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斑節(jié)對蝦的雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法與流程

文檔序號:12761247閱讀:489來源:國知局

本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種斑節(jié)對蝦的雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法。



背景技術(shù):

人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育有利于快速建立純系,因此對于遺傳育種及基礎(chǔ)生物學(xué)的研究具有重要意義。在海產(chǎn)經(jīng)濟貝類方面,該領(lǐng)域的研究相對滯后,目前僅在近十種海洋經(jīng)濟貝類中進行了人工誘導(dǎo)雌核發(fā)育的研究。這些研究主要是通過使用各種輻射或化學(xué)方法滅活精子,從而誘導(dǎo)卵子的雌核發(fā)育。研究中常用的同源精子滅活法難以排除外源精子基因組的干擾,所以近年來有學(xué)者嘗試采用異源精子誘導(dǎo)來消除這種干擾,如在櫛孔扇貝和盤鮑等貝類中的研究。然而,異源精子誘導(dǎo)依賴于物種的特異性,且受多種環(huán)境因素的影響,如精卵的不同成熟度等,另外卵子的激動也往往不同步,而且如果滅活不充分的話,其實仍有精子污染的問題,因此限制了其在雌核發(fā)育中的應(yīng)用。

與傳統(tǒng)的同源或異源精子誘導(dǎo)法相比,電刺激誘導(dǎo)法在整個過程中不需要精子的參與,能徹底排除外源精子基因組的干擾,是理想的誘導(dǎo)方法。該方法已在兔、豬、鼠和牛等哺乳動物中被廣泛應(yīng)用并取得了很大的成功。其機制是采用電刺激的方式,使卵母細(xì)胞膜上形成可逆微孔,緩沖液中的鈣離子順細(xì)胞內(nèi)外的濃度梯度而進入卵胞質(zhì),引發(fā)鈣庫釋放鈣離子或者胞質(zhì)鈣離子的迅速轉(zhuǎn)移,從而模擬正常受精時鈣離子規(guī)律性的波動現(xiàn)象啟動卵子發(fā)育。但迄今為止,該方法在海洋生物雌核發(fā)育研究中,尚無報道。本研究首次嘗試采用電刺激法誘導(dǎo)斑節(jié)對蝦雌核發(fā)育,對其誘導(dǎo)參數(shù)及雌核發(fā)育過程中的細(xì)胞學(xué)機制進行初步探索,旨在建立電刺激誘導(dǎo)斑節(jié)對蝦雌核發(fā)育的技術(shù)方法。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

針對上述問題,本發(fā)明旨在建立電刺激誘導(dǎo)斑節(jié)對蝦雌核發(fā)育的技術(shù)方法。

一種斑節(jié)對蝦的雌核發(fā)育誘導(dǎo)方法,采用電刺激法,電刺激前先將卵子移入電刺激緩沖液中平衡 2min,調(diào)好電脈沖儀參數(shù),用吸管吸取 1ml 卵子放入電擊杯中,即可進行電刺激處理;

所述電刺激緩沖液為山梨醇緩沖液,具體成分為:含有0.25 mmol/L Mg(C2H3O2)2·4H2O,0.5 mol/L Hepes,0.1 mmol/L Ca(C2H3O2)2H2O,1% BSA,0.25 mmol/L山梨醇;

所述電脈沖儀參數(shù)為場強1.75 kv/cm,電容3μF,3 次電脈沖。

所述電刺激時的卵子密度為11.25×104個/ml。

電刺激后卵子及胚胎的培養(yǎng)方法為:經(jīng)電刺激后的卵子被放入直徑 15 cm 培養(yǎng)皿中,用高溫蒸煮的過濾海水培養(yǎng),水溫保持 20℃,培養(yǎng)密度為每個培養(yǎng)皿中每升約 2×105個卵子;培養(yǎng)初期每半小時輕輕攪動海水一次,以后每 3~4h 攪動一次,以促進其孵化。

電刺激處理后 2 小時統(tǒng)計各組的卵裂率,24 小時統(tǒng)計胚胎存活率;

卵裂率或雌核發(fā)育誘導(dǎo)率=發(fā)生卵裂和排放極體的卵數(shù)/觀察總卵數(shù)×100%;

胚胎存活率=上浮的原腸胚數(shù)量/發(fā)生卵裂的總卵數(shù)×100%。

本發(fā)明的方法簡單有效,經(jīng)電刺激誘導(dǎo)后,斑節(jié)對蝦的卵裂率可達到28%以上,胚胎存活率可達到98%以上。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細(xì)說明。

親本的暫養(yǎng)與精卵的收集

斑節(jié)對蝦取回后暫養(yǎng)于14℃循環(huán)海水中,雌雄個體分開暫養(yǎng)。投喂餌料。暫養(yǎng)期間每天升溫1℃,至16~17℃恒溫待產(chǎn)。采用光照刺激法獲得卵子,待卵子產(chǎn)出后,先用 300 目篩絹過濾卵子,然后用 500 目的篩絹過濾收集卵子,稀釋后顯微鏡下觀察定量卵子的密度。根據(jù)實驗需要調(diào)整卵子的密度。

斑節(jié)對蝦卵子的電刺激處理

卵子雌核發(fā)育的誘導(dǎo):采用電刺激法,電刺激前先將卵子移入電刺激緩沖液中平衡 2min,調(diào)好電脈沖儀參數(shù),用吸管吸取 1ml 卵子放入電擊杯中,即可進行電刺激處理。

所述電刺激緩沖液為山梨醇緩沖液,具體成分為:含有0.25 mmol/L Mg(C2H3O2)2·4H2O,0.5 mol/L Hepes,0.1 mmol/L Ca(C2H3O2)2H2O,1% BSA,0.25 mmol/L山梨醇;

所述電脈沖儀參數(shù)為場強1.75 kv/cm,電容3μF,3 次電脈沖。

所述電刺激時的卵子密度為11.25×104個/ml。

電刺激后卵子及胚胎的培養(yǎng)

經(jīng)電刺激后的卵子被放入直徑 15 cm 培養(yǎng)皿中,用高溫蒸煮的過濾海水培養(yǎng),水溫保持 20℃,培養(yǎng)密度為每個培養(yǎng)皿中每升約 2×105個卵子;培養(yǎng)初期每半小時輕輕攪動海水一次,以后每 3~4h 攪動一次,以促進其孵化。

電刺激處理后 2 小時統(tǒng)計各組的卵裂率,24 小時統(tǒng)計胚胎存活率。

卵裂率或雌核發(fā)育誘導(dǎo)率=發(fā)生卵裂和排放極體的卵數(shù)/觀察總卵數(shù)×100%

胚胎存活率=上浮的原腸胚數(shù)量/發(fā)生卵裂的總卵數(shù)×100%

經(jīng)統(tǒng)計,上述電刺激誘導(dǎo)后,斑節(jié)對蝦的卵裂率為 28.33%,胚胎存活率為98.27%。

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