fā)率達到61.3％，增殖系數(shù)達到4.89，生根率91.2％。本發(fā)明的方法能較好的保持母本的抗逆性和觀賞性，大大縮短了育苗周期，5個月即可獲得生根苗木，有效提高了山桃稠李的繁殖系數(shù)；與種子繁殖相比，組織培養(yǎng)可以有效的提供低成本的高觀賞性的綠化苗木，能有效降低苗木成本，節(jié)省開支；與體胚發(fā)生組織培養(yǎng)方法相比，采用不定芽增殖并直接生根成苗的方法，大大降低了母本發(fā)生變異的風險，能更好的保持母本的抗逆性和觀賞性。