本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種刺參的雌核發(fā)育誘導方法。

背景技術(shù)：

人工誘導雌核發(fā)育有利于快速建立純系，因此對于遺傳育種及基礎生物學的研究具有重要意義。在海產(chǎn)經(jīng)濟貝類方面，該領(lǐng)域的研究相對滯后，目前僅在近十種海洋經(jīng)濟貝類中進行了人工誘導雌核發(fā)育的研究。這些研究主要是通過使用各種輻射或化學方法滅活精子，從而誘導卵子的雌核發(fā)育。研究中常用的同源精子滅活法難以排除外源精子基因組的干擾，所以近年來有學者嘗試采用異源精子誘導來消除這種干擾，如在櫛孔扇貝和盤鮑等貝類中的研究。然而，異源精子誘導依賴于物種的特異性，且受多種環(huán)境因素的影響，如精卵的不同成熟度等，另外卵子的激動也往往不同步，而且如果滅活不充分的話，其實仍有精子污染的問題，因此限制了其在雌核發(fā)育中的應用。

與傳統(tǒng)的同源或異源精子誘導法相比，電刺激誘導法在整個過程中不需要精子的參與，能徹底排除外源精子基因組的干擾，是理想的誘導方法。該方法已在兔、豬、鼠和牛等哺乳動物中被廣泛應用并取得了很大的成功。其機制是采用電刺激的方式，使卵母細胞膜上形成可逆微孔，緩沖液中的鈣離子順細胞內(nèi)外的濃度梯度而進入卵胞質(zhì)，引發(fā)鈣庫釋放鈣離子或者胞質(zhì)鈣離子的迅速轉(zhuǎn)移，從而模擬正常受精時鈣離子規(guī)律性的波動現(xiàn)象啟動卵子發(fā)育。但迄今為止，該方法在海洋生物雌核發(fā)育研究中，尚無報道。本研究首次嘗試采用電刺激法誘導刺參雌核發(fā)育，對其誘導參數(shù)及雌核發(fā)育過程中的細胞學機制進行初步探索，旨在建立電刺激誘導刺參雌核發(fā)育的技術(shù)方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明旨在建立電刺激誘導刺參雌核發(fā)育的技術(shù)方法。

一種刺參的雌核發(fā)育誘導方法，采用電刺激法，電刺激前先將卵子移入電刺激緩沖液中平衡 2min,調(diào)好電脈沖儀參數(shù)，用吸管吸取 1ml 卵子放入電擊杯中，即可進行電刺激處理；

所述電刺激緩沖液為Zimmerman氏緩沖液，具體成分為：0.1 mmol/L Ca(C₂H₃O₂)₂H₂O，1 mmol/L K₂HPO₄，0.5 mmol/L Mg(C₂H₃O₂)₂·4H₂O，0.1 mmol/L 還原型谷胱甘肽，1% BSA，0.4 mmol/L蔗糖；

所述電脈沖儀參數(shù)為場強0.78 kv/cm，電容5 μF，2次電脈沖。

所述電刺激時的卵子密度為7×10⁴個/ml。

電刺激后卵子及胚胎的培養(yǎng)方法為：經(jīng)電刺激后的卵子被放入直徑 15 cm 培養(yǎng)皿中，用高溫蒸煮的過濾海水培養(yǎng)，水溫保持 20℃，培養(yǎng)密度為每個培養(yǎng)皿中每升約 2×10⁵個卵子；培養(yǎng)初期每半小時輕輕攪動海水一次，以后每 3~4h 攪動一次，以促進其孵化。

電刺激處理后 2 小時統(tǒng)計各組的卵裂率，24 小時統(tǒng)計胚胎存活率；

卵裂率或雌核發(fā)育誘導率=發(fā)生卵裂和排放極體的卵數(shù)/觀察總卵數(shù)×100%；

胚胎存活率=上浮的原腸胚數(shù)量/發(fā)生卵裂的總卵數(shù)×100%。

本發(fā)明的方法簡單有效，經(jīng)電刺激誘導后，刺參的卵裂率可達到28%以上，胚胎存活率可達到98%以上。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。

親本的暫養(yǎng)與精卵的收集

刺參取回后暫養(yǎng)于14℃循環(huán)海水中，雌雄個體分開暫養(yǎng)。投喂餌料。暫養(yǎng)期間每天升溫1℃，至16~17℃恒溫待產(chǎn)。采用光照刺激法獲得卵子，待卵子產(chǎn)出后，先用 300 目篩絹過濾卵子，然后用 500 目的篩絹過濾收集卵子，稀釋后顯微鏡下觀察定量卵子的密度。根據(jù)實驗需要調(diào)整卵子的密度。

刺參卵子的電刺激處理

卵子雌核發(fā)育的誘導：采用電刺激法，電刺激前先將卵子移入電刺激緩沖液中平衡 2min,調(diào)好電脈沖儀參數(shù)，用吸管吸取 1ml 卵子放入電擊杯中，即可進行電刺激處理。

所述電刺激緩沖液為Zimmerman氏緩沖液，具體成分為：0.1 mmol/L Ca(C₂H₃O₂)₂H₂O，1 mmol/L K₂HPO₄，0.5 mmol/L Mg(C₂H₃O₂)₂·4H₂O，0.1 mmol/L 還原型谷胱甘肽，1% BSA，0.4 mmol/L蔗糖。

所述電脈沖儀參數(shù)為場強0.78 kv/cm，電容5 μF，2次電脈沖。

所述電刺激時的卵子密度為7×10⁴個/ml。

電刺激后卵子及胚胎的培養(yǎng)

經(jīng)電刺激后的卵子被放入直徑 15 cm 培養(yǎng)皿中，用高溫蒸煮的過濾海水培養(yǎng)，水溫保持 20℃，培養(yǎng)密度為每個培養(yǎng)皿中每升約 2×10⁵個卵子；培養(yǎng)初期每半小時輕輕攪動海水一次，以后每 3~4h 攪動一次，以促進其孵化。

電刺激處理后 2 小時統(tǒng)計各組的卵裂率，24 小時統(tǒng)計胚胎存活率。

卵裂率或雌核發(fā)育誘導率=發(fā)生卵裂和排放極體的卵數(shù)/觀察總卵數(shù)×100%

胚胎存活率=上浮的原腸胚數(shù)量/發(fā)生卵裂的總卵數(shù)×100%

經(jīng)統(tǒng)計，上述電刺激誘導后，刺參的卵裂率為 28.52%，胚胎存活率為98.15%。