本發(fā)明涉及一種蟬花的人工培養(yǎng)方法，具體涉及一種通過單色光進行光培養(yǎng)提高蟬花孢梗束質(zhì)量的人工培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：中藥蟬花為蟬棒束孢isariacicadaemiquel(蟬擬青霉paecilomycescicadae(miquel)samson)寄生在蟬若蟲上形成的菌蟲復(fù)合體，是我國傳統(tǒng)著名的中藥材之一，其藥用比冬蟲夏草早800年。蟬花屬藥食兼用真菌，具有較高的營養(yǎng)價值和特定的功效。蟬花可產(chǎn)生多種在醫(yī)療和保健上有重要作用的生理活性物質(zhì)，包括核苷類、環(huán)肽類、多糖類、醇類、甾醇類及有機酸等，在調(diào)節(jié)免疫、改善腎功能、調(diào)節(jié)脂類代謝、抗腫瘤、抗疲勞、鎮(zhèn)痛、催眠、降壓降血糖等方面作用明顯。天然蟬花資源十分有限，再加上野生蟬花因為產(chǎn)地不同、采收時間不一、易被雜菌污染霉變及含重金屬等問題，其品質(zhì)受到質(zhì)疑。人工培育的蟬花不含重金屬，無污染，以及營養(yǎng)成分穩(wěn)定，因此，越來越受到人們的重視。目前，已經(jīng)實現(xiàn)了蟬花的工廠化栽培。人工培育蟬花，是將蟬棒束孢經(jīng)過斜面種子、搖瓶培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵獲得的液體種子接種到固體基質(zhì)上先進行暗培養(yǎng)，之后見光培養(yǎng)，最終得到分叉多枝的孢梗束，經(jīng)采收干燥即可作食藥用原料。原料的外觀性狀及活性成分含量對于消費者的感官和品質(zhì)認同至關(guān)重要，而不同的光質(zhì)對于孢梗束顏色和有效活性成分的含量有顯著影響。目前，人工培養(yǎng)蟬花在光培養(yǎng)階段所使用的光源多為白色復(fù)合光，不利于孢梗束外觀性狀和質(zhì)量的控制。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種蟬花的人工培養(yǎng)方法，該方法通過單色光進行光培養(yǎng)，提高蟬花孢梗束的外觀和內(nèi)在質(zhì)量。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種蟬花的人工培養(yǎng)方法，該方法包括如下步驟：步驟1，將蟬花菌種進行擴大培養(yǎng)；步驟2，將步驟1擴大培養(yǎng)得到的菌種進行固體培養(yǎng)；步驟3，對孢梗束進行采收；其中，步驟2固體培養(yǎng)包括暗培養(yǎng)和光培養(yǎng)階段，所述光培養(yǎng)階段采用綠光進行照射。進一步，所述光照強度為50-200lx；更進一步，光照強度為100-200lx。進一步，步驟1所述擴大培養(yǎng)包括斜面培養(yǎng)和液體培養(yǎng)；更進一步，所述液體培養(yǎng)包括搖瓶培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)中的任意一種或幾種。進一步，步驟1擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為20～25℃。進一步，步驟2固體培養(yǎng)的接種量為5％～15％；更進一步，接種量為7％～12％。進一步，步驟2固體培養(yǎng)過程分為光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)，暗培養(yǎng)階段培養(yǎng)溫度20-24℃，相對濕度為70-85％；光培養(yǎng)階段培養(yǎng)溫度為20-22℃，相對濕度為70-85％。進一步，步驟3對孢梗束進行采收后還包括步驟4對孢梗束進行干燥；更進一步，所述干燥方法為先將孢梗束濕度降至35～45％，再進行干燥；更進一步，干燥溫度低于60℃。本發(fā)明所述綠光為波長為577-492nm的光。本發(fā)明斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)所采用的培養(yǎng)基均為本領(lǐng)域常規(guī)培養(yǎng)基；所用液體培養(yǎng)基可以是馬鈴薯-蔗糖-瓊脂培養(yǎng)基(psa)、馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基(pda)、馬鈴薯-葡萄糖-水培養(yǎng)基(psb)、酵母浸出粉-復(fù)合氨基酸-蔗糖培養(yǎng)基(saay)、酵母浸出粉-白砂糖-大豆水解蛋白培養(yǎng)基，麩皮煮汁-白砂糖培養(yǎng)基中的任意一種或幾種。所述固體培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以是谷物培養(yǎng)基、農(nóng)作物秸桿培養(yǎng)基、農(nóng)作物皮殼培養(yǎng) 基、經(jīng)濟林木樹枝培養(yǎng)基等。所述谷物培養(yǎng)基選自以小麥、玉米、大米、小米、黃豆粉、蕎麥、大麥、燕麥、糙米、粳米中的任意一種或幾種為主要原料的培養(yǎng)基；所述農(nóng)作物秸稈培養(yǎng)基選自以麥稈、玉米桿、棉桿、豆桿、芝麻桿中的任意一種或幾種為主要原料的培養(yǎng)基；所述農(nóng)作物皮殼培養(yǎng)基選自以麩皮、大豆皮、棉籽殼中的任意一種或幾種為主要原料的培養(yǎng)基。更進一步，所述固體培養(yǎng)基優(yōu)選谷物培養(yǎng)基。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明在蟬花光培養(yǎng)階段采用綠光(單色光)進行照射，相對于復(fù)合光而言能顯著提高孢梗束產(chǎn)量；且并不影響有效成分含量。具體實施方式以下實施例1～2所用蟬花菌種保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號cgmcc3453(該菌種已在申請?zhí)枮?01110120603.1的發(fā)明專利中公開，為已知菌種)。實施例3所用菌種為自制菌種，制備過程見實施例12；本發(fā)明研究表明蟬花菌種類型并不構(gòu)成影響本發(fā)明效果的因素，本發(fā)明方法對不同蟬花菌種均能夠?qū)崿F(xiàn)效果。實施例1蟬花菌種的擴大培養(yǎng)斜面培養(yǎng)：將蟬花菌種接種于斜面試管中，再將接種菌種的斜面試管放入22℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)時間為7天，待菌絲長滿試管；搖瓶培養(yǎng)：在500m1三角瓶中裝入200m1液體培養(yǎng)基，在0.11mpa壓力下高壓滅菌30分鐘，待冷卻至室溫，將1支斜面試管的菌種接種到500m1三角瓶培養(yǎng)基上，并置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱，溫度22±1℃，150轉(zhuǎn)/分鐘條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為3天；種子罐培養(yǎng)：在50l氣升式發(fā)酵罐中裝入20l液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基溫度大于95℃，加入食用消泡劑，加入量為培養(yǎng)基重量的0.03％,在0.11mpa壓力下，通入蒸汽加熱到121℃，并保壓30-45分鐘；滅菌后，冷卻至20℃時，將4瓶上述培養(yǎng)好的500m1搖瓶菌種接入培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為22±1℃，通氣量為1：0.5v/vmin，保壓4.903-7.0845×104pa，經(jīng)3天通氣培養(yǎng)，達到對數(shù)生長期后即可，終培養(yǎng)體積為20l；發(fā)酵罐培養(yǎng)：在500l氣升式發(fā)酵罐中裝入200l液體培養(yǎng)基，培養(yǎng) 基溫度大于95℃，加入食用消泡劑，加入量為培養(yǎng)基重量的0.03％,在0.11mpa壓力下，通入蒸汽加熱到121℃，并保壓30-45分鐘；滅菌后，冷卻至20℃時，將上述培養(yǎng)好的200l種子罐種子全部接入培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22±1℃，通氣量為1：0.5v/vmin，保壓4.903-7.0845×104pa，經(jīng)3天通氣培養(yǎng)，達到對數(shù)生長期后即可。終培養(yǎng)體積為200l。斜面試管培養(yǎng)基：200g土豆煮汁，20g蔗糖，20g瓊脂，余補水至1000ml，ph值為6.5；搖瓶、種子罐及發(fā)酵罐中的液體培養(yǎng)基：10g酵母浸出粉，5g復(fù)合氨基酸，35g白砂糖，余量補水至1000ml，ph值為6.5。實施例2蟬花菌種的擴大培養(yǎng)培養(yǎng)過程和培養(yǎng)條件基本同實施例1，區(qū)別在于：斜面試管培養(yǎng)基為：10g酵母浸出粉，40g葡萄糖，10g蛋白胨，20g瓊脂，余量補水至1000ml，ph值6.0；搖瓶、種子罐及發(fā)酵罐中的液體培養(yǎng)基：40g麩皮煮汁，30g白砂糖，余補水至1000毫升，ph值為6.5。實施例3蟬花菌種的擴大培養(yǎng)培養(yǎng)過程和培養(yǎng)條件基本同實施例1，區(qū)別在于：斜面試管培養(yǎng)基為：40g麥芽糖，10g蛋白胨，20g瓊脂，余量補水至1000ml；搖瓶、種子罐及發(fā)酵罐中的液體培養(yǎng)基：30g酵母浸出粉，30g白砂糖，5g大豆水解蛋白，余量補水至1000毫升，ph值為6.5。實施例4蟬花菌種的固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基的制備：將小麥清洗控水后，加入適量的水，其重量比為小麥：水為1：1.4，混合均勻；拌勻后裝入培養(yǎng)容器中，培養(yǎng)基厚度控制在4cm。將裝好培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器放置滅菌鍋內(nèi)，121℃下滅菌30-50min；滅菌后，培養(yǎng)容器移置緩沖室內(nèi)，自然冷卻至24℃以下移置接種室內(nèi)。接種：接種前培養(yǎng)容器先在超凈工作臺或百級層流罩內(nèi)(下)用紫外光照射0.5h；每個培養(yǎng)容器按10％的接種量接種實施例1～3任一得到的 菌種，接種后的容器放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：暗培養(yǎng)階段培養(yǎng)溫度為22-24℃，空氣相對濕度70-85％；待菌絲體長滿培養(yǎng)基時轉(zhuǎn)為光培養(yǎng)，光源采用綠色單色光，光照強度100lx，培養(yǎng)室溫度為20-22℃，相對空氣濕度70％～85％。培養(yǎng)室要適時通風(fēng)換氣，保持發(fā)菌室空氣新鮮；至孢梗束成熟，尚未大量產(chǎn)生孢子(約23～26天)。實施例5蟬花菌種的固體培養(yǎng)培養(yǎng)過程基本同實施例4，區(qū)別在于固體培養(yǎng)基為大米和水按1:1.3的比例混合而成；光照強度50lx。實施例6蟬花菌種的固體培養(yǎng)培養(yǎng)過程基本同實施例4，區(qū)別在于固體培養(yǎng)基為小米和水按1:1.3的比例混合而成；光照強度200lx。實施例7蟬花菌種的固體培養(yǎng)培養(yǎng)過程基本同實施例4，區(qū)別在于固體培養(yǎng)基為大麥和水按1:1.3的比例混合而成。實施例8蟬花菌種的固體培養(yǎng)培養(yǎng)過程基本同實施例4，區(qū)別在于固體培養(yǎng)基為糙米和水按1:1.5的比例混合而成；光照強度200lx。實施例9采收及干燥對實施例4～8任一培養(yǎng)的孢梗束進行采收；采收后的孢梗束在相對濕度40％的除濕間除濕40h-50h，進入烘干室準備烘干。烘箱設(shè)置溫度60℃，干燥時間8h-10h。實施例10采收及干燥對實施例4～8任一培養(yǎng)的孢梗束進行采收；采收后的孢梗束在相對濕度45％的除濕間除濕40h-50h，進入烘干室準備烘干。烘箱設(shè)置溫度55℃，干燥時間8h-10h。實施例11采收及干燥對實施例4～8任一培養(yǎng)的孢梗束進行采收；采收后的孢梗束在相對濕度30％的除濕間除濕40h-50h，進入烘干室準備烘干。烘箱設(shè)置溫度 60℃，干燥時間8h-10h。實施例12在我國長江以南的亞熱帶和熱帶地區(qū)低洼地帶，7月，按照一般中藥材的方法采集。在超鏡工作臺上，在無菌條件下，將采來的新鮮蟲草用無菌水沖洗干凈，置于已滅菌的直徑為15cm的培養(yǎng)皿中，蟲草的內(nèi)菌核部分(蟲體)用打濕的脫脂棉包裹，以保濕。蟲草的子實體下方放置一滅菌的載玻片，蟲草菌核部分用小玻片墊起，以使可孕部分不要直接接觸載玻片，其距離約0.5cm左右。然后將培養(yǎng)皿放置于20℃±0.5℃的光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待蟬花孢子彈射于載玻片上時，在孢子周圍滴加剛?cè)芑膒da培養(yǎng)基少許，移出玻片，置于另一滅菌的培養(yǎng)皿中保濕培養(yǎng)，待長出菌絲后用接種針挑取少量菌絲轉(zhuǎn)另一平皿(sday培養(yǎng)基)培養(yǎng)(同上)，直至長出單一的純化的菌落為止。并經(jīng)形態(tài)學(xué)或分子生物學(xué)方法驗證，該菌株為蟬花蟲草(isariacicadaemiquel)無性型。光質(zhì)對孢梗束質(zhì)量的影響取擴大培養(yǎng)得到的液體種子，分別按實施例4～8進行固體培養(yǎng)，按照實施例9的采收及干燥方法對孢梗束進行采收及干燥。1.光質(zhì)對產(chǎn)量的影響計算實施例4～8每800g固體培養(yǎng)基(干重)孢梗束產(chǎn)量，結(jié)果見表1。表1光質(zhì)對產(chǎn)量的影響結(jié)果(n＝3)結(jié)果表明，采用綠光進行光培養(yǎng)，單位固體培養(yǎng)基的孢梗束產(chǎn)量顯著提高。此外，采用綠光進行培養(yǎng)還能顯著降低產(chǎn)孢量，本發(fā)明研究表明采用白色復(fù)合光進行培養(yǎng)其產(chǎn)孢量在0.8～0.9g/800g固體培養(yǎng)基，而采用綠光進行培養(yǎng)，產(chǎn)孢量在0.02～0.03g/800g固體培養(yǎng)基，相對于白色復(fù)合光而言產(chǎn)孢量顯著降低。產(chǎn)孢量降低不就使產(chǎn)品外觀顏色好，質(zhì)量優(yōu)，產(chǎn) 量穩(wěn)定可控，且能明顯減少生產(chǎn)培養(yǎng)過程中粉塵擴散帶來的麻煩。2.光質(zhì)對有效成分含量的影響取實施例1擴大培養(yǎng)的菌種，分別按實施例4～8進行固體培養(yǎng)，測定其有效成分腺苷、hea、多糖的含量。2.1檢測方法2.1.1腺苷和n6-(2-羥乙基)腺苷(hea)的測定采用高效液相色譜法：色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：色譜柱：symmetryc18(waters，4.6mm×250mm，5μm，l.n.0264313291)；流動相：乙腈-0.04mol/l磷酸二氫鉀(5:95)；流速：1.0ml/min；檢測波長：260nm；柱溫：35℃；進樣量：10μl。理論塔板數(shù)按腺苷峰計算應(yīng)不低于3000。對照品溶液的制備：取腺苷及hea對照品適量，精密稱定，加50％甲醇水溶液制成25μg/ml的溶液，即得。供試品溶液的制備：取0.2g蟬花子實體粉末，精密稱定，置20ml具塞試管，精密加入5ml蒸餾水，超聲(40khz)處理30分鐘，取出，立即精密加入5ml甲醇，混勻，過0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。測定：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，進樣時間為20min，測定，在此波長下記錄對照品及供試品對應(yīng)的峰面積，根據(jù)濃度換算結(jié)果進行計算，即得。2.1.2甘露醇的測定采用紫外-可見分光光度法：樣品提取液的制備：精密稱取0.1g蟬花子實體粉末，加入100ml70％乙醇水溶液，85-90℃水浴回流提取，溶液沸騰5min后，取出，過濾，取濾液，待濾液冷卻至室溫，用70％乙醇水溶液定容至100ml，搖勻，即為待測樣品溶液。樣品甘露醇含量測定：精密移取樣品提取液1ml，置15ml具塞試管中，精密加入1ml高碘酸鉀溶液，混勻，室溫放置10min，再加0.1％l-鼠李糖溶液2ml以除去過多的高碘酸鹽，振蕩混勻，最后加4ml新鮮配制的nash試劑，53℃水浴加熱15min使其顯色，快速冷卻至室溫。照紫外-可見分光光度法(中華人民共和國藥典一部附錄va)，在412nm波長處測定吸光值，帶入標準曲線，求出樣品甘露醇濃度(mg/ml)，再 根據(jù)公式計算樣品甘露醇含量(mg/g)。計算公式：2.1.3多糖的測定按照《保健食品功效成分檢測方法》(白鴻主編)的方法。結(jié)果見表2。表2光質(zhì)對有效成分含量的影響(n＝3)實施例腺苷(％)hea(％)甘露醇(mg/g)多糖(mg/g)實施例40.11±0.010.14±0.0182.99±4.2051.18±2.49實施例50.10±0.010.14±0.0181.24±4.1151.32±2.80實施例60.10±0.010.14±0.0181.01±3.9550.95±2.61實施例70.11±0.010.14±0.0181.17±4.0150.83±2.45實施例80.10±0.010.14±0.0180.85±3.9750.27±2.32白光0.10±0.010.17±0.0180.44±4.0054.64±2.76結(jié)果表明，采用綠光進行光培養(yǎng)(實施例4～8)，其孢梗束有效成分含量與白光相比無顯著變化，表明采用單色光照射不影響產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量。當前第1頁12