本發(fā)明屬于天然植物深加工領(lǐng)域，尤其涉及一種富硒青錢柳的栽培、有效成分提取及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖尿病是一種伴有血糖升高的代謝性疾病，主要有Ⅰ型和Ⅱ型兩種類型，臨床以Ⅱ型糖尿病患者居多，占糖尿病患者總數(shù)的90％。Ⅱ型糖尿病的主要特征是胰島素抵抗，肝臟、骨骼肌、脂肪等組織對葡萄糖的攝取減少，造成血液中葡萄糖水平升高形成高血糖。青錢柳系胡桃科青錢柳屬落葉喬木，又稱為青錢李或金錢柳，主要生長在我國海拔800～2000米潮濕多霧的南方山區(qū)，是我國特有的單種屬植物。青錢柳含有多糖、黃酮、三萜皂苷、生物堿等多種活性成分，已有研究證明其活性成分具有顯著的降血糖、降血脂等功效。研究發(fā)現(xiàn)，青錢柳提取物可顯著增強四氧嘧啶糖尿病小鼠的葡萄糖耐受能力，對α-葡萄糖苷酶的活性有較強的抑制作用，可以促進病變胰島結(jié)構(gòu)功能恢復(fù)，增強小鼠糖耐量，降低空腹血糖。同時，青錢柳提取物還具有明顯的改善血脂代謝和提高機體抗氧化能力的作用，可抑制高脂血癥小鼠FAS基因和蛋白質(zhì)表達。因此，青錢柳活性成分作為降血糖、降血脂等保健食品和藥品開發(fā)具有很好的前景。

近年來，天然富硒保健產(chǎn)品的開發(fā)引起了人們的重視。硒是人體必需的重要營養(yǎng)元素，具有增強人體免疫力、抗氧化、抗衰老以及抗癌、拮抗重金屬毒性等生理功能。研究表明，克山病、大骨節(jié)病、糖尿病等40余種疾病的發(fā)生發(fā)展與人體缺硒有密切關(guān)聯(lián)。目前中國營養(yǎng)學(xué)會推薦人體硒日攝入量標準為50～250微克，而目前我國成年人硒日攝入量僅為20～30微克，硒攝入量存在嚴重不足。無機硒存在人體吸收率低、毒副作用大等問題，有機硒與硒在人體內(nèi)存在的自然形式一致，易于在體內(nèi)存留、積累，生物利用率顯著提高，毒副作用小。因此，有必要開發(fā)天然富硒保健產(chǎn)品。

通過添加人工富硒肥使植物富硒是目前得到富硒產(chǎn)品最簡潔有效的手段之一。然而，目前大量使用的富硒肥料多由硒礦粉或亞硒酸鈉加工得來。硒 礦多伴生多種其他重金屬，施肥后極易造成土壤以及植物重金屬超標。亞硒酸鈉不易被植物吸收轉(zhuǎn)化，大量未被吸收的亞硒酸鈉會對土壤、水體以及周圍環(huán)境造成污染。另外亞硒酸鈉本身具有毒性，殘存在植物表面的亞硒酸鈉會對人的健康造成一定損傷。

綜上所述，現(xiàn)有技術(shù)中，對于富硒植物的培養(yǎng)所使用的肥料存在著殘留多、吸收差、容易導(dǎo)致環(huán)境污染的缺陷，同時，現(xiàn)有的對于富硒植物中有效成分的提取以及應(yīng)用存在著吸收率低以及不良反應(yīng)多的的缺陷。

因此，研發(fā)出一種吸收率高、殘留少以及不破壞環(huán)境的有機富硒肥，同時，研發(fā)出一種有效成分吸收率高、不良反應(yīng)少的富硒植物提取方法以及相對應(yīng)的應(yīng)用，成為了本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的問題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明實施例提供了一種富硒青錢柳的栽培、有效成分提取及應(yīng)用，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中，對于富硒植物的培養(yǎng)所使用的肥料存在著殘留多、吸收差、容易導(dǎo)致環(huán)境污染的缺陷，同時，現(xiàn)有的對于富硒植物中有效成分的提取以及應(yīng)用存在著吸收率低以及不良反應(yīng)多的的缺陷。

本發(fā)明實施例提供的一種富硒青錢柳的栽培方法，包括：所述富硒青錢柳的栽培過程中使用有機富硒肥；所述有機富硒肥包括：富硒酵母、腐殖酸、氨基酸、植物生長調(diào)節(jié)劑和葉面促滲劑。

優(yōu)選地，以質(zhì)量份計，所述有機富硒肥包括：富硒酵母1.0～10.0份、腐殖酸10.0～70.0份、氨基酸1.0～50.0份、植物生長調(diào)節(jié)劑0.5～10.0份和葉面促滲劑0.5～20.0份。

本發(fā)明提供一種富硒青錢柳提取物的制備方法，包括從青錢柳的樹葉中提取出富硒青錢柳提取物，所述青錢柳的栽培過程中使用有機富硒肥；所述有機富硒肥包括：富硒酵母、腐殖酸、氨基酸、植物生長調(diào)節(jié)劑和葉面促滲劑。

其中以質(zhì)量份計，所述有機富硒肥包括：富硒酵母1.0～10.0份、腐殖酸10.0～70.0份、氨基酸1.0～50.0份、植物生長調(diào)節(jié)劑0.5～10.0份和葉面促滲劑0.5-20.0份。

優(yōu)選地，所述有機富硒肥的基本組成按其質(zhì)量百分含量分別為：富硒酵母1.0～10.0％，腐殖酸10.0～70.0％，氨基酸1.0～50.0％，植物生長調(diào)節(jié)劑 0.5～10.0％，葉面促滲劑0.5～20.0％，上述成分的百分比總和為100％。

優(yōu)選地，活性有機富硒肥的基本組成按其質(zhì)量百分含量分別為：富硒酵母3.0～6.0％，腐殖酸20.0～55.0％，氨基酸10.0～40.0％，植物生長調(diào)節(jié)劑1.0～5.0％，葉面促滲劑2.0～15.0％，上述成分的百分比總和為100％。

優(yōu)選地，所述氨基酸選自半胱氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、賴氨酸、甘氨酸和絲氨酸中的一種或多種；所述植物生長調(diào)節(jié)劑選自硫酸氧鈦、二乙酰胺四乙酸鈦、乙二胺二鄰苯基乙酸鈦、硫酸鋅、乙酰胺四乙酸鋅、乙二胺二鄰苯基乙酸鋅、氯化鎂、乙酰胺四乙酸鎂、乙二胺二鄰苯基乙酸鎂、丙酰蕓苔素內(nèi)酯、復(fù)硝酚鈉、1-甲基化丙烯和茉莉酸甲酯中的一種或幾種的混合物；所述葉面促滲劑選自乙二胺二鄰苯基乙酸鈦；葉面促滲劑為十二烷基硫酸鈉、氯化鈣、硫酸氧鈦、硫酸亞鐵、磷酸三丁脂、葵二酸二乙酯和辛二酸二乙酯中的一種或多種。

優(yōu)選地，所述栽培方法還包括：所述有機富硒肥與市售常規(guī)復(fù)合肥的混合，所述有機富硒肥與所述市售常規(guī)復(fù)合肥的質(zhì)量比為1：(100～2000)。

優(yōu)選地，所述栽培方法還包括：所述有機富硒肥溶于水，所述有機富硒肥與水的質(zhì)量比為1:(100～1000)。

優(yōu)選地，所述栽培方法包括將所述有機富硒肥與普通復(fù)合肥按照1:100～1:2000質(zhì)量比混合后進行土壤施肥。土壤施肥過程中，混合肥的施肥量與青錢柳植株的高度比為1kg:(1-2)m。

優(yōu)選地，所述栽培方法包括將所述有機富硒肥按照1:100～1:1000質(zhì)量比溶于水，配置成水溶液后進行葉面噴施。

本發(fā)明實施例還提供了一種包括以上任意一項所述栽培方法得到的富硒青錢柳有效成分的提取方法，包括：預(yù)處理、提取、濃縮和醇沉，得粗提物；所述預(yù)處理的方法為：除雜、清洗以及粉碎，得第一產(chǎn)物；所述提取的方法為：所述第一產(chǎn)物與提取液混合，加熱回流提取，得第二產(chǎn)物；所述濃縮的方法為：將所述第二產(chǎn)物進行減壓濃縮或超濾膜濃縮，得第三產(chǎn)物；所述醇沉的方法為：向所述第三產(chǎn)物中加入乙醇，過濾收集沉淀物，所述沉淀物即為粗提物。

優(yōu)選地，所述第一產(chǎn)物的粒徑為10～100目；所述提取液選自水、乙醇、 NaOH溶液、HCl溶液、NaCl溶液、Tris-HCl溶液和PBS溶液中的一種或多種；所述加熱溫度為40～100℃；所述提取的時間為0.5～5h；所述提取的次數(shù)為1～10次；所述第三產(chǎn)物與所述第二產(chǎn)物的體積比為1：(5～20)；所述乙醇與所述第三產(chǎn)物的體積比為(1～9)：1。

優(yōu)選地，所述提取方法還包括精制和干燥，得粗提物；所述精制和所述干燥在所述醇沉后依次進行。

優(yōu)選地，所述精制的方法為：將粗提物復(fù)溶后與絮凝劑混合，加熱攪拌，過濾后收集濾液；所述干燥的方法選自冷凍干燥、熱風(fēng)常壓干燥、真空干燥、噴霧干燥、微波干燥和紅外干燥的一種或多種；所述絮凝劑與所述粗提物的質(zhì)量比為(0.5～5)：10；所述絮凝劑選自殼聚糖、羧甲基殼聚糖、殼聚糖季銨鹽、明膠和ZTC1+1澄清劑(本處所用的ZTC1+1澄清劑為市售殼聚糖與碳酸鈣的混合物)中的一種或多種；所述加熱攪拌的溫度為40～60℃，所述加熱攪拌的時間為0.05～2h。

本發(fā)明實施例還提供了包括以上任意一項提取方法得到的產(chǎn)品制成的劑型在保健食品和/或藥品中的應(yīng)用。所述劑型包括不限于片劑、膠囊劑、顆粒劑、滴丸劑和口服液。

本發(fā)明實施例還提供了包括以上任意一項提取方法得到的產(chǎn)品制成的劑型在降血脂降血糖保健食品或藥品中的應(yīng)用。所述包括不限于片劑、膠囊劑、顆粒劑、滴丸劑和口服液。綜上所述，本發(fā)明實施例提供的一種富硒青錢柳的栽培、有效成分提取及應(yīng)用，解決了現(xiàn)有技術(shù)中，對于富硒植物的培養(yǎng)所使用的肥料存在著殘留多、吸收差、容易導(dǎo)致環(huán)境污染的缺陷，同時，現(xiàn)有的對于富硒植物中有效成分的提取以及應(yīng)用存在著吸收率低以及不良反應(yīng)多的缺陷。

具體實施方式

下面將對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，植物富硒目前是一個難題，本發(fā)明實施通 過實驗和篩選獲得獨特組方的新型活性有機富硒肥，施用于青錢柳可有效實現(xiàn)青錢柳富硒，富硒青錢柳樹葉中硒含量最高可達20.0mg/kg，富硒青錢柳提取物中硒含量最高可達10.0mg/kg。同時，本發(fā)明提供的活性有機富硒肥屬于有機肥，避免了無機硒肥硒轉(zhuǎn)換率低、毒副作用大、存在污染環(huán)境等問題。

同時，本發(fā)明提供的技術(shù)方案成功實現(xiàn)了硒的高效植物體內(nèi)轉(zhuǎn)化，獲得的富硒青錢柳提取物中不僅含有青錢柳多糖等功效成分，同時富含微量元素硒。動物實驗結(jié)果表明，該富硒青錢柳提取物同時具有顯著的降血糖、降血脂以及提高機體免疫力等功效。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案中，所采用的富硒青錢柳施肥技術(shù)和富硒青錢柳提取物的提取技術(shù)簡單易行，易于大規(guī)模生產(chǎn)。

為了更詳細說明本發(fā)明，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的一種富硒青錢柳的栽培、有效成分提取及應(yīng)用，進行具體地描述。

本技術(shù)方案獲得的富硒青錢柳樹葉和富硒青錢柳提取物中硒的含量，按照國家標準檢測規(guī)范GB5009.93-2010，采用原子熒光法進行檢測。青錢柳多糖的含量按照2015版《中國藥典》一部，采用蒽酮硫酸方法檢測。

實施例1

活性有機富硒肥的組成為：富硒酵母6％，腐殖酸47％，半胱氨酸24％，蛋氨酸10％，乙二胺二鄰苯基乙酸鈦5％以及硫酸亞鐵8％混合(本比例為質(zhì)量比)，制得有機富硒肥1。將有機富硒肥1與市售常規(guī)復(fù)合肥按照1:800混合后進行土壤施肥，對8m高青錢柳植株施肥，肥料共計4kg，施肥期為冬季11月，施肥一次，次年4月采收樹葉。測得青錢柳樹葉中硒含量為2.6mg/kg。

將上述制得的青錢柳樹葉經(jīng)除雜、清洗后粉碎至40目，得第一產(chǎn)物1。稱取第一產(chǎn)物1,按照樹葉與水質(zhì)量比為1:15加入水，在100℃的溫度下回流提取3h，提取2次，過濾，合并濾液，得第二產(chǎn)物1。第二產(chǎn)物1進行超濾膜濃縮，濃縮得到的第三產(chǎn)物1與第二產(chǎn)物1的體積比為1:10。向第三產(chǎn)物1中加入乙醇，乙醇與第三產(chǎn)物1的體積比為4:1，過濾，獲得沉淀物即為粗提物1。將粗提物1溶于水，按照殼聚糖與粗提物1質(zhì)量比為2:10加入殼聚糖，在50℃的溫度下攪拌0.5h，過濾，取濾液，濾液噴霧干燥，即得產(chǎn)物1。富硒青錢柳提取物得率為4.9％，其中硒含量為1.8mg/kg，青錢柳多糖含量為 22.3％。

實施例2

活性有機富硒肥的組成為：富硒酵母1％，腐殖酸49.5％，半胱氨酸14％，蛋氨酸15％，乙二胺二鄰苯基乙酸鈦0.5％以及十二烷基硫酸鈉20％混合(本比例為質(zhì)量比)，制得有機富硒肥2。將有機富硒肥2與市售常規(guī)復(fù)合肥按照1:100混合后進行土壤施肥，對1m高青錢柳植株施肥，肥料共計1kg，施肥期為冬季12月，施肥一次，次年6月采收樹葉。測得青錢柳樹葉中硒含量為0.54mg/kg。

將上述制得的青錢柳樹葉經(jīng)除雜、清洗后粉碎至60目，得第一產(chǎn)物2。稱取第一產(chǎn)物2,按照樹葉與NaOH溶液質(zhì)量比為1:4加入0.1mol/L NaOH溶液，在40℃的溫度下回流提取5h，提取1次，過濾，合并濾液，得第二產(chǎn)物2。第二產(chǎn)物2進行減壓濃縮，濃縮得到的第三產(chǎn)物2與第二產(chǎn)物2的體積比為1:10。向第三產(chǎn)物2中加入乙醇，乙醇與第三產(chǎn)物2的體積比為4:1，過濾，獲得沉淀物即為粗提物2。將粗提物2溶于水，按照ZTC1+1與粗提物2質(zhì)量比為1.5:10加入ZTC1+1(市售殼聚糖與碳酸鈣的混合物)，在50℃的溫度下攪拌0.05h，過濾，取濾液，濾液噴霧干燥，即得產(chǎn)物2。富硒青錢柳提取物得率為1.2％，其中硒含量為0.48mg/kg，青錢柳多糖含量為18.7％。

實施例3

活性有機富硒肥的組成為：富硒酵母5％，腐殖酸53.5％，甘氨酸20％，賴氨酸15％，丙氨酸2％，異亮氨酸3％，乙酰胺四乙酸鎂1％以及硫酸亞鐵0.5％混合(本比例為質(zhì)量比)，制得有機富硒肥3。將有機富硒肥3與市售常規(guī)復(fù)合肥按照1:600混合后進行土壤施肥，對5m高青錢柳植株施肥，肥料共計3kg，施肥期為冬季12月，施肥一次，次年8月采收樹葉。測得青錢柳樹葉中硒含量為1.33mg/kg。

將上述制得的青錢柳樹葉經(jīng)除雜、清洗后粉碎至40目，得第一產(chǎn)物3。稱取第一產(chǎn)物3，按照樹葉與氯化鈉溶液質(zhì)量比為1:15加入0.5mol/L氯化鈉溶液，在100℃的溫度下回流提取3h，提取2次，過濾，合并濾液，得第二產(chǎn)物3。第二產(chǎn)物3進行減壓濃縮，濃縮得到的第三產(chǎn)物3與第二產(chǎn)物3的體積比為1:5。向第三產(chǎn)物3中加入乙醇，乙醇與第三產(chǎn)物3的體積比為3:1， 過濾，獲得沉淀物即為粗提物3。將粗提物3溶于水，按照殼聚糖與粗提物質(zhì)量3比為1:10加入殼聚糖，在40℃的溫度下攪拌2h，過濾，取濾液，濾液冷凍干燥，即得產(chǎn)物3。富硒青錢柳提取物得率為4.6％，其中硒含量為0.92mg/kg，青錢柳多糖含量為18.2％。

實施例4

活性有機富硒肥的組成為：富硒酵母10％，腐殖酸70％，半胱氨酸1％，丙酰蕓苔素內(nèi)酯10％以及氯化鈣9％混合(本比例為質(zhì)量比)，制得有機富硒肥4。將有機富硒肥4與市售常規(guī)復(fù)合肥按照1:400混合后進行土壤施肥，對4m高青錢柳植株施肥，肥料共計2kg，施肥期為冬季1月，施肥一次，次年5月采收樹葉。測得青錢柳樹葉中硒含量為1.73mg/kg。

將上述制得的青錢柳樹葉經(jīng)除雜、清洗后粉碎至100目，得第一產(chǎn)物4。稱取第一產(chǎn)物4，按照樹葉與水質(zhì)量比為1:15加入水，在90℃的溫度下回流提取0.5h，提取10次，過濾，合并濾液，得第二產(chǎn)物4。第二產(chǎn)物4進行超濾膜濃縮，濃縮得到的第三產(chǎn)物4與第二產(chǎn)物4的體積比為1:10。向第三產(chǎn)物4中加入乙醇，乙醇與第三產(chǎn)物1的體積比為1:1，過濾，獲得沉淀物即為粗提物4。將粗提物4溶于水，按照羧甲基殼聚糖與粗提物4質(zhì)量比為4:10加入羧甲基殼聚糖，在50℃的溫度下攪拌0.5h，過濾，取濾液，濾液噴霧干燥，即得產(chǎn)物4。富硒青錢柳提取物得率為6.2％，其中硒含量為1.36mg/kg，青錢柳多糖含量為22.5％。

實施例5

活性有機富硒肥的組成為：富硒酵母4％，腐殖酸62％，半胱氨酸12％，蛋氨酸8％，乙二胺二鄰苯基乙酸鋅2％以及磷酸三丁酯12％混合(本比例為質(zhì)量比)，制得有機富硒肥5。將有機富硒肥5與市售常規(guī)復(fù)合肥按照1:2000混合后進行土壤施肥，對6m高青錢柳植株施肥，肥料共計3kg，施肥期為冬季11月，施肥一次，次年4月采收樹葉。測得青錢柳樹葉中硒含量為0.75mg/kg。

將上述制得的青錢柳樹葉經(jīng)除雜、清洗后粉碎至10目，得第一產(chǎn)物5。稱取第一產(chǎn)物5，按照樹葉與HCl溶液質(zhì)量比為1:15加入0.1mol/L HCl溶液，在100℃的溫度下回流提取2h，提取3次，過濾，合并濾液，得第二產(chǎn)物5。 第二產(chǎn)物5進行減壓濃縮，濃縮得到的第三產(chǎn)物5與第二產(chǎn)物5的體積比為1:10。向第三產(chǎn)物5中加入乙醇，乙醇與第三產(chǎn)物5的體積比為1:1，過濾，獲得沉淀物即為粗提物5。將粗提物5溶于水，按照明膠與粗提物5質(zhì)量比為3.5:10加入明膠，在50℃的溫度下攪拌0.5h，過濾，取濾液，濾液噴霧干燥，即得產(chǎn)物5。富硒青錢柳提取物得率為2.6％，其中硒含量為0.62mg/kg，青錢柳多糖含量為10.8％。

實施例6

活性有機富硒肥的組成為：富硒酵母6％，腐殖酸48％，半胱氨酸14％，蛋氨酸14％，硫酸氧鈦3％以及硫酸亞鐵15％混合(本比例為質(zhì)量比)，制得有機富硒肥6。將有機富硒肥6按照1:100溶于水配制成水溶液后進行葉面噴施，噴施至葉面濕潤且不見滴水，施肥期為春季3月，噴施一次，噴施后15天采收樹葉。測得青錢柳樹葉中硒含量為10.2mg/kg。

將上述制得的青錢柳樹葉經(jīng)除雜、清洗后粉碎至10目，得第一產(chǎn)物6。稱取第一產(chǎn)物6,按照樹葉與水質(zhì)量比為1:15加入水，在100℃的溫度下回流提取1h，提取5次，過濾，合并濾液，得第二產(chǎn)物6。第二產(chǎn)物6進行超濾膜濃縮，濃縮得到的第三產(chǎn)物6與第二產(chǎn)物6的體積比為1:15。向第三產(chǎn)物6中加入乙醇，乙醇與第三產(chǎn)物6的體積比為3:1，過濾，獲得沉淀物即為粗提物6。將粗提物6溶于水，按照殼聚糖與粗提物6質(zhì)量比為1:10加入殼聚糖，在50℃的溫度下攪拌1.5h，過濾，取濾液，濾液熱風(fēng)常壓干燥，即得產(chǎn)物6。富硒青錢柳提取物得率為7.8％，其中硒含量為7.4mg/kg，青錢柳多糖含量為26.7％。

實施例7

活性有機富硒肥的組成為：富硒酵母3％，腐殖酸45％，半胱氨酸20％，蛋氨酸20％，乙二胺二鄰苯基乙酸鎂1.9％，復(fù)硝酚鈉0.1％，以及硫酸亞鐵10％混合，制得有機富硒肥7(本比例為質(zhì)量比)。將有機富硒肥7按照1:400溶于水配制成水溶液后進行葉面噴施，噴施至葉面濕潤且不見滴水，施肥期為春季3月，噴施一次，噴施后30天采收樹葉。測得青錢柳樹葉中硒含量為5.4mg/kg。

將上述制得的青錢柳樹葉經(jīng)除雜、清洗后粉碎至40目，得第一產(chǎn)物7。 稱取第一產(chǎn)物7,按照樹葉與Tris-HCl質(zhì)量比為1:15加入0.05mol/L Tris-HCl溶液，在100℃的溫度下回流提取2h，提取3次，過濾，合并濾液，得第二產(chǎn)物7。第二產(chǎn)物7進行減壓濃縮，濃縮得到的第三產(chǎn)物7與第二產(chǎn)物7的體積比為1:10。向第三產(chǎn)物7中加入乙醇，乙醇與第三產(chǎn)物7的體積比為4:1，過濾，獲得沉淀物即為粗提物7。將粗提物7溶于水，按照殼聚糖與粗提物7質(zhì)量比為5:10加入殼聚糖，在50℃的溫度下攪拌0.5h，過濾，取濾液，濾液噴霧干燥，即得產(chǎn)物7。富硒青錢柳提取物得率為5.8％，其中硒含量為2.4mg/kg，青錢柳多糖含量為25.3％。

實施例8

活性有機富硒肥的組成為：富硒酵母5.5％，腐殖酸40％，半胱氨酸20％，蛋氨酸20％，天冬氨酸1.5％，絲氨酸1.5％，乙二胺二鄰苯基乙酸鈦3.5％以及硫酸亞鐵8％混合(本比例為質(zhì)量比)，制得有機富硒肥8。將有機富硒肥8按照1:1000溶于水配制成水溶液后進行葉面噴施，噴施至葉面濕潤且不見滴水，施肥期為春季5月，噴施一次，噴施后40天采收樹葉。測得青錢柳樹葉中硒含量為3.7mg/kg。

將上述制得的青錢柳樹葉經(jīng)除雜、清洗后粉碎至40目，得第一產(chǎn)物8。稱取第一產(chǎn)物8，按照樹葉與水質(zhì)量比為1:50加入水，在100℃的溫度下回流提取1h，提取4次，過濾，合并濾液，得第二產(chǎn)物8。第二產(chǎn)物8進行超濾膜濃縮，濃縮得到的第三產(chǎn)物8與第二產(chǎn)物8的體積比為1:20。向第三產(chǎn)物8中加入乙醇，乙醇與第三產(chǎn)物8的體積比為9:1，過濾，獲得沉淀物即為粗提物8。將粗提物8溶于水，按照明膠與粗提物8質(zhì)量比為4:10加入明膠，在40℃的溫度下攪拌0.5h，過濾，取濾液，濾液真空干燥，即得產(chǎn)物8。富硒青錢柳提取物得率為5.2％，其中硒含量為1.8mg/kg，青錢柳多糖含量為24.1％。

實施例9

活性有機富硒肥的組成為：富硒酵母4％，腐殖酸48％，半胱氨酸22％，蛋氨酸11％，乙酰氨四乙酸鋅3％以及硫酸亞鐵12％混合(本比例為質(zhì)量比)，制得有機富硒肥9。將有機富硒肥9按照1:750溶于水配制成水溶液后進行葉面噴施，噴施至葉面濕潤且不見滴水，施肥期為夏季8月，施肥一次，噴施 后35天采收樹葉。測得青錢柳樹葉中硒含量為7.6mg/kg。

將上述制得的青錢柳樹葉經(jīng)除雜、清洗后粉碎至40目，得第一產(chǎn)物9。稱取第一產(chǎn)物9,按照樹葉與PBS溶液質(zhì)量比為1:15加入0.05mol/L PBS溶液，在100℃的溫度下回流提取1.5h，提取3次，過濾，合并濾液，得第二產(chǎn)物9。第二產(chǎn)物9進行減壓濃縮，濃縮得到的第三產(chǎn)物9與第二產(chǎn)物9的體積比為1:10。向第三產(chǎn)物9中加入乙醇，乙醇與第三產(chǎn)物9的體積比為7:3，過濾，獲得沉淀物即為粗提物9。將粗提物9溶于水，按照殼聚糖與粗提物9質(zhì)量比為0.5:10加入殼聚糖，在50℃的溫度下攪拌0.5h，過濾，取濾液，濾液微波干燥，即得產(chǎn)物9。富硒青錢柳提取物得率為6.3％，其中硒含量為5.4mg/kg，青錢柳多糖含量為26.3％。

實施例10

活性有機富硒肥的組成為：富硒酵母10％，腐殖酸10％，半胱氨酸12％，蛋氨酸24％，谷氨酸14％，乙二胺二鄰苯基乙酸鈦5％，1-甲基化丙烯2.5％，茉莉酸甲酯2.5％以及硫酸亞鐵20％混合(本比例為質(zhì)量比)，制得有機富硒肥10。將有機富硒肥10按照1:900溶于水配制成水溶液后進行葉面噴施，噴施至葉面濕潤且不見滴水，施肥期為秋季9月，施肥一次，噴施后15天采收樹葉。測得青錢柳樹葉中硒含量為5.9mg/kg。

將上述制得的青錢柳樹葉經(jīng)除雜、清洗后粉碎至40目，得第一產(chǎn)物10。稱取第一產(chǎn)物10，按照樹葉與乙醇質(zhì)量比為1:15加入20％乙醇，在100℃的溫度下回流提取2h，提取3次，過濾，合并濾液，得第二產(chǎn)物10。第二產(chǎn)物10進行減壓濃縮，濃縮得到的第三產(chǎn)物10與第二產(chǎn)物10的體積比為1:10。向第三產(chǎn)物10中加入乙醇，乙醇與第三產(chǎn)物10的體積比為3:1，過濾，獲得沉淀物即為粗提物10。將粗提物10溶于水，按照殼聚糖與粗提物10質(zhì)量比為2.5:10加入殼聚糖，在50℃的溫度下攪拌0.5h，過濾，取濾液，濾液紅外干燥，即得產(chǎn)物10。富硒青錢柳提取物得率為5.8％，其中硒含量為2.9mg/kg，青錢柳多糖含量為25.8％。

實施例11

活性有機富硒肥的組成為：富硒酵母6％，腐殖酸38％，半胱氨酸12％，蛋氨酸24％，乙二胺二鄰苯基乙酸鈦5％以及硫酸亞鐵15％混合(本比例為質(zhì) 量比)，制得有機富硒肥11。將有機富硒肥11按照1:800溶于水配制成水溶液后進行葉面噴施，噴施至葉面濕潤且不見滴水，施肥期為5月，施肥一次，噴施后25天采收樹葉。測得青錢柳樹葉中硒含量為14.2mg/kg。

將上述制得的青錢柳樹葉經(jīng)除雜、清洗后粉碎至40目，得第一產(chǎn)物1。稱取第一產(chǎn)物1，按照樹葉與水質(zhì)量比為1:15加入水，在100℃的溫度下回流提取2h，提取3次，過濾，合并濾液，得第二產(chǎn)物11。第二產(chǎn)物11進行超濾膜濃縮，濃縮得到的第三產(chǎn)物11與第二產(chǎn)物11的體積比為1:10。向第三產(chǎn)物11中加入乙醇，乙醇與第三產(chǎn)物11的體積比為3:1，過濾，獲得沉淀物即為粗提物11。將粗提物11溶于水，按照殼聚糖與粗提物11質(zhì)量比為1:10加入殼聚糖，在50℃的溫度下攪拌0.5h，過濾，取濾液，濾液噴霧干燥，即得產(chǎn)物11。富硒青錢柳提取物得率為8.1％，其中硒含量為10.5mg/kg，青錢柳多糖含量為27.4％。

實施例12

活性有機富硒肥的組成為：富硒酵母3％，腐殖酸42％，半胱氨酸23％，蛋氨酸14％，乙二胺二鄰苯基乙酸鈦4％以及葵二酸二乙酯14％混合，制得有機富硒肥12。將有機富硒肥12按照1:500溶于水配制成水溶液后進行葉面噴施，噴施至葉面濕潤且不見滴水，施肥期為4月，施肥一次，噴施后20天采收樹葉。測得青錢柳樹葉中硒含量為6.8mg/kg。

將上述制得的青錢柳樹葉經(jīng)除雜、清洗后粉碎至40目，得第一產(chǎn)物12。稱取第一產(chǎn)物12，按照樹葉與提取液質(zhì)量比為1:15加入水，在90℃的溫度下回流提取1h，提取4次，過濾，合并濾液，得第二產(chǎn)物12。第二產(chǎn)物12進行減壓濃縮，濃縮得到的第三產(chǎn)物12與第二產(chǎn)物12的體積比為1:10。向第三產(chǎn)物12中加入乙醇，乙醇與第三產(chǎn)物12的體積比為3:2，過濾，獲得沉淀物即為粗提物12。將粗提物12溶于水，按照殼聚糖季銨鹽與粗提物12質(zhì)量比為1.5:10加入殼聚糖季銨鹽，在60℃的溫度下攪拌1.5h，過濾，取濾液，濾液噴霧干燥，即得產(chǎn)物12。富硒青錢柳提取物得率為4.9％，其中硒含量為3.8mg/kg，青錢柳多糖含量為22.3％。

對比例1

取未經(jīng)施肥青錢柳樹葉經(jīng)除雜、清洗等預(yù)處理后粉碎至40目，按照樹葉 與提取液質(zhì)量比為1:15加入水，在100℃的溫度下回流提取2h，提取2次，過濾，合并濾液，濾液進行減壓濃縮，濃縮液與濾液的體積比為1:10，向濃縮液中加乙醇，乙醇與濃縮液的體積比為3:1，過濾，獲得沉淀物為青錢柳粗提取物。將青錢柳粗提取物溶于水，按照殼聚糖與粗提物質(zhì)量比為1:10加入殼聚糖，在45℃的溫度下攪拌1h，過濾，取濾液，濾液噴霧干燥，即得青錢柳提取物。青錢柳提取物得率為4.8％，其中青錢柳多糖含量為20.1％。

實施例13

采用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)法，對實施例4、實施例5、實施例10、實施例11的富硒青錢柳樹葉，及其作為對照的對比例1未施肥青錢柳樹葉(空白組)進行金屬元素含量測定。結(jié)果見表1。

表1 富硒青錢柳樹葉中金屬元素含量的測試結(jié)果

由表1可知，對青錢柳施加活性有機富硒肥后，富硒青錢柳樹葉中主要金屬元素的含量未見顯著變化，其中，鋅、鉻和釩的含量略有增加，錳、銅和鎳的含量略有減少，富硒青錢柳樹葉中上述金屬元素含量均在國家允許的安全范圍內(nèi)。

對實施例1～3、實施例6～9以及實施例12制得的產(chǎn)品重復(fù)上述實驗，均得到類似實驗效果，在此不再贅述。

實施例14

以實施例11制備的富硒青錢柳提取物進行小鼠長期毒性試驗。

取健康Wistar大鼠40只，雌雄各半，隨機分為4組，每組10只，分別為高劑量組(6.4g/kg)、中劑量組(1.6g/kg)、低劑量組(0.4g/kg)和空白組。各劑量組進行富硒青錢柳提取物溶液灌胃，每日灌胃2次，每周灌胃6天(第七天停止灌胃一天)，連續(xù)十二周?？瞻捉M給予同等量蒸餾水。實驗過程中每周稱重，并觀察各組大鼠活動、毛色、進食飲水、精神狀態(tài)等。實驗結(jié)束后對大鼠進行血液學(xué)、血液生化學(xué)指標檢查以分析可能出現(xiàn)的毒性反應(yīng)，同時處死并解剖大鼠，取主要臟器稱重，計算臟器系數(shù)，并對主要臟器作病理組織學(xué)檢查。

實驗結(jié)果顯示，在灌胃給藥期間，各組大鼠的活動、毛色、進食飲水、精神狀態(tài)等未見明顯的異常變化，各給藥劑量組的體重、進食量以及血液學(xué)、血液生化學(xué)指標和臟器系數(shù)與空白組相比均未見明顯變化，大鼠主要臟器的病理組織學(xué)檢查未見任何異常。

對實施例1～10以及實施例12制得的產(chǎn)品重復(fù)上述實驗，均得到類似實驗效果，在此不再贅述。

實施例15

以實施例11制備的富硒青錢柳提取物和對比例1制備的青錢柳提取物進行小鼠降血糖、降血脂對比實驗。

取健康雄性C57小鼠70只，普通維持飼料適應(yīng)喂養(yǎng)5天，禁食不禁水過夜，取尾血，測定空腹即給葡萄糖前(0小時)血糖值，給2.5g/kgBW葡萄糖后測定0.5、2小時血糖值，作為該批次動物基礎(chǔ)值。以0小時血糖水平分7個組，即1個空白對照組、1個模型對照組、1個陽性藥物組(對照藥物：消渴丸)、1個青錢柳提取物中劑量組(0.6g/kg)和3個富硒青錢柳劑量組(1.8g/kg、0.6g/kg、0.2g/kg)。各劑量組分別灌胃給予不同劑量的的受試樣品，陽藥組給予51.4mg/100g的消渴丸，模型對照組給予同體積溶劑，連續(xù)42天?？瞻捉M給予維持料飼養(yǎng)，其他組均給以高脂飼料。4周后，陽藥組、模型對照 組、4個劑量組在高脂飼料基礎(chǔ)上分別給予鏈尿佐菌素40mg/kg腹腔注射，空白組給予同體積的檸檬酸鹽溶液，間隔三天后，測空腹血糖值，再注射一次。各組小鼠禁食不禁水過夜，測定空腹血糖即給葡萄糖前(0小時)血糖值，劑量組給予不同濃度受試樣品，模型對照組給予同體積溶劑，空白對照組不做處理，15分鐘后各組經(jīng)口給予葡萄糖2.5g/kg BW，測定給葡萄糖后各組0.5、2小時的血糖值。各組小鼠禁食不禁水過夜，檢測血清中總膽固醇和甘油三脂含量。各組小鼠灌胃葡萄糖后0.5小時血糖值、口服糖耐量及膽固醇、甘油三脂檢測結(jié)果見表2：

表2 各組小鼠灌胃葡萄糖后0.5小時血糖值、口服糖耐量及膽固醇、甘油三脂檢測結(jié)果

由表2可知，富硒青錢柳提取物和青錢柳提取物均具有良好的降血糖功效，其中，中劑量的富硒青錢柳提取物與對照藥物消渴丸降血糖效果相當(dāng)，低劑量的富硒青錢柳提取物與中劑量青錢柳提取物降血糖效果相當(dāng)，高劑量的富硒青錢柳提取物降血糖功效明顯優(yōu)于對照藥物消渴丸。同時，高、中、低劑量的富硒青錢柳提取物降血脂功效均明顯優(yōu)于中劑量青錢柳提取物和對照藥物消渴丸。

對實施例1～10以及實施例12制得的產(chǎn)品重復(fù)上述實驗，均得到類似實驗效果，在此不再贅述。

實施例16

以實施例11制備的富硒青錢柳提取物和對比例1制備的青錢柳提取物進行小鼠增強免疫力對比實驗。

檢測實施例15中各組小鼠血清超氧化物岐化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活力，并取小鼠脾臟做小鼠脾臟免疫細胞MTT轉(zhuǎn)化實驗，測定刺激指數(shù)(SI)。實驗結(jié)果見表3。

表3 各組小鼠免疫指標檢測結(jié)果

由表3可知，小鼠血清中SOD酶的活力、GSH-Px酶活力以及小鼠脾臟免疫細胞MTT實驗SI值均表明，富硒青錢柳提取物能夠顯著增強小鼠免疫功能，且高、中、低劑量的富硒青錢柳提取物增強小鼠免疫功效均明顯優(yōu)于中劑量青錢柳提取物和對照藥物消渴丸。且隨富青錢柳提取物劑量的增加，其增強免疫力的功效也隨之明顯增強。

對實施例1～10以及實施例12制得的產(chǎn)品重復(fù)上述實驗，均得到類似實驗效果，在此不再贅述。

綜上所述，本發(fā)明實施例提供的一種富硒青錢柳的栽培、有效成分提取及應(yīng)用，解決了現(xiàn)有技術(shù)中，對于富硒植物的培養(yǎng)所使用的肥料存在著殘留多、吸收差、容易導(dǎo)致環(huán)境污染的缺陷，同時，現(xiàn)有的對于富硒植物中有效成分的提取以及應(yīng)用存在著吸收率低以及不良反應(yīng)多的缺陷。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普 通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。