本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種EMS誘變煙草種子的方法。

背景技術(shù)：

誘變育種是人為利用物理或化學(xué)因素來處理種子、植株、組織、細(xì)胞或花粉使其基因型產(chǎn)生遺傳變異，從中選擇培育新品種的方法。物理誘變應(yīng)用較多的是輻射誘變，即用γ射線、β射線、χ射線、中子等物理因素誘發(fā)變異。其誘因是高能射線造成基因突變、染色體結(jié)構(gòu)變異。化學(xué)誘變是用化學(xué)誘變劑如甲基磺酸乙酯(Ethyl Methane Sulfonate，EMS)、硫酸二乙酯等烷化劑或堿基類似物等處理植物材料，以誘發(fā)遺傳物質(zhì)的突變，從而引起形態(tài)特征的變異，然后根據(jù)育種目標(biāo)，對這些變異進(jìn)行鑒定、培育和選擇，最終育成新品種。烷化劑能使一些堿基烷基化，例如使鳥苷酸甲基化，影響mRNA的轉(zhuǎn)錄，從而使蛋白質(zhì)的表達(dá)紊亂，使得蛋白質(zhì)重組，而改變了性狀。EMS是一種烷化劑，具有強(qiáng)烈致癌性和揮發(fā)性，可以用硫代硫酸鈉溶液作為終止劑和解毒劑。EMS誘變由于成本較低，誘變效果具有一定專一性和破壞性較小，誘變頻率高，突變性狀多為顯性基因控制，易于篩選，染色體畸變相對較少等優(yōu)點(diǎn)，被有效應(yīng)用于各種作物的誘變育種，已育成的水稻、小麥、大麥和大豆等突變體達(dá)2250個(gè)。EMS毒性很大，又極易揮發(fā)，在用于植物種子誘變過程中操作注意事項(xiàng)較多。并且煙草種子與水稻、小麥、大豆等作物種子相比細(xì)小很多，千粒重僅為6-26毫克，操作起來尤其困難。因此，探索EMS誘變煙草種子的操作方便、安全高效的方法對于獲得煙草EMS誘變突變體至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種EMS誘變煙草種子的方法，旨在解決EMS毒 性很大，又極易揮發(fā)，在用于煙草種子誘變過程中操作注意事項(xiàng)較多的問題。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種EMS誘變煙草種子的方法，所述EMS誘變煙草種子的方法包括以下步驟：

準(zhǔn)備若干個(gè)長10厘米，寬5厘米的棉布小口袋；

配制0.01mol/L的磷酸緩沖液，10％的硫代硫酸鈉EMS解毒液，并將配好的磷酸緩沖液和硫代硫酸鈉解毒液放入4℃的冰箱中預(yù)冷處理，將移液槍頭裝入槍頭盒中也放入4℃冰箱中預(yù)冷；

將不同煙草種子如普通煙草品種中煙100、紅花大金元、K326、云煙87，野生煙品種林煙草的種子2克分別裝入棉布小口袋，做好標(biāo)記，并用吊簽繩扎緊袋口放入蒸餾水中浸泡24小時(shí)；

24小時(shí)后，將浸泡過的種子取出，用濾紙吸干水分，將種子從布袋中倒出，每份煙草種子分成12份分別用濾紙包好備用；

穿隔離服，戴防護(hù)口罩后，在通風(fēng)櫥中，用1.5ml的離心管將預(yù)冷的EMS用預(yù)冷的0.01mol/L的磷酸緩沖液配制成相應(yīng)濃度的EMS處理液，并搖勻；把種子倒入配好的處理液中，用封口膜將離心管口封嚴(yán)，混勻后放置于26℃、110轉(zhuǎn)/分鐘的搖床內(nèi)搖蕩處理16小時(shí)；

搖蕩處理結(jié)束后從搖床中取出離心管放置在冰上預(yù)冷20分鐘，然后把種子連同處理液倒入棉布小袋中，清洗數(shù)次；

將處理好的種子點(diǎn)在鋪有海綿和濾紙的培養(yǎng)皿中做發(fā)芽試驗(yàn)，每個(gè)處理做三次重復(fù)，在26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率；以半致死劑量為選擇標(biāo)準(zhǔn)，從統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示普通煙草的處理濃度約為0.5％-0.6％，林煙草的適宜濃度為0.3％-0.4％。

進(jìn)一步，所述配制0.01mol/L的磷酸緩沖液為將磷酸二氫鈉1.903克，磷酸氫二鈉2.793克溶于蒸餾水，將pH值調(diào)至6.5，終體積為2升。

進(jìn)一步，所述10％的硫代硫酸鈉EMS解毒液為將100克硫代硫酸鈉溶于1升蒸餾水。

進(jìn)一步，用所述磷酸緩沖液配制成處理液，先把每管所需的緩沖液用移液槍加好，后依次加入相應(yīng)量的EMS，即刻將蓋子蓋好避免揮發(fā)，接觸過EMS的廢槍頭全部放入裝有預(yù)冷的硫代硫酸鈉溶液的容器中，把種子倒入配好的處理液中，用封口膜將離心管口封嚴(yán)，混勻后放置于26℃、110轉(zhuǎn)/分鐘的搖床內(nèi)搖蕩處理16小時(shí)。

進(jìn)一步，將種子連同處理液一起倒入棉布小口袋中，下方裝有預(yù)冷的硫代硫酸鈉溶液的容器，用帶標(biāo)記的吊簽扎好口，放入磷酸緩沖液中，用0.01mol/L的磷酸緩沖液浸泡沖洗5次，每次5分鐘，用蒸餾水浸泡沖洗5次，每次5分鐘，然后用流水沖洗2小時(shí)。

EMS誘變中煙100可見突變表型分類

由此可見本發(fā)明提供的EMS誘變煙草種子的方法，方便實(shí)用，誘變效果好，能夠快速獲得煙草突變體材料，在保證操作人員安全的前提下，節(jié)省了時(shí)間和資金，提高了生產(chǎn)效益。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例提供的EMS誘變煙草種子的方法流程圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步描述。

如圖1所示，本發(fā)明實(shí)施例的EMS誘變煙草種子的方法包括以下步驟：

S101：準(zhǔn)備若干個(gè)長10厘米，寬5厘米的棉布小口袋。該小布袋需雙面縫制不露毛邊，不撒漏煙草種子，同時(shí)種子也不易夾藏在縫隙里，從而方便將處理好的種子從袋中清理出來。

S102：配制0.01mol/L的磷酸緩沖液(將磷酸二氫鈉1.903克，磷酸氫二鈉2.793克溶于蒸餾水，將PH值調(diào)至6.5，終體積為2升)，10％的硫代硫酸鈉EMS解毒液(將100克硫代硫酸鈉溶于1升蒸餾水)，并將配好的溶液放入4℃的冰箱中預(yù)冷處理；將所需型號的移液槍頭裝入槍頭盒中也放入4℃冰箱中預(yù)冷。

S103：將精選的不同煙草種子如普通煙草品種中煙100、紅花大金元、K326、云煙87，野生煙林煙草等種子約2克分別裝入棉布小口袋，用鉛筆在事先準(zhǔn)備好的吊簽上做好標(biāo)記，并用吊簽繩扎緊袋口放入蒸餾水中浸泡24小時(shí)。

S104：24小時(shí)后，將浸泡過的種子取出，用濾紙吸干水分，將種子從布袋中倒出，每袋煙草種子分成12份分別用濾紙包好備用。

S105：穿隔離服，戴防護(hù)口罩后，在通風(fēng)櫥中，用1.5ml的離心管將預(yù)冷的EMS用預(yù)冷的0.01mol/L的磷酸緩沖液配制成體積比濃度分別為0，0.1％，0.3％，0.4％，0.5％，0.6％，0.7％，0.8％，1.0％，1.2％，1.4％，1.6％的處理液(表1)，并搖勻。在此過程中，先把每管所需的緩沖液用移液槍加好，后依次加入EMS， 即刻將蓋子蓋好避免揮發(fā)。接觸過EMS的廢槍頭全部放入裝有預(yù)冷的硫代硫酸鈉溶液的容器中。把種子倒入配好的處理液中，用封口膜將離心管口封嚴(yán)，充分混勻后放置于26℃、110轉(zhuǎn)/分鐘的搖床內(nèi)搖蕩處理16小時(shí)。

表1各濃度EMS處理液配制表

S106：搖蕩處理結(jié)束后從搖床中取出離心管放置在冰上預(yù)冷20分鐘，然后把種子連同處理液倒入棉布小袋中，若種子未完全倒出，可用移液槍加入磷酸緩沖液沖洗幾次。此時(shí)下方接一個(gè)裝有預(yù)冷的硫代硫酸鈉溶液的容器，以防EMS溶液濺在外面，污染環(huán)境危害健康。用帶標(biāo)記的吊簽扎好口，迅速放入磷酸緩沖液中。用大量的0.01mol/L的磷酸緩沖液浸泡沖洗5次，用蒸餾水浸泡沖洗5次，然后用流水沖洗2小時(shí)。接觸過EMS的離心管等物品不要隨意丟棄，全部放入硫代硫酸鈉溶液中浸泡解毒。

S107：將處理好的種子點(diǎn)在鋪有海綿和濾紙的培養(yǎng)皿中做發(fā)芽試驗(yàn)，每個(gè)處理做三次重復(fù)，在26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)兩周后統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率(表2)。

表2處理后種子發(fā)芽率平均值統(tǒng)計(jì)

S108：半致死濃度是指處理后種子或植物的某器官成活率為對照的50％的處理濃度。據(jù)文獻(xiàn)資料，EMS處理種子達(dá)到半致死時(shí)誘變效果最好，突變率最高。從本發(fā)明統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知(表2)，用EMS誘變普通煙草(中煙100、紅花大金元、K326、云煙87)的適宜濃度在0.5％-0.6％左右。而野生煙草(林煙草) 由于其種子相對更小，適宜濃度約為0.3％-0.4％。

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的應(yīng)用原理作進(jìn)一步的說明。

用0.6％濃度的EMS處理液誘變普通煙草品種中煙100種子

準(zhǔn)備精選的中煙100種子200克，裝入雙面縫制不露毛邊，長25厘米，寬15厘米的棉布袋中，扎緊袋口放入蒸餾水中浸泡24小時(shí)。浸泡好的種子用濾紙吸干水分備用。用容量為1升的塑料瓶配制濃度為0.6％的EMS處理液500毫升。將浸泡處理過的種子倒入EMS處理液中蓋好蓋子，用封口膜密封。充分搖勻后放置于26℃、110轉(zhuǎn)/分鐘的搖床內(nèi)誘變處理16小時(shí)。誘變處理結(jié)束后將種子倒入棉布袋中扎緊袋口放入裝有預(yù)冷的磷酸緩沖液的容器中浸泡沖洗，每隔5分鐘更換一次緩沖液，共更換5次。然后用蒸餾水浸泡沖洗5次。將棉布袋放在燒杯中用流水沖洗2小時(shí)。將處理好的種子做發(fā)芽試驗(yàn)，平均發(fā)芽率為54％。按常規(guī)方法將處理的種子播種，出苗假植后移栽大田，田間觀察誘變第1代煙草植株長勢長相，結(jié)果顯示通過此方法誘變的煙草突變類型豐富，誘變效果好。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。