技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肺生物反應(yīng)器組件和方法。
背景技術(shù)：
：肺移植代表對于許多經(jīng)歷以肺衰竭為典型的狀況，例如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、囊性纖維化、肺動脈高壓、肺癌、和先天性肺疾病等的患者的最后希望。肺移植的典型等待時(shí)間可以是2年以上，導(dǎo)致等待名單上的人30％的死亡率。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：一方面，一種氣道器官生物反應(yīng)器裝置包括：器官室，其配置為容納灌注入流體的器官基質(zhì)支架或器官；連接所述器官室和儲池系統(tǒng)的輸入線，其中所述輸入線包括下述任何：流體線、動脈線、靜脈線、氣管線或輸入泵；連接所述器官室和所述儲池系統(tǒng)的輸出線，其中所述輸出線包括輸出泵；控制器，其配置為通過所述輸入線和所述輸出線控制所述器官室與所述儲池系統(tǒng)之間的流體交換；和連接至所述器官室的室壓傳感器，其中所述室壓傳感器配置為記錄并向所述控制室傳輸室壓。另一方面，一種提供濕式成熟肺器官的方法包括：提供配置為連接至動脈線、靜脈線和氣管線的器官室；提供包括氣道和豐富(substantial)血管系統(tǒng)的肺組織基質(zhì)；將所述氣道連接至所述氣管線；將所述肺組織基質(zhì)連接至所述動脈線和所述靜脈線；在下述至少之一上用細(xì)胞接種所述肺組織基質(zhì)：所述動脈線、所述靜脈線或所述氣管線；給所述肺組織基質(zhì)提供充分時(shí)間的濕式通氣，以發(fā)生第一期望程度的器官成熟，從而生產(chǎn)濕式成熟器官；和任選地在濕式通氣期間在所述器官室中維持基本上恒定的流體水平。還在另一方面，一種保存、修復(fù)和/或改變肺器官的方法包括：提供配置為連接至動脈線、靜脈線和氣管線的器官室；提供包括氣道和豐富血管系統(tǒng)的濕式成熟肺或收集肺；將所述氣道連接至所述氣管線；將所述濕式成熟肺或所述收集肺連接至動脈線和靜脈線；通過至少所述動脈線或所述靜脈線在所述濕式成熟肺或所述收集肺上灌注培養(yǎng)基；通氣向所述濕式成熟肺或所述收集肺提供充足時(shí)間的干式通氣以產(chǎn)生或維持功能性肺器官；和使氣管壓力波動最小化。實(shí)施方式可包括一個或多個下列特征。在一些實(shí)施方式中，輸入泵、輸出泵、或二者為雙向泵。在特定實(shí)施方式中，所述控制器配置為借助以下任一種方式通過所述輸入線和所述輸出線控制所述器官室與所述儲池系統(tǒng)之間的流體交換：控制所述雙向泵的方向，或控制所述雙向泵的泵循環(huán)持續(xù)時(shí)間。在一些實(shí)施方式中，所述控制器配置為響應(yīng)從所述室壓傳感器傳輸?shù)臄?shù)據(jù)通過所述輸入線和所述輸出線控制所述器官室與所述儲池系統(tǒng)之間的流體交換。在特定實(shí)施方式中，所述輸入線包括所述動脈線、所述靜脈線、和所述氣管線。在一些實(shí)施方式中，所述氣管線連接至所述器官室和正壓歧管，并包括：氣源；連接至所述氣源的蓄壓器(pressurereservoir)；和連接至所述蓄壓器的泄壓閥，其中所述正壓歧管由所述控制器控制。在特定實(shí)施方式中，所述正壓歧管配置為沿著所述氣管線施加連續(xù)正壓。在一些實(shí)施方式中，所述動脈線和所述靜脈線之一或二者包括壓力傳感器、流體泵、或者壓力傳感器和流體泵二者。在特定實(shí)施方式中，所述動脈線包括第一壓力傳感器和第一泵，各自由所述控制器控制；所述靜脈線包括由所述控制器控制的第二壓力傳感器；和所述氣管線包括第三壓力傳感器和第三泵，各自由所述控制器控制。在一些實(shí)施方式中，所述第三泵為雙向的。在特定實(shí)施方式中，所述動脈線和所述靜脈線連接至所述儲池系統(tǒng)，所述氣管線連接至通氣器。在一些實(shí)施方式中，氣壓控制模塊連接至所述器官室，其中所述氣壓控制模塊包括：氣體入口線，其包括入口壓力閥、入口蓄壓器和入口壓縮器；和氣體出口線，其包括出口壓力閥、出口蓄壓器和出口壓縮器，其中所述控制器控制下列任一：入口壓力閥、入口壓縮器、出口壓力閥或出口壓縮器。在特定實(shí)施方式中，所述器官室包括室壓傳感器和雙向排水室泵，各自由控制模塊控制，所述控制模塊響應(yīng)由所述室壓傳感器傳輸?shù)臄?shù)據(jù)而控制雙向排水泵。在一些實(shí)施方式中，通過使靜脈線中的壓力水平與培養(yǎng)基儲池中的壓力水平平衡來實(shí)現(xiàn)防止經(jīng)肺壓力梯度(transpulmonarypressuregradient)。在特定實(shí)施方式中，所述器官室還包括連接至所述器官室的氣壓控制模塊，其中所述氣壓控制模塊：在吸氣階段在所述器官室中生成負(fù)壓；對于穩(wěn)定階段維持器官室壓；和在呼氣階段在所述器官室中生成正壓。在一些實(shí)施方式中，濕式通氣包括：將所述氣管線連接至培養(yǎng)基儲池，其中所述氣管線包括連接至所述控制器的雙向氣管泵；用所述雙向氣管泵用培養(yǎng)基使所述肺組織基質(zhì)擴(kuò)張；和用所述雙向氣管泵將培養(yǎng)基從所述肺組織基質(zhì)抽出而使所述肺組織基質(zhì)收縮。所述培養(yǎng)基在濕式通氣期間不斷更新。在特定實(shí)施方式中，濕式通氣包括：將所述氣管線連接至培養(yǎng)基儲池，其中所述氣管線包括各自連接至所述控制器的第一泵和第二泵；用所述第一泵用培養(yǎng)基使所述肺組織基質(zhì)充脹；和使用所述第二泵將培養(yǎng)基從所述肺組織基質(zhì)抽出而使所述肺組織基質(zhì)收縮。所述培養(yǎng)基在濕式通氣期間不斷更新。在一些實(shí)施方式中，所述控制器響應(yīng)由連接至所述氣管線的氣管壓力傳感器傳輸?shù)臄?shù)據(jù)而控制所述雙向氣管泵。在特定實(shí)施方式中，使氣管壓力波動最小化包括：將所述氣管線連接至培養(yǎng)基儲池，其中所述氣管線包括各自連接至控制器的通氣器和氣管壓力傳感器；使用所述通氣器用氣體使所述濕式成熟肺或所述收集肺充脹；和使用所述通氣器使所述濕式成熟肺或所述收集肺收縮。所述控制器引起所述通氣器將所述濕式成熟肺或所述收集肺充脹或收縮，以使由所述氣管壓力傳感器感知的所述氣管壓力波動最小化。在一些實(shí)施方式中，使任意氣管壓力波動最小化包括：提供連接至所述氣管線和控制器的正壓歧管，和提供連接至所述氣管線和所述控制器的氣管壓力傳感器。所述正壓歧管包括：蓄壓器；連接至所述蓄壓器的氣源；和泄壓閥。所述控制器響應(yīng)由所述氣管壓力傳感器傳輸?shù)臄?shù)據(jù)而控制壓縮器或泄壓閥。在特定實(shí)施方式中，所述蓄壓器具有適當(dāng)大小以使吸氣和呼氣期間的壓力波動最小化。在一些實(shí)施方式中，所述器官室還包括連接至所述器官室的氣壓控制模塊。所述氣壓控制模塊：在吸氣階段在所述器官室中生成負(fù)壓；維持穩(wěn)定期的器官室壓；和在呼氣階段在所述器官室中生成正壓。在特定實(shí)施方式中，使氣管壓力波動最小化包括：提供連接至所述氣管線和控制器的正壓歧管，和提供連接至所述氣管線和所述控制器的氣管壓力傳感器。所述正壓歧管包括：蓄壓器；連接至所述蓄壓器的氣源；和泄壓閥。所述控制器響應(yīng)由所述氣管壓力傳感器傳輸?shù)臄?shù)據(jù)而控制壓縮器或泄壓閥；和所述器官室包括連接至所述器官室的氣壓控制模塊。所述氣壓控制模塊：在吸氣階段在所述器官室中生成負(fù)壓；維持穩(wěn)定期的器官室壓；和在呼氣階段在所述器官室中生成正壓。在一些實(shí)施方式中，生產(chǎn)功能性肺。在特定實(shí)施方式中，器官為全肺或其血管化部分。在一些實(shí)施方式中，具有受損的或降低的肺容量的受試者通過將本文所述的肺移植入所述受試者中來治療。在特定實(shí)施方式中，灌注細(xì)胞培養(yǎng)基。在特定實(shí)施方式中，流體(如細(xì)胞培養(yǎng)基、液體或空氣)灌注到器官基質(zhì)上和/或器官基質(zhì)中。在一些實(shí)施方式中，去細(xì)胞化(decellularized)的肺組織基質(zhì)、肺器官或收集肺為(或來自、或具備其大小)人肺、或來自豬、綿羊、牛、馬、狗、貓或其它大型動物的肺。除非另有定義，本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員的通常理解具有相同的意義。雖然可以使用與本文中所描述的方法和材料相似或等同的方法和材料來實(shí)施本發(fā)明，但是下文描述了合適的方法和材料。本文中所提及的所有出版物、專利申請、專利、和其它參考文獻(xiàn)通過引用而并入本文。在沖突的情況中，應(yīng)當(dāng)以本說明書(包括定義)為準(zhǔn)。另外，材料、方法、和實(shí)例僅是例示性的，而并不意圖為限制性的。在附圖和下文描述中列出了本發(fā)明的一個或多個實(shí)施方案的詳情。本發(fā)明的其它特征、目的、和優(yōu)點(diǎn)將會從描述和附圖以及從權(quán)利要求書變得明顯。附圖說明圖1為示例性灌注肺生物反應(yīng)器的示意圖。圖2為配置為利用灌注系統(tǒng)提供負(fù)壓濕式通氣的示例性肺生物反應(yīng)器的示意圖。圖3-3a為由圖4代表的示例性正壓歧管的示意圖。圖4為包括負(fù)壓干式通氣系統(tǒng)的具有單獨(dú)的培養(yǎng)基儲池和監(jiān)控的靜脈排出的示例性肺生物反應(yīng)器的示意圖。圖5為包括正壓濕式通氣系統(tǒng)和灌注系統(tǒng)的示例性肺生物反應(yīng)器的示意圖。圖6為包括正壓干式通氣系統(tǒng)和灌注系統(tǒng)的示例性肺生物反應(yīng)器的示意圖。圖7為連接至器官培養(yǎng)室的氣壓控制模塊的示意圖。圖8為包括負(fù)壓濕式通氣系統(tǒng)的具有灌注系統(tǒng)并具有如圖7所示的氣壓控制模塊的示例性肺生物反應(yīng)器的示意圖。圖9為包括負(fù)壓干式通氣系統(tǒng)的具有如圖3所示的正壓模塊和圖7所示的氣壓控制模塊的示例性肺生物反應(yīng)器的示意圖。圖10A為臨床示例性肺生物反應(yīng)器的示意圖。圖10B-C為與肺培養(yǎng)物相關(guān)的生理數(shù)據(jù)的圖，包括來自分離的肺培養(yǎng)物的示例通氣量(上)和壓力(下)軌跡。上圖中的不連續(xù)性表示逸出PEEP閥的體積；VT表示潮氣體積；RR表示呼吸率；PT表示氣管壓力；POC表示器官室壓力；I表示吸氣時(shí)間；E表示呼氣時(shí)間。圖10D為體內(nèi)對肺的作用力的示意圖。圖11A為表示豬肺的短期(24h)分離肺培養(yǎng)(ILC)后的器官重量變化的生理數(shù)據(jù)的圖。圖11B為表示豬肺的短期ILC期間從PA到PV的培養(yǎng)基的溶解O2、溶解CO2、以及葡萄糖含量的變化的生理數(shù)據(jù)的圖。示出的數(shù)據(jù)覆蓋了每種條件的三個獨(dú)立的短期ILC。對于各組培養(yǎng)的肺，培養(yǎng)基每24小時(shí)取樣5-7次。圖11C為示出短期ILC后豬肺組織的蘇木精和伊紅染色結(jié)果的圖(比例尺，250μm)。圖11D為示出短期ILC后豬肺組織的TUNEL測定結(jié)果。細(xì)胞核和TUNEL陽性細(xì)胞分別為藍(lán)色和綠色(比例尺，150μm)。圖11E為表示短期ILC后豬肺組織中TUNEL陽性細(xì)胞定量的生理數(shù)據(jù)的圖。圖12A為豬肺的長期ILC(72h)期間從PA到PV的培養(yǎng)基的溶解O2、溶解CO2、葡萄糖和乳酸鹽含量的變化的生理數(shù)據(jù)的圖。示出的數(shù)據(jù)覆蓋了每種條件的四個獨(dú)立的長期ILC。對于各組培養(yǎng)的肺，培養(yǎng)基每24小時(shí)取樣3-5次。圖12B為表示在長期ILC下豬肺的氧交換功能的生理數(shù)據(jù)的圖(左)。功能測試后PA(橙色)和PV(綠色)pO2值(右)。圖12C為表示長期ILC下培養(yǎng)的豬肺的灌注動力學(xué)的生理數(shù)據(jù)的圖。生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的總培養(yǎng)基體積(上)。肺動脈流速(QPA，上數(shù)第二)。肺動脈壓(PPA，下數(shù)第二)。肺血管阻力(PVR，下)。黑線表示平均值?；揖€表示平均值±SEM。圖12D示出長期ILC后豬肺組織的示例性TUNEL圖像(左)。TUNEL陽性細(xì)胞定量(右)。圖12E示出長期ILC之前(0h)和之后(72h)豬肺組織的組織學(xué)和免疫熒光分析的圖像。蘇木精和伊紅染色(H&E，比例尺，250μm)。VE-鈣粘蛋白、E-鈣粘蛋白、ZO-1和pro-SPB(紅色，細(xì)胞核為藍(lán)色，比例尺50μm)。圖13A為表示單一人肺的長期(72h)ILC期間從PA到PV的培養(yǎng)基的溶解O2、溶解CO2、葡萄糖和乳酸鹽含量的變化的生理數(shù)據(jù)的圖。培養(yǎng)基每24小時(shí)取樣4次。圖13B為表示在長期ILC下人肺的氧交換功能的圖(左)。功能試驗(yàn)后PA(橙色)和PV(綠色)pO2值(右)。圖13C為表示長期ILC下培養(yǎng)的人肺的灌注動力學(xué)的生理數(shù)據(jù)的圖。生物反應(yīng)器系統(tǒng)中的總培養(yǎng)基體積(上)。肺動脈流速(QPA，上數(shù)第二)。肺動脈壓(PPA，下數(shù)第二)。肺血管阻力(PVR，下)。黑線表示平均值?；揖€表示平均值±SEM。圖13D示出長期ILC后人肺組織的示例性TUNEL圖像(左)。TUNEL陽性細(xì)胞定量(右)。圖13E示出長期ILC之前(0h)和之后(72h)豬肺組織的組織學(xué)免疫熒光分析的圖像。蘇木精和伊紅染色(H&E，比例尺，250μm)。VE-鈣粘蛋白、E-鈣粘蛋白、ZO-1和pro-SPB(紅色，細(xì)胞核藍(lán)色，比例尺50μm)。圖14A-14C為在生理熱條件(physiothermalconditions)下用0.6ml/minKHB還有5％右旋糖酐灌注的與大鼠肺保存相關(guān)的生理數(shù)據(jù)的圖。14A；示出調(diào)節(jié)主室壓力0--8cmH2O、呼吸率為20/min的描圖。14B為示出PA灌注壓的時(shí)程的柱狀圖，表明灌注壓隨時(shí)間維持。14C為示出也隨時(shí)間降低的動態(tài)順應(yīng)性(dynamiccompliance,Cdyn)的柱狀圖。在本實(shí)驗(yàn)中，分離的肺經(jīng)4小時(shí)的灌注而發(fā)展水腫。Cdyn定義為潮氣體積(ml)除以峰主室負(fù)壓值(cmH2O)。圖15A-B為在生理熱條件下用0.6ml/minKHB灌注的與大鼠肺保存相關(guān)的生理數(shù)據(jù)的圖。15A為示出PA灌注壓的時(shí)程的柱狀圖，表明壓力逐漸降低。15B為示出也隨時(shí)間降低的動態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)的柱狀圖。在本實(shí)驗(yàn)中，分離的肺通過4小時(shí)的灌注變得水腫。圖15C為示出用蘇木精和伊紅灌注后染色肺樣品的結(jié)果的圖像。左圖示出100×的對照，而右圖示出100×下的灌注6小時(shí)后的樣品。該圖像示出在該生物反應(yīng)器中尸肺的6h的灌注和通氣后正常肺結(jié)構(gòu)和細(xì)胞完整性的維持。具體實(shí)施方式本文件關(guān)于涉及氣道器官生成和保存的方法和材料。本發(fā)明至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)，即配置為生成功能性肺組織的生物反應(yīng)器可用于為準(zhǔn)備好移植入人和其它動物中的功能性氣道器官的生長提供更實(shí)際的環(huán)境。通過給定的基質(zhì)，例如人工的或去細(xì)胞化的肺組織基質(zhì)生成肺組織。本發(fā)明還基于使用這種現(xiàn)實(shí)環(huán)境用于在延長的時(shí)間段內(nèi)保存、修復(fù)和改變供體器官，從而提供更多改進(jìn)且個性化的用于移植的移植物的用途。如本文中所使用的，“功能性”肺組織執(zhí)行正常的健康肺的大多數(shù)或所有功能，例如容許將氧從空氣運(yùn)輸?shù)窖髦?，及將二氧化碳從血流釋放到空氣中。它濕潤吸入的空氣，生成表面活性劑以降低肺泡中的表面張力，?或生成并轉(zhuǎn)運(yùn)粘液以將吸入的微粒物質(zhì)從遠(yuǎn)端向近端氣道除去。如本文中所使用的，術(shù)語“去細(xì)胞化的”和“無細(xì)胞的”使用或定義為使用標(biāo)準(zhǔn)的組織學(xué)染色方法在組織切片中完全或幾乎完全沒有可檢出的胞內(nèi)物、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、和細(xì)胞核。優(yōu)選地，但不必要地，殘留的細(xì)胞碎片也已經(jīng)從去細(xì)胞化的器官或組織除去。去細(xì)胞化的組織/器官基質(zhì)在本方法的一些實(shí)施方案中，肺組織在去細(xì)胞化的基質(zhì)上生成。如下所述，用于制備去細(xì)胞化的肺組織基質(zhì)的方法和材料是本領(lǐng)域中已知的?？梢允褂萌魏魏线m的材料來制備此類基質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組織基質(zhì)可以是自去細(xì)胞化的肺組織形成的無細(xì)胞組織支架。例如，可以通過合適的方法來使諸如人肺等組織，如一個或一對人肺或其一部分，如人、豬、牛、靈長類、或禽類的尸肺或其一部分，進(jìn)行去細(xì)胞化，以在維持組織或組織部分的形態(tài)學(xué)完整性和血管系統(tǒng)并保留胞外基質(zhì)(ECM)蛋白的同時(shí)從組織除去天然的細(xì)胞。用于使哺乳動物肺組織去細(xì)胞化的方法記載于例如O'NeillJD等，Decellularizationofhumanandporcinelungtissuesforpulmonarytissueengineering.AnnThoracSurg.2013Sep；96(3):1046-55；NicholsJE等，Productionandassessmentofdecellularizedpigandhumanlungscaffolds,TissueEngPartA.2013Sep；19(17-18):2045-62；GilpinSE等，Perfusiondecellularizationofhumanandporcinelungs:Bringingthematrixtoclinicalscale.JournalofHeartandLungTransplantation.Inpress；SongJJ等，Bioartificiallungengineering.AmJTransplant.2012Feb；12(2):283-8；和OttHC等，Regenerationandorthotopictransplantationofabioartificiallung.NatMed.2010Aug；16(8):927-33。示例性去細(xì)胞化方法可以包括例如用液氮使組織(例如肺組織)重復(fù)冷凍-融化循環(huán)。在其它情況中，可以使組織受到陰離子或離子細(xì)胞破壞介質(zhì)諸如十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚乙二醇(PEG)、或TritonX處理。還可以用核酸酶溶液(例如，核糖核酸酶、脫氧核糖核酸酶)處理組織，并在無菌磷酸鹽緩沖鹽水中溫和攪動清洗。示例性方法是本領(lǐng)域已知的，例如O'NeillJD等，Decellularizationofhumanandporcinelungtissuesforpulmonarytissueengineering.AnnThoracSurg.2013Sep；96(3):1046-55。在一些情況中，可以使用本領(lǐng)域中已知的方法和材料通過沖洗器官或組織的血管、導(dǎo)管、和/或腔來實(shí)施去細(xì)胞化。例如，如MaghsoudlouP等，Preservationofmicro-architectureandangiogenicpotentialinapulmonaryacellularmatrixobtainedusingintermittentintra-trachealflowofdetergentenzymatictreatment.Biomaterials.2013Sep；34(28):6638-48所述。在沖洗步驟后，可以經(jīng)由管線用如上文所描述的細(xì)胞破壞介質(zhì)例如去離子水中的1％SDS灌注器官或組織。通過組織的灌注可以是順行的或逆行的，并且可以交替方向以提高灌注效率。根據(jù)器官或組織的大小和重量和特定陰離子或離子去污劑及陰離子或離子去污劑在細(xì)胞破壞介質(zhì)中的濃度，一般用細(xì)胞破壞介質(zhì)以約2至約12小時(shí)/克組織來灌注組織。包括清洗，可以對器官灌注至多約12至約72小時(shí)/克組織。一般針對生理狀況調(diào)節(jié)灌注，包括流速和壓力，如5-100mmHg的壓力，0.1-10倍于來源有機(jī)體或個體的生理心輸出量的流速。在另一示例性方法中，去細(xì)胞化方法包括將去污劑如(1)0.1％SDS、(2)2％脫氧膽酸鈉(SDC)或(3)8mmol/升(3)3-[(3-膽酰胺基丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)(pH12)去污劑在30cmH2O的恒壓下通過肺動脈灌注。針對所有3種去污劑的方案包括：1.用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)進(jìn)行10-分鐘的初始順行清洗，2.去污劑灌注，時(shí)間為使不透明或半透明基質(zhì)顯現(xiàn)(指示去細(xì)胞化)所需的時(shí)間加上初始時(shí)間的另外20％(如，70分鐘+14分鐘)，3.15-分鐘的去離子水清洗，和4.另外172小時(shí)的PBS清洗，其中加入抗生素和抗真菌劑。該去細(xì)胞化方法例如可包括在去離子水之后的另外1％Triton-X的清洗。SDC方案可以在SDC之前的0.1％Triton-X灌注以及SDC后的1mol/升NaCl清洗。類似地，豬和人的肺去細(xì)胞化方法可包括在恒壓下將去污劑或其它去細(xì)胞化劑通過肺動脈灌注，接著順次用H2O、1％Triton-X溶液和PBS清洗。與大鼠肺類似，在目視觀察和不透明或半透明的基質(zhì)出現(xiàn)時(shí)，可認(rèn)為去細(xì)胞化完成。起始器官中的可變性，其主要是由于收集期間預(yù)沖洗的范圍，以及任何所得的血塊可對灌注所需的時(shí)長有影響。一般而言，去細(xì)胞化灌注的時(shí)間可以例如自4至7天變化。去細(xì)胞化的組織可以基本上由組織的所有或大多數(shù)區(qū)域的胞外基質(zhì)(ECM)組分(包括血管樹的ECM組分)組成(如，至少85重量％的純度、90重量％的純度、92重量％的純度、95重量％的純度、96重量％的純度、97重量％的純度、98重量％的純度和99重量％的純度)。ECM組分可以包括下列任意或所有項(xiàng)：纖連蛋白、肌原纖蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白、膠原家族成員(例如，膠原I、III、和IV)、糖胺聚糖、基體物質(zhì)(groundsubstance)、網(wǎng)狀纖維和血小板反應(yīng)蛋白，其可保持組織為限定的結(jié)構(gòu)例如基底膜。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，去細(xì)胞化的肺組織基質(zhì)保留完整的血管系統(tǒng)。保留基本上完整的血管系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)移植后組織基質(zhì)與受試者血管系統(tǒng)的連接。另外，可以用例如照射(例如，UV、γ)來進(jìn)一步處理去細(xì)胞化的組織基質(zhì)，以降低或消除保留于去細(xì)胞化的組織基質(zhì)之上或之中的任何類型的微生物的存在。使用物理、化學(xué)、和酶手段來獲得去細(xì)胞化的組織基質(zhì)的方法是本領(lǐng)域中已知的，參見例如Liao等，Biomaterials29(8)：1065-74(2008)；Gilbert等，Biomaterials27(9)：3675-83(2006)；Teebken等，Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg.19:381-86(2000)。還可參見美國專利公開文本No.2009/0142836；2005/0256588；2007/0244568；及2003/0087428。人工器官基質(zhì)在本方法的一些實(shí)施方案中，肺組織在人工器官基質(zhì)上生成。用于制備人工器官基質(zhì)的方法和材料是本領(lǐng)域中已知的?？梢允褂萌魏魏线m的材料來制備此類基質(zhì)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，人工器官基質(zhì)可以是自多孔材料諸如例如聚乙醇酸、PluronicF-127(PF-127)、Gelfoam海綿、膠原-糖胺聚糖(GAG)、血纖蛋白原-纖連蛋白-玻連蛋白水凝膠(FFVH)、和彈性蛋白開發(fā)的支架。參見例如Ingenito等，JTissueEngRegenMed.2009Dec17；Hoganson等，PediatricResearch,May2008,63(5):520-526；Chen等，TissueEng.2005Sep-Oct；11(9-10):1436-48。在一些情況中，人工器官基質(zhì)可具有與肺泡單元相似的多孔結(jié)構(gòu)。參見Andrade等，AmJPhysiolLungCellMolPhysiol.2007Feb；292(2):L510-8。在一些情況中，植入的人工器官基質(zhì)可表達(dá)器官特異性標(biāo)志物(例如，克拉拉細(xì)胞、肺細(xì)胞、和呼吸表皮的肺特異性標(biāo)志物)。在一些情況中，植入的人工器官基質(zhì)可組織成可鑒定的結(jié)構(gòu)(例如，人工肺基質(zhì)中與肺泡和末端支氣管相似的結(jié)構(gòu))。例如，用FFVH制成的植入的人工肺基質(zhì)可在體外促進(jìn)細(xì)胞附著、擴(kuò)散和胞外基質(zhì)表達(dá)，以及在體內(nèi)促進(jìn)表觀移植(apparentengraftment)，對周圍組織具有營養(yǎng)效應(yīng)的證據(jù)。參見Ingenito等，見上文。還參見美國專利號7,662,409和6,087,552；美國專利公開號2010/0034791；2009/0075282；2009/0035855；2008/0292677；2008/0131473；2007/0059293；2005/0196423；2003/0166274；2003/0129751；2002/0182261；2002/0182241；和2002/0172705。尸體的器官本文所述的方法和裝置也用于維持和制備尸體的肺以供移植使用。自人和動物供體分離供體器官(如肺)的方法和材料是本領(lǐng)域中已知的。例如，記載于PasqueMK等，Standardizingthoracicorganprocurementfortransplantation.JThoracCardiovascSurg.2010Jan；139(1):13-7.和BribriescoAC等Experimentalmodelsoflungtransplantation.FrontBiosci(EliteEd).2013Jan1；5:266-72。可以使用任何適當(dāng)?shù)姆椒▉矸蛛x這些。這些供體器官可使用本文所述生物反應(yīng)器維持足以準(zhǔn)備移植用受體的時(shí)間，或者在促進(jìn)全部器官或其部分的修復(fù)的條件下足以維持器官適于移植的時(shí)間。在一些實(shí)施方案中，來自人器官供體的供體器官可改造為除去內(nèi)皮襯里并隨后用受體來源的表皮細(xì)胞重新接種，從而使免疫原性最小化。例如，這可經(jīng)去離子水灌注、低去污劑濃度如0.05％聚多卡醇灌注、或酶溶液如DNAse或膠原酶灌注，通過滲透沖擊完成。發(fā)現(xiàn)由于感染、物理性損壞如創(chuàng)傷、或由長期低灌注引起的缺血性損傷、或由供體條件如腦死亡引起的損傷而不適于立即移植的供體器官可使用本文所述裝置和方法修復(fù)(如，通過安裝，灌注，使用抗生素、細(xì)胞、生長因子刺激和抗炎處理來修復(fù))?？赏ㄟ^遺傳和細(xì)胞修飾而使動物來源的器官的免疫原性減少。在一些情況中，供體肺可顯示感染的射線照相或支氣管鏡檢查的證據(jù)。為了控制生物負(fù)載和其它潛在的感染源，肺可安裝在例如本文所述的裝置上，并用抗生素和無菌溶液通過血管系統(tǒng)和氣管沖洗。接著可例如用支氣管鏡從供體肺吸出溶液。該沖洗步驟可在培養(yǎng)之前和培養(yǎng)期間執(zhí)行。在特定情況下，可發(fā)生死亡前的肺栓塞或心搏驟停后的血液凝結(jié)，導(dǎo)致血塊形成的風(fēng)險(xiǎn)。分離的供體器官可安裝并經(jīng)肺靜脈逆行沖洗以除去血塊和/或可用溶栓物質(zhì)灌注以裂解任何可能的血塊。在一些情況下，在常與供體腦死亡相關(guān)的供體肺中，供體器官可含有高水平的炎性細(xì)胞因子和/或在肺泡巨噬細(xì)胞中的炎性狀態(tài)(VenkateswaranRV等，Theproinflammatoryenvironmentinpotentialheartandlungdonors:prevalenceandimpactofdonormanagementandhormonaltherapy.Transplantation.2009Aug27；88(4):582-8)。這些肺可在器官培養(yǎng)之前和/或器官培養(yǎng)期間用抗炎藥物處理(例如用其灌注)。在特定情況中，可灌注特異靶向炎性細(xì)胞類型的藥物。該炎性狀態(tài)還可導(dǎo)致毛細(xì)管滲漏并增加供體器官中的組織水，如下所述，例如VenkateswaranRV等，Measurementofextravascularlungwaterfollowinghumanbraindeath:implicationsforlungdonorassessmentandtransplantation.EurJCardiothoracSurg.2013Jun；43(6):1227-32。在保存期間，器官可用高滲溶液灌注，以便將組織水拉回到血管空間，從而恢復(fù)更健康的流體平衡和正常的肺順應(yīng)性。在一些情況中，保存液還可經(jīng)由本文所述裝置給予至肺以減少移植失敗的風(fēng)險(xiǎn)。在一些實(shí)例中，保存液可包括低鉀胞外型溶液，如或如表1所示的組合物。氨基酸、抗生素或試劑(如表2中示出的那些)也可加入保存液中。表1灌注液組成表2灌注液組成ROS清除劑(谷胱甘肽/N-乙酰半胱氨酸)第二信使(二丁酰cAMP(cAMP類似物))糖代謝(胰島素)膜穩(wěn)定劑(氫化可的松)生長因子(VEGF,FGF)氧載體(紅細(xì)胞、全氟化碳、血紅蛋白結(jié)合的氧載體)在一些情況中，供體肺可能顯示由各種因素導(dǎo)致的損傷的跡象，這些因素例如供體肺的品質(zhì)、保存液的類型、收集和培養(yǎng)之間的時(shí)長等。為了減少和/或消除損傷度，可以將供體肺和/或其部分安裝在例如本文所述的裝置上，并通液體和/或干式通氣。在一個實(shí)例中，氣體經(jīng)氣管線灌注，而心室和/或動脈線用模擬生理參數(shù)的溶液如生理鹽水溶液、含血溶液和/或保存液灌注。供體肺可保持安裝直到供體肺需要移植和/或直到損傷的供體肺顯示再表皮化和顯示內(nèi)皮屏障功能提高。如下所述，這些灌注方法可與細(xì)胞接種法組合。細(xì)胞接種在本文中所描述的一些方法中，用細(xì)胞，例如分化的或再生的細(xì)胞接種肺組織基質(zhì)，例如去細(xì)胞化的肺組織基質(zhì)或人工肺基質(zhì)?？梢允褂萌魏魏线m的再生細(xì)胞類型，諸如幼稚或未分化的細(xì)胞類型來接種肺組織基質(zhì)。細(xì)胞可以在各階段接種，包括但不限于干細(xì)胞階段(如，誘導(dǎo)后)、祖細(xì)胞階段、成血細(xì)胞階段或分化階段(如，CD31+、vWF+)。如本文中所使用的，再生細(xì)胞可以包括但不限于祖細(xì)胞、前體細(xì)胞、和“成人”衍生的干細(xì)胞(包括臍帶細(xì)胞(例如，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞))和胚胎干細(xì)胞。再生細(xì)胞還可以包括分化的或定型的細(xì)胞類型。適合于本文中所提供的方法和材料的干細(xì)胞可以包括人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(iPSC)(如，未分化的、分化的內(nèi)胚層、前內(nèi)胚層(anteriolizedendoderm)、TTF-1陽性肺祖細(xì)胞)、人間充質(zhì)干細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、多能成人祖細(xì)胞(MAPC)、iPS來源的間充質(zhì)細(xì)胞、或胚胎干細(xì)胞。在一些情況中，還可以使用源自其它組織的再生細(xì)胞。例如，可以使用源自皮膚、骨、肌肉、骨髓、滑膜、或脂肪組織的再生細(xì)胞來形成干細(xì)胞接種的組織基質(zhì)。在一些情況中，本文所提供的肺組織基質(zhì)可以可選地或進(jìn)一步用分化的細(xì)胞類型例如(優(yōu)選人)上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞接種。例如，肺基質(zhì)可用內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)由血管系統(tǒng)(如通過動脈線或靜脈線)接種、用上皮細(xì)胞經(jīng)由氣道(如通過氣管線)接種。肺基質(zhì)還可用一種或多種細(xì)胞類型(如，一種或多種類型的上皮和間充質(zhì)細(xì)胞、成人外周血來源的上皮細(xì)胞、臍帶血來源的上皮細(xì)胞、iPS來源的上皮細(xì)胞、祖細(xì)胞階段的細(xì)胞(如平滑肌)、成人肺來源的細(xì)胞混合物(如大鼠-人)、商購的小氣道上皮細(xì)胞或肺泡上皮細(xì)胞、胚胎干(ES)細(xì)胞來源的上皮細(xì)胞、和/或人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC))接種。任何類型的適合的商購培養(yǎng)基和/或培養(yǎng)基試劑盒可用于細(xì)胞的接種和培養(yǎng)。例如，SAGM培養(yǎng)基可用于小氣道細(xì)胞(如，SAGMBulletKit，Lonza)和EGM-2試劑盒可用于內(nèi)皮細(xì)胞(如，EGM-2BulletKit，Lonza)。可使用根據(jù)所接種的內(nèi)皮細(xì)胞的類型定制的培養(yǎng)基(例如，通過增加或減少生長因子如VEGF)，如記載于例如BrudnoY等，Enhancingmicrovascularformationandvesselmaturationthroughtemporalcontrolovermultiplepro-angiogenicandpro-maturationfactors.Biomaterials34(2013)9201-9209。在內(nèi)皮細(xì)胞的情況中，一系列不同的培養(yǎng)基組合物可用于誘導(dǎo)細(xì)胞的接種、擴(kuò)增、移植和成熟等不同階段。例如，在第一階段，細(xì)胞接種構(gòu)建體可用‘血管生成培養(yǎng)基’灌注2-30天以增加內(nèi)皮細(xì)胞的擴(kuò)增、遷移和代謝。該培養(yǎng)基的特征在于高濃度的細(xì)胞因子，如5-100ng/ml的VEGF和5-100ng/ml的bFGF，并且存在通過活化蛋白激酶C來活化血管生成通路的肉豆蔻酸乙酸佛波醇酯(PMA)，例如5-100ng/mlPMA，和刺激內(nèi)皮細(xì)胞萌芽的Ang-1。在第二階段，細(xì)胞接種構(gòu)建體接著可用支持內(nèi)皮成熟和緊密連接形成的‘緊密化培養(yǎng)基’灌注。緊密化培養(yǎng)基具有較低水平的細(xì)胞因子，與血管生成培養(yǎng)基具有相同的基礎(chǔ)組成但VEGF、bFGF和PMA的水平低(0.1-5ng/mlVEGF、FGF和PMA)。促進(jìn)緊密連接形成并已示出減少肺水腫的氫化可的松可進(jìn)一步加入到緊密化培養(yǎng)基以促進(jìn)血管成熟。進(jìn)一步地，前成熟因子(promaturationfactors)如PDGF和Ang-2可添加到緊密化培養(yǎng)基以增強(qiáng)血管形成。可滴定這些因子的濃度以支持不同的血管大小。培養(yǎng)基的更改可逐步進(jìn)行以避免細(xì)胞因子突然改變的有害影響。類似于內(nèi)皮細(xì)胞支持培養(yǎng)基，順序的培養(yǎng)基改變可用于引導(dǎo)上皮細(xì)胞的命運(yùn)。初始培養(yǎng)基可含有例如10-200ng/ml的活化素A和0.01-1uM的Pi3K抑制劑如ZSTK474，以誘導(dǎo)明確的內(nèi)胚層，隨后01-10uM的TGF-β抑制劑如A-8301和0.05-1uM的BMP4拮抗劑如DMH-1以誘導(dǎo)前內(nèi)胚層，和最終的1-100ug/ml的BMP4、10-500ng/ml的FGF2、10-500nM的GSK-3β抑制劑如CHIR99021、1-100nM的PI3K抑制劑如PIK-75和1-100nM的甲氨蝶呤以誘導(dǎo)肺祖細(xì)胞生成?？梢允褂萌魏芜m用于分離并收集供接種用的細(xì)胞的方法。例如，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞一般可以通過轉(zhuǎn)錄因子諸如Oct4、Sox2、Klf4、c-MYC、Nanog、和Lin28的異位表達(dá)而從“重編程”為多能狀態(tài)的體細(xì)胞獲得。參見Takahashi等，Cell131:861–72(2007)；Park等，Nature451:141–146(2008)；Yu等，Science318:1917–20(2007)；Zhu等，CellStemCell.7:651-52010；和Li等，CellRes.21:196-204(2011)；Malik和Rao,MethodsMolBiol.2013；997:23-33；Okano等，CircRes.2013Feb1；112(3):523-33；Lin和Ying,MethodsMolBiol.2013；936:295-312。外周血來源的單核細(xì)胞可自患者的血液樣品分離并用于生成誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。在其它實(shí)例中，誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞可通過用優(yōu)化來用于Oct4,Sox2,Klf4,c-MYC連同如轉(zhuǎn)化生長因子β(SB431542)、MEK/ERK(PD0325901)和Rho-激酶信號傳導(dǎo)(Thiazovivin)等小分子的高共表達(dá)的構(gòu)建體來重編程而獲得。參見Groβ等，CurrMolMed.13:765-76(2013)和Hou等，Science341:651:654(2013)。用于自干細(xì)胞生成內(nèi)皮細(xì)胞的方法于Reed等，BrJClinPharmacol.2013Apr；75(4):897-906中綜述。臍帶血干細(xì)胞可以自新鮮的或冷凍的臍帶血分離。間充質(zhì)干細(xì)胞可以自例如粗制的未純化的骨髓或經(jīng)ficoll純化的骨髓分離?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域中已知的方法從活的或尸體的供體，例如從將接受生物人工肺的受試者分離并收集上皮和內(nèi)皮細(xì)胞。例如，上皮細(xì)胞可以自皮膚組織樣品(如鉆取活組織檢查)獲得，而內(nèi)皮細(xì)胞可以自血管組織樣品獲得。在一些實(shí)施方案中，經(jīng)由放在血管系統(tǒng)中的導(dǎo)管將蛋白水解酶灌注到組織樣品中。可以將經(jīng)酶處理的組織的一部分進(jìn)行進(jìn)一步的酶和機(jī)械破壞。可以分離以此方式獲得的細(xì)胞混合物以純化上皮和內(nèi)皮細(xì)胞。在一些情況中，基于流式細(xì)胞術(shù)的方法(例如，熒光激活的細(xì)胞分選)可用來基于特定細(xì)胞表面標(biāo)志物的存在或缺失而分選細(xì)胞。此外，肺細(xì)胞(上皮、間充質(zhì)和內(nèi)皮)可自肺活檢組織獲得，肺活檢組織可經(jīng)由經(jīng)支氣管的和支氣管內(nèi)的活組織檢查或經(jīng)由肺組織的外科活組織檢查得到。在使用非自體細(xì)胞的情況中，應(yīng)當(dāng)考慮選擇免疫類型匹配的細(xì)胞，使得器官或組織在植入受試者中時(shí)不會被排斥。可以將分離的細(xì)胞在緩沖溶液(例如，pH7.4的磷酸鹽緩沖鹽水)中漂洗，并在細(xì)胞培養(yǎng)基中重懸?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法來培養(yǎng)并擴(kuò)充細(xì)胞群。一旦獲得，細(xì)胞可用于接種組織基質(zhì)，例如經(jīng)由動脈或靜脈線(內(nèi)皮細(xì)胞)或通過氣道(氣管)線(表皮細(xì)胞)導(dǎo)入基質(zhì)。例如，可以以任何合適細(xì)胞密度在體外用至少一種細(xì)胞類型接種組織基質(zhì)。例如，用于接種基質(zhì)的細(xì)胞密度可以是至少1×103個細(xì)胞/克基質(zhì)?？梢允褂梅秶梢詾榧s1×105至約1×1010個細(xì)胞/克基質(zhì)(例如，至少100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000、1,000,000,000、或10,000,000,000個細(xì)胞/克基質(zhì))的細(xì)胞密度。在一些情況中，可以通過灌注接種以上文所描述的細(xì)胞類型和細(xì)胞密度接種如本文中所提供的去細(xì)胞化的或人工的肺組織基質(zhì)。例如，可以使用流動灌注系統(tǒng)經(jīng)由保留于組織基質(zhì)中的血管系統(tǒng)(例如通過氣管線)來接種去細(xì)胞化的肺組織基質(zhì)。在一些情況中，可以在合適的條件下使用自動化流動灌注系統(tǒng)。此類灌注接種方法可以改善接種效率，并且在整個復(fù)合物中提供更均勻分布的細(xì)胞?？梢允褂枚可锘瘜W(xué)和圖像分析技術(shù)來評估靜態(tài)或灌注接種方法后的接種細(xì)胞的分布。在一些情況中，可以給組織基質(zhì)注入一種或多種生長因子以刺激接種的再生細(xì)胞的分化。例如，可以給組織基質(zhì)注入適合于本文中所提供的方法和材料的生長因子，例如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、TGF-β生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(例如，BMP-1、BMP-4)、血小板衍生的生長因子(PDGF)、基礎(chǔ)成纖維細(xì)胞生長因子(b-FGF)例如FGF-10、胰島素樣生長因子(IGF)、表皮生長因子(EGF)、或生長分化因子-5(GDF-5)。參見例如Desai和Cardoso，Respir.Res.3：2(2002)?？砂膺@些生長因子以控制時(shí)間釋放。支架的不同部分可用不同的生長因子促進(jìn)，以添加生長因子刺激的空間控制。可以將接種的組織基質(zhì)在接種后溫育一段時(shí)間(例如從幾小時(shí)至約14天或更多)以改善細(xì)胞在組織基質(zhì)中的固定和滲透。可以在如下的條件下維持接種的組織基質(zhì)，其中至少一些再生細(xì)胞可以在無細(xì)胞組織基質(zhì)之內(nèi)和之上增殖和/或分化。此類條件可以包括但不限于合適的溫度(35-38攝氏度)和/或壓力(如大氣壓)、電和/或機(jī)械活動(例如，經(jīng)正壓或負(fù)壓通氣，其中正端呼氣壓為1-20cmH2O、平均氣道壓力為5-50cmH2O和峰吸氣壓力為5-65cmH2O)、合適量的流體，例如O2(1-100％FiO2)和/或CO2(0-10％FiCO2)、合適量的濕度(10-100％)、和無菌或接近無菌的條件。此類條件還可以包括濕式通氣、濕式至干式通氣和干式通氣。在一些情況中，可以將營養(yǎng)補(bǔ)充物(例如，營養(yǎng)物和/或碳源諸如葡萄糖)、外源激素、或生長因子添加到接種的組織基質(zhì)?？梢詫?shí)施組織學(xué)和細(xì)胞染色以測定接種細(xì)胞增殖?？梢詫?shí)施任何合適的方法來測定接種細(xì)胞分化。一般而言，本文中所描述的方法會在例如如本文中所描述的氣道器官生物反應(yīng)器裝置中實(shí)施。如此，可以使用本文中所描述的方法來生成可移植的生物人工肺組織，例如用于對人受試者移植。如本文中所描述的，可移植的組織會優(yōu)選地保留足夠完整的血管系統(tǒng)，其可以與患者的血管系統(tǒng)連接。本文中所描述的生物人工肺組織可以與包裝材料組合以生成制造品或試劑盒。用于生產(chǎn)制造品的組分和方法是公知的。在生物人工組織外，制造品或試劑盒可以進(jìn)一步包括例如一種或多種抗粘合劑、無菌水、藥用載體、緩沖液、和/或用于促進(jìn)體外和/或移植后功能性肺組織發(fā)育的其它試劑。另外，此類制造品中可以包含描述可如何使用其中含有的組合物的印刷的指南。制造品或試劑盒中的組分可包裝在多種合適的容器中。使用生物人工肺的方法本文件還提供了使用生物人工肺組織及在一些情況中促進(jìn)肺功能的方法和材料。在一些實(shí)施方案中，可以使用本文中所提供的方法來恢復(fù)患有損害或降低肺容量的疾病(例如，囊性纖維化病、COPD、肺氣腫、肺癌、哮喘、肺動脈高壓、肺創(chuàng)傷、或其它遺傳性或先天性肺異常，例如支氣管源性囊腫、肺發(fā)育不全和發(fā)育不良(pulmonaryagenesisandhypoplasia)、多肺泡葉、肺泡毛細(xì)管發(fā)育異常、隔離，包括動靜脈畸形(AVM)和彎刀綜合征(scimitarsyndrome)、肺淋巴管擴(kuò)張(pulmonarylymphangiectasis)、先天性肺葉性肺氣腫(CLE)、和囊性腺瘤樣畸形(CAM)和其它肺囊腫)的患者中的一些肺功能。本文中所提供的方法還包括如下那些，其中受試者鑒定為需要特定的規(guī)定治療，例如，升高的肺功能、或增加或改善的肺容量?？梢砸勒毡疚闹兴峁┑姆椒▉砩缮锶斯し谓M織(例如，整個器官或其一部分)。在一些實(shí)施方案中，該方法包括對有此需要的受試者(例如，人患者)移植如本文中所提供的生物人工肺組織。在一些實(shí)施方案中，對患病或損傷組織部位移植生物人工肺組織。例如，可以將生物人工肺組織移植入受試者的胸腔中，替換不發(fā)揮功能或發(fā)揮功能不良的肺(或與其一起)；用于實(shí)施肺移植的方法是本領(lǐng)域中已知的，參見例如Boasquevisque等，SurgicalTechniques:LungTransplantandLungVolumeReduction,ProceedingsoftheAmericanThoracicSociety6:66-78(2009)；Camargo等，Surgicalmaneuversforthemanagementofbronchialcomplicationsinlungtransplantation,EurJCardiothoracSurg2008；34:1206-1209(2008)；Yoshida等，“SurgicalTechniqueofExperimentalLungTransplantationinRabbits,”AnnThoracCardiovascSurg.11(1):7-11(2005)；Venuta等，EvolvingTechniquesandPerspectivesinLungTransplantation,TransplantationProceedings37(6):2682-2683(2005)；Yang和Conte,TransplantationProceedings32(7):1521-1522(2000)；Gaissert和Patterson,SurgicalTechniquesofSingleandBilateralLungTransplantationinTheTransplantationandReplacementofThoracicOrgans,第2版，SpringerNetherlands(1996)。所述方法可以包括在部分或完全除去受試者的肺的手術(shù)方法過程中和/或肺切除過程中移植如本文中所提供的生物人工肺或其一部分。該方法還可以包括自活的供體或尸體收集肺或其一部分并在本文中所述的生物反應(yīng)器中保存或再生肺。在一些情況中，可以使用本文中所提供的方法來替換或補(bǔ)充受試者例如人或動物受試者中的肺組織和功能?？梢詫?shí)施任何合適的方法來測定移植之前或之后的肺功能。例如，可以實(shí)施方法來評估組織愈合、評估功能性、及評估細(xì)胞向內(nèi)生長(in-growth)。在一些情況中，可以將組織的一部分收集，并用固定劑諸如例如中性緩沖福爾馬林處理?？梢詫⒋祟惤M織的一部分脫水，包埋在石蠟中，并用切片機(jī)切片以進(jìn)行組織學(xué)分析?？梢詫⑶衅锰K木精和伊紅(H&E)染色，然后安放于玻璃載玻片上以供形態(tài)學(xué)和細(xì)胞性的顯微評估。例如，可以實(shí)施組織學(xué)和細(xì)胞染色來檢測接種的細(xì)胞繁殖。測定法可以包括移植的組織基質(zhì)的功能性評估或成像技術(shù)(例如，計(jì)算機(jī)斷層攝影術(shù)(CT)、超聲、或磁共振成像(例如，對比度增強(qiáng)的MRI))。測定法可以進(jìn)一步包括在靜息和生理應(yīng)激下的功能性測試(例如，身體體積描記術(shù)(bodyplethysmography)、肺功能測試)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的方法，例如組織學(xué)、電子顯微術(shù)、和機(jī)械測試(例如體積和順從性的)來測定用細(xì)胞接種的基質(zhì)的功能性。氣體交換可以作為另一種功能性測定法測量。為了測定細(xì)胞增殖，可以例如通過檢測胸苷摻入來測量胸苷激酶活性。在一些情況中，基于血液中的氧水平，可以實(shí)施血液測試來評估肺功能。為了促進(jìn)培養(yǎng)期間的功能測定，本文所述的生物反應(yīng)器裝置的任何線可包括取樣口以允許功能參數(shù)(如pH、葡萄糖、乳酸鹽、Na、K、Ca、Cl、碳酸氫鹽(bicarb)、O2、CO2、sat)的單一或?qū)崟r(shí)測量。還可使用比色測定將代謝物用于監(jiān)控細(xì)胞數(shù)和活力，并且生物化學(xué)測定可用于檢測細(xì)胞成熟(如，測量表面活性蛋白等)。例如，增加的表面活性蛋白濃度可指示培養(yǎng)肺具有足以抵抗干式通氣的表皮細(xì)胞。在一些情況中，內(nèi)皮屏障功能可用作血管成熟的標(biāo)志物。肺可用不同大小的分子(如大小限定的右旋糖酐以及白蛋白)、微珠(大小從0.2到5um增加)、以及分離的紅細(xì)胞灌注。之后可取樣支氣管肺泡灌洗液來評價(jià)這些標(biāo)志物向肺泡腔的滲漏。例如，500-kDa的右旋糖酐可與支氣管肺泡灌洗測定組合使用來確定保留在血管腔隙內(nèi)的右旋糖酐的百分率。右旋糖酐保留的百分率的增加指示屏障功能的提高，這是因?yàn)閷τ倚囚钠琳瞎δ苋Q于有活力的且功能性的內(nèi)皮，而右旋糖酐將在連續(xù)灌注期間經(jīng)時(shí)穿過裸露的血管基底膜(如在非細(xì)胞肺中)而擴(kuò)散。例如，尸體的肺可將基本上所有的右旋糖酐保留在血管腔隙內(nèi)，而無細(xì)胞肺可保留小百分比的右旋糖酐(如，10.0％±8.0％)。這些標(biāo)志物向肺泡腔的高于耐受最小值(例如>10％的4um微珠，或大于20％的0.2um微珠)的滲漏可用于指示肺的成熟不足以抵抗干式通氣。在一些情況中，可以使用分子生物學(xué)技術(shù)諸如RT-PCR來定量代謝(如表面活性蛋白，粘蛋白-1)和分化標(biāo)志物(如TTF-1、p63、表面活性蛋白C)的表達(dá)。可以使用任何合適的RT-PCR方案。簡言之，可以如下收集總RNA，即將生物學(xué)樣品(例如腱樣品)均質(zhì)化，實(shí)施氯仿提取，并使用旋轉(zhuǎn)柱(例如，微量旋轉(zhuǎn)柱(QIAGEN，Valencia，CA))或其它核酸結(jié)合基質(zhì)來提取總RNA。在其它情況中，與肺細(xì)胞類型和此類細(xì)胞類型的不同分化階段有關(guān)的標(biāo)志物可用抗體和標(biāo)準(zhǔn)的免疫測定法來檢測。氣道器官生物反應(yīng)器裝置示例性氣道器官生物反應(yīng)器示于圖1。貫穿整個說明書，肺會作為氣道器官的例子提供。其它例子可以包括含層級血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的肺的一部分，如肺葉或肺段。能夠支持自活的供體或尸體收集的肺的示例性生物反應(yīng)器示于圖8和9。本文所述的任何生物反應(yīng)器可以配置為允許以仰臥位培養(yǎng)肺。參考圖1，生物反應(yīng)器100的組件包括肺室101、培養(yǎng)器室102、動脈灌注泵103、動脈壓104、動脈線105、靜脈線106、氣管線107、過濾器108、氧合器109、輸出線112、控制模塊110、靜脈閥111、動脈流傳感器114、靜脈灌注泵116、靜脈壓力傳感器118、靜脈流傳感器120和氣管閥122。至少將肺室101封閉在培養(yǎng)器室102內(nèi)以維持適合的溫度和濕度。生物反應(yīng)器100允許通過肺動脈、肺靜脈或其它合適的通道用氧合培養(yǎng)基恒壓灌注(以氧合培養(yǎng)基)。肺室101容納肺(未示出)。肺的肺動脈連接至肺動脈線105，肺的肺靜脈連接至靜脈線106，肺的氣管連接至氣管線107。生物反應(yīng)器100為中壓(neutralpressure)通氣系統(tǒng)，這是因?yàn)闊o菌過濾器108以培養(yǎng)器室102的壓力平衡肺室101中的壓力，同時(shí)也以培養(yǎng)器的壓力平衡氣管線107，這是因?yàn)闅夤荛y122一般是打開的。在肺室101內(nèi)，用細(xì)胞和培養(yǎng)基順行灌注細(xì)胞基質(zhì)以容許接種細(xì)胞，從而在肺基質(zhì)中生長。灌注通過肺動脈線105對肺動脈進(jìn)行和通過靜脈線對肺靜脈進(jìn)行，而氣管閥122保持打開。該配置允許細(xì)胞和培養(yǎng)基從動脈側(cè)和靜脈側(cè)二側(cè)到達(dá)毛細(xì)血管床并允許培養(yǎng)基通過無細(xì)胞基底膜擴(kuò)散和經(jīng)由氣管或跨過胸膜離開基質(zhì)。動脈流傳感器114和靜脈流傳感器120為能夠測量這些線的流速的傳感器(如跨聲速流探針)。流速傳感器可并入本文所述的任意生物反應(yīng)器內(nèi)的任意流體線(如任意輸入或輸出線、動脈線、靜脈線、氣管線或氧氣交換線)。在特定實(shí)施方案中，流速還可基于管線的直徑和相關(guān)泵的速度計(jì)算。細(xì)胞和/或培養(yǎng)基通過肺血管流經(jīng)動脈線104和靜脈線107。為了再循環(huán)，培養(yǎng)基流經(jīng)氧合器109。氧合的培養(yǎng)基接著流向動脈灌注泵103或靜脈灌注泵116，使培養(yǎng)基通過生物反應(yīng)器100循環(huán)。該泵受控制模塊110的控制，控制模塊110基于分別自動脈壓力傳感器104和靜脈壓力傳感器118的壓力讀數(shù)來控制灌注泵104的速度和靜脈泵116的速度。動脈和靜脈灌注壓可基于細(xì)胞的大小和數(shù)量來改變，從而優(yōu)化細(xì)胞傳遞?？刂颇K110還能夠讀取數(shù)據(jù)(如來自動脈壓力傳感器104和靜脈壓力傳感器118的阻力讀數(shù))。培養(yǎng)基完成回路，回到動脈線104和/或靜脈線106。在最初的順行接種期間，培養(yǎng)基在其到達(dá)毛細(xì)血管床之前或當(dāng)其到達(dá)毛細(xì)血管床時(shí)擴(kuò)散通過肺基質(zhì)。為了引導(dǎo)培養(yǎng)基通過支架，氣管閥122可打開或關(guān)閉以調(diào)整肺內(nèi)的壓力，從而引導(dǎo)培養(yǎng)基通過支架。在一些情況中，可使用逆行接種。在這些情況中，細(xì)胞和/或培養(yǎng)基流經(jīng)靜脈線107，氧合的培養(yǎng)基流向靜脈灌注泵116，使培養(yǎng)基經(jīng)過生物反應(yīng)器100循環(huán)。如同順行接種，為了引導(dǎo)培養(yǎng)基通過支架，氣管閥122可打開或關(guān)閉以改變肺內(nèi)的壓力，由此引導(dǎo)培養(yǎng)基通過支架。在肺的血管系統(tǒng)阻力之后，基質(zhì)足以抵抗生理?xiàng)l件(如，由于肺基質(zhì)的再內(nèi)皮化而使血管阻力增加)，生物反應(yīng)器100轉(zhuǎn)換成順行灌注。血管系統(tǒng)阻力通過動脈壓力傳感器104經(jīng)時(shí)測量。隨著血管系統(tǒng)的占據(jù)，穿過血管膜的擴(kuò)散減少，引起動脈傳感器104測量的壓力增加(即，血管阻力的增加)。在一些實(shí)例中，顆粒通過生物反應(yīng)器100灌注，監(jiān)控它們的進(jìn)程以確定穿過血管膜的擴(kuò)散速率。參考圖2，生物反應(yīng)器200的組件包括肺室201、培養(yǎng)器室202、培養(yǎng)基儲池203、動脈灌注泵204、排泄泵205、動脈壓力傳感器206、室壓傳感器207、氣管壓力傳感器208、靜脈壓力傳感器209、動脈線210、靜脈線211、氣管線212、過濾器213、氧合器214、控制模塊215和靜脈閥216、氣管閥212和輸出線217。肺室201封閉在培養(yǎng)器室202內(nèi)以維持適合的溫度和濕度。仍參考圖2，生物反應(yīng)器200組合流動灌注系統(tǒng)和負(fù)壓通氣。肺基質(zhì)置于肺室202。流動灌注系統(tǒng)使用連接至肺的肺動脈的動脈線210。培養(yǎng)基從培養(yǎng)基儲池203吸出并穿過氧合器214。氧合器214將例如來自入口點(diǎn)218和出口點(diǎn)219的空氣與培養(yǎng)器室202周圍的環(huán)境交換。在通過氧合器214后，動脈壓力傳感器206記錄動脈壓并將該數(shù)據(jù)傳輸至控制模塊215。動脈壓讀數(shù)接著調(diào)整將培養(yǎng)基從儲池泵向肺動脈的滾子泵(rollerpump)。接著培養(yǎng)基通過輸出線217循環(huán)出肺室201并使用排泄泵205泵入培養(yǎng)基儲池203。排泄泵205為雙向的且可用于在培養(yǎng)基儲池203至肺室201之間循環(huán)培養(yǎng)基。該再循環(huán)還輔助維持肺室201中正確的pH。控制模塊215基于由室壓傳感器207記錄的壓力讀數(shù)控制排泄泵205的例如速度和/或方向。由于肺室201中室壓的波動，液體流入和流出氣管線212。由于靜脈線211開向培養(yǎng)基儲池203，靜脈壓向室壓平衡，從而防止可引起流體從動脈流向組織的經(jīng)肺壓力梯度。通過監(jiān)控室壓并相應(yīng)地泵送，可以維持肺室201中的培養(yǎng)基水平。在負(fù)壓濕式通氣期間，流體進(jìn)出肺基質(zhì)引起肺室201中的壓力波動。該波動還使肺基質(zhì)擴(kuò)張和收縮。該擴(kuò)張引起反復(fù)的流體移動進(jìn)出氣管以及流體通過肺基質(zhì)(如，通過肺靜脈和淋巴管)轉(zhuǎn)移至肺室201中。這些流體轉(zhuǎn)移可以在整個培養(yǎng)期變化并可導(dǎo)致不穩(wěn)定的培養(yǎng)條件、不期望的室壓增加、培養(yǎng)基溢出、負(fù)壓通氣失敗、和肺或肺移植物損傷。用室壓傳感器207監(jiān)控肺室201壓力使得控制模塊215通過適當(dāng)調(diào)整排泄泵205的方向和持續(xù)時(shí)間來校正這些流體轉(zhuǎn)移。例如，由于肺室201中的培養(yǎng)基體積的增加，壓力的增加由室壓傳感器207感知。該數(shù)據(jù)傳輸至控制模塊215，激活灌注泵205足夠時(shí)間以將過量的培養(yǎng)基從肺室201回流到培養(yǎng)基儲池203直至恢復(fù)期望的壓力。如圖2所示，生物反應(yīng)器200還包括氣管壓力傳感器208和靜脈壓力傳感器209。氣管壓力傳感器208測量氣道(如氣管)內(nèi)的壓力。氣管線212通過氣管閥221連接至培養(yǎng)基儲池203，且氣管線212內(nèi)的壓力與培養(yǎng)基儲池203內(nèi)的壓力平衡。為了將氣道壓力限定到生理范圍，可升高培養(yǎng)基儲池203的高度以調(diào)整生成的氣道正壓。由于室壓降低，氣管壓力也將在較小程度上降低。生物反應(yīng)器200還可使用靜脈壓力傳感器209來主動監(jiān)控靜脈線212與培養(yǎng)基儲池203之間的培養(yǎng)基交換速率。靜脈在加載到系統(tǒng)中后當(dāng)閥216關(guān)閉時(shí)由儲池的水平控制，或者如果其為開啟位置則由可附接至靜脈閥216的阻力閥控制。例如，靜脈瓣216通常為開啟位置。低壓讀數(shù)(如<-5mmHg)可觸發(fā)靜脈瓣216關(guān)閉(如，自動或由操作者)，由此提供更多的靜脈背壓以防止毛細(xì)管后血管塌陷。如果壓力讀數(shù)高(如>20mmHg)，靜脈瓣216可打開以降低靜脈后負(fù)荷并使得向胞間隙和氣道中的流體轉(zhuǎn)移最小化。仍參考圖2，培養(yǎng)基室203中的壓力通過無菌過濾器213與周圍環(huán)境(如，培養(yǎng)器室)平衡。該交換還允許培養(yǎng)器室202與培養(yǎng)基儲池203之間的氣體(如二氧化碳)交換，這有助于維持系統(tǒng)中培養(yǎng)基的適當(dāng)?shù)膒H值。培養(yǎng)基儲池203的高度可相對于肺室201的高度調(diào)整。這引起濕式呼吸正壓并影響與肺相關(guān)的氣管氣道壓力。例如，培養(yǎng)基儲池203設(shè)定在浸于培養(yǎng)基中的肺的上方4cm。這引起氣道正壓。一般而言，由本文所述的任意傳感器記錄的壓力處于取決于所培養(yǎng)的器官的生理范圍內(nèi)。例如，動脈范圍可為平均10-35mmHg，肺室201可為平均-40至40mmHg。參考圖3，正壓歧管300包括氣管線304、蓄壓器(pressurereservoir,PR)302、泄壓閥(pressurereleasevalve,prv)301、壓縮器(compressor,comp)303(如壓縮氣源)、可充脹的呼吸袋(breathingbag,BB)306、和歧管壓力傳感器308。氣管線304連接至肺的氣道(未示出)。壓縮器303向蓄壓器303提供正壓，蓄壓器302中的壓力水平可通過泄壓閥301調(diào)整(如，可減少壓力)。在特定的實(shí)施方案中，正壓歧管300為主動調(diào)整蓄壓器302中的壓力來應(yīng)答氣道中吸氣和呼氣相關(guān)的壓力變化(如，由氣管壓力傳感器408或由歧管壓力傳感器308記錄的)的計(jì)算機(jī)化系統(tǒng)?？沙涿浀暮粑?06附接至蓄壓器302以適應(yīng)吸氣和呼氣期間突然的體積變化，同時(shí)保持室、氣管和肺中的壓力恒定?？沙涿浀暮粑?06的體積可根據(jù)待培養(yǎng)的肺的大小而變化。例如，可充脹的袋306的體積可為250cc至4000cc之間、至少250cc，小于4000cc、300cc至3500cc之間、400cc至3000cc之間、500cc至2500cc之間、600cc至2000cc之間、700cc至1500cc之間、和800cc至1000cc之間?？沙涿浀暮粑?06的材料為任何撓性的、不透氣的且無菌的材料(如，乳膠或橡膠)。歧管壓力傳感器308既幫助監(jiān)控呼氣末壓力也實(shí)現(xiàn)在通氣線中的流計(jì)算。參考圖3a，如上所述，正壓歧管320包括氣管線304、蓄壓器(pressurereservoir,PR)302、泄壓閥(pressurereleasevalve,prv)301、壓縮器(compressor,comp)303(如，壓縮氣源)、可充脹的呼吸袋(breathingbag,BB)306、和歧管壓力傳感器308。正壓歧管320還包括吸氣閥(inspiratoryvalve,iv)330、呼氣閥(expiratoryvalve,ev)332和呼氣泄壓閥334。氣管線304連接至肺的氣道(未示出)。如參考圖3所述，壓縮器326向蓄壓器302提供正壓，蓄壓器302中的壓力水平可通過泄壓閥324調(diào)整(如，可減少壓力)。氣管線328也連接至吸氣閥330和呼氣閥332。吸氣閥330和呼氣閥是允許流體如空氣以一個方向流動并防止回流的單向閥。在呼氣階段，空氣通過呼氣閥332和呼氣壓力閥334從氣管線流動至排氣管(未示出)。由于吸氣閥330，排出液并沒有進(jìn)入蓄壓器302。在吸氣階段，空氣通過吸氣閥330從蓄壓器經(jīng)由氣管線304流動至肺的氣道。呼氣泄壓閥324確保呼氣線在吸氣階段時(shí)保持正壓，從而防止空氣在吸氣階段時(shí)流過呼氣線。參考圖4，生物反應(yīng)器400的組件包括肺室401、培養(yǎng)器室402、培養(yǎng)基儲池403、動脈灌注泵404、排泄泵405、動脈壓力傳感器406、室壓傳感器407、氣管壓力傳感器408、靜脈壓力傳感器409、動脈線410、靜脈線411、氣管線412、無菌過濾器413、氧合器414、控制模塊415、靜脈閥416和正壓歧管300。生物反應(yīng)器400除了灌注系統(tǒng)以外包括負(fù)壓干式(例如使用空氣)通氣，且除了正壓模塊以外通常如上所述參照生物反應(yīng)器200配置。肺室401中的壓力是可變的以充脹或收縮肺基質(zhì)。在吸氣階段，肺室401內(nèi)的壓力降至低于氣道壓力，從而造成氣道負(fù)壓。該負(fù)壓引起流體從血管系統(tǒng)向組織轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致間質(zhì)性水腫和氣道分泌增多。氣管線412和附連的管的阻力加劇了這些流體轉(zhuǎn)移。在呼氣階段，肺室401內(nèi)的壓力增加，從而造成氣道正壓。如果氣管對大氣壓開放或連接到中性壓力，近側(cè)的氣道將受到室壓的壓縮并塌縮，導(dǎo)致末端氣道和肺泡內(nèi)空氣滯留以及對肺基質(zhì)的損害。如上所述，正壓歧管300通過具有適合的大小如大約肺的10×潮氣體積使吸氣和呼氣期間的壓力波動最小化?？刂颇K415激活壓縮器303或泄壓閥301，如上所述維持蓄壓器203中的恒壓，壓力在吸氣和呼氣階段通過氣管線412傳輸?shù)綒夤堋ｎ愃朴谏锓磻?yīng)器200，培養(yǎng)基通過灌注泵405在肺室401和培養(yǎng)基儲池403之間更新。動脈壓力傳感器406與雙向動脈灌注泵405之間的組合用于維持肺室401中適合的壓力和/或培養(yǎng)基流體水平(如上所述)。參考圖5，生物反應(yīng)器500的組件包括肺室501、培養(yǎng)器室502、培養(yǎng)基儲池503、動脈灌注泵504、排泄泵505、濕式通氣泵506、動脈壓力傳感器507、室壓傳感器508、氣管壓力傳感器509、靜脈壓力傳感器510、動脈線511、靜脈線512、氣管線513、無菌過濾器514、氧合器515、控制模塊516和靜脈閥517。肺室501容納肺基質(zhì)(未示出)。類似于生物反應(yīng)器100、200和400，肺的肺動脈連接至動脈線511，肺的肺靜脈連接至靜脈線512，肺的氣管連接至氣管線513。除了生物反應(yīng)器200的特征以外，生物反應(yīng)器500還包括連接至氣管線513的濕式通氣泵506。濕式通氣泵506使得能夠正壓流體通氣。濕式通氣泵506從培養(yǎng)基儲池503抽出新鮮培養(yǎng)基并通過氣管線513泵送培養(yǎng)基，從而用流體(如培養(yǎng)基)使肺充脹。濕式通氣泵506為雙向的并從氣管線吸入流體從而使肺收縮。由于濕式通氣泵直接從培養(yǎng)基儲池503抽取，肺基質(zhì)不斷由新鮮的培養(yǎng)基充脹?？刂颇K516基于由氣管壓力傳感器509傳輸?shù)膲毫ψx數(shù)控制濕式通氣泵506的操作(如，持續(xù)時(shí)間、方向和速度)。例如，在吸氣期間施加5至45cmH2O的吸氣正壓，而在呼氣期間施加5-15cmH2O的呼氣壓。在濕式通氣和干式通氣模式中，通氣可以是壓力控制的(PC)或體積控制的(VC)。在壓力控制模式中，泵以確定的速率提供確定的吸氣壓和確定的呼氣壓達(dá)確定的一段時(shí)間(吸氣時(shí)間,呼氣時(shí)間)，并有正壓、中性壓力和負(fù)壓平臺期的可能性。在體積控制通氣模式中，泵生成確定的吸氣壓直至已吸入一定體積，接著保持確定的平臺期，然后生成呼氣壓直至呼出一定體積，或者直至已達(dá)到某一確定的目標(biāo)壓力，接著泵可保持在中性壓力或確定的呼出平臺壓力下。體積變動可通過流量計(jì)的變化(如，基于熱、基于壓差或超聲波)測量。這些流量計(jì)必須接近肺室連接至氣管線以提供最精確的流測定。如關(guān)于生物反應(yīng)器200所述，從肺組織向圖室501的任何流體轉(zhuǎn)移使用雙向排泄泵505自動回流至培養(yǎng)基儲池503。控制模塊516基于從室壓傳感器508收集的數(shù)據(jù)激活排泄泵505。參考圖6，生物反應(yīng)器600的組件包括肺室601、培養(yǎng)器室602、培養(yǎng)基儲池603、動脈灌注泵604、排泄泵605、動脈壓力傳感器606、室壓傳感器607、氣管壓力傳感器608、靜脈壓力傳感器609、動脈線610、靜脈線611、氣管線612、無菌過濾器613、氧合器614、控制模塊615、閥控制靜脈排出器616和通氣器617。如上文關(guān)于生物反應(yīng)器100、200、400和500討論的，在生物反應(yīng)器中，肺基質(zhì)通過動脈線灌注培養(yǎng)基。仍參考圖6，生物反應(yīng)器600包括通氣器617，使得能夠正壓干式通氣。通氣器617為雙向的并通過氣管線612將氣體(如空氣)泵入和泵出肺基質(zhì)。該氣體運(yùn)動引起肺基質(zhì)以類似于典型的肺功能的方式充脹和收縮。生物反應(yīng)器600可在器官培養(yǎng)末期時(shí)用于再生肺移植物和肺的功能性試驗(yàn)。例如，氣管線可包括至少一個端口用于試驗(yàn)氣管壓力傳感器608與通氣器617之間的通氣動態(tài)。氣管線還可包括允許使用者使用肺移植物的支氣管鏡評價(jià)用的系統(tǒng)而不污染系統(tǒng)的一個或多個端口。各輸入或輸出線還可含有至少一個幫助血?dú)夥治龅亩丝谝詭椭鷮?shí)時(shí)氧氣測定。參考圖7,氣壓控制模塊700包括入口壓力閥703、入口蓄壓器(pressurereservoir,PR)705、入口壓縮器(compressor,comp)701、入口線707、出口壓力閥704、出口蓄壓器706、出口壓縮器702、出口線和PPC控制器709。入口線707和出口線708連接至包括室壓傳感器710的肺室712(如上所述)。入口和出口壓縮器701、702用氣體(如空氣)裝載入口和出口蓄壓器705、706。入口和出口壓力閥703、704(如螺線管閥)以及入口和出口壓縮器701、702受PPC控制器709控制。在吸氣階段，出口閥704打開并向移植室712中生成負(fù)壓。一旦由室壓傳感器710記錄到目標(biāo)負(fù)壓(如-20cmH2O)，出口閥704關(guān)閉。在吸氣和呼氣期間室壓可在-50至+100cmH2O的范圍內(nèi)。一旦達(dá)到正常肺的肺順應(yīng)性，室壓更接近地模擬胸膜內(nèi)壓的生理范圍(如，-10至+25cmH2O)。在適合的平臺期后，呼氣階段開始，其中入口壓力閥703打開并允許肺室712內(nèi)部生成正壓。一旦由室壓傳感器710記錄到目標(biāo)正壓(如25cmH2O)，入口閥703關(guān)閉。入口和出口蓄壓器705、706大小適當(dāng)以使得能夠快速調(diào)整肺室712中的壓力。入口和出口蓄壓器防止和/或減少由入口或出口壓縮器701、702生成的振動偽影(vibrationartifacts)。在一些實(shí)施方案中，壓力平衡的斜率可通過置于入口線707和/或出口線708中的附加阻力閥(未示出)來調(diào)整。如上所述，通氣可為壓力控制(PC)或體積控制(VC)。參考圖8，生物反應(yīng)器800的組件包括肺室801、培養(yǎng)器室802、培養(yǎng)基儲池803、動脈灌注泵804、排泄泵805、動脈壓力傳感器806、室壓傳感器807、氣管壓力傳感器808、靜脈壓力傳感器809、動脈線810、靜脈線811、氣管線812、過濾器813、氧合器814、控制模塊815、靜脈閥816和PPC模塊700。生物反應(yīng)器800通常如關(guān)于生物反應(yīng)器200所述進(jìn)行配置并添加PPC模塊700。肺室801中的壓力通過PPC模塊700調(diào)節(jié)(如上所述)。該配置允許負(fù)壓通氣而沒有大量進(jìn)出肺室801的流體轉(zhuǎn)移。排泄泵維持室801中恒定的流體水平，而吸氣期間的負(fù)壓和呼氣期間的正壓由PPC模塊700完成。通過用PPC模塊700替換正負(fù)通氣源，整個培養(yǎng)過程中的培養(yǎng)基的發(fā)泡、由于湍流造成的圖損傷和設(shè)備故障得以防止和/或減少。此外，生物反應(yīng)器800容易適應(yīng)不同的肺基質(zhì)大小(如，成人肺、兒童肺、或任何動物(如哺乳動物)肺)，這是由于PPC模塊700能夠達(dá)到不同的生理呼吸率。如上所述，在濕式通氣期間，相對于肺室801的高度而增加培養(yǎng)基儲池803的高度，由此引起通過氣管線的液體靜壓，來維持氣道正壓。參考圖9，生物反應(yīng)器900的組件包括肺室901、培養(yǎng)器室902、培養(yǎng)基儲池903、動脈灌注泵904、排泄泵905、動脈壓力傳感器906、室壓傳感器907、氣管壓力傳感器908、靜脈壓力傳感器909、動脈線910、靜脈線911、氣管線912、過濾器913、氧合器914、控制模塊915、靜脈閥916、平衡線918、過濾器限流器(occluder)917、PPC模塊700和正壓歧管300。生物反應(yīng)器900的組件除了添加連接至氣管線911的正壓歧管300以外一般如關(guān)于生物反應(yīng)器800所述進(jìn)行配置。該配置使得生物反應(yīng)器900能夠如關(guān)于生物反應(yīng)器800所述生成負(fù)壓通氣，并在吸氣和呼氣的整個過程中生成和維持氣道正壓(通過氣管線911)。生物反應(yīng)器900還配置為適應(yīng)大基質(zhì)尺寸(如，成人肺和兒童肺)并由于添加平衡線918和限流器917而適用于長期培養(yǎng)。在常規(guī)條件(如室內(nèi)空氣、自發(fā)通氣)下的人體中，常規(guī)測量為：來自氣管/氣道的凈壓力“pt”≈0cmH2O；胸膜間腔壓力(interpleuralspacepressure)“pp”≈-5—8cmH2O；動脈壓“pa”≈13mmHg；靜脈壓“pv”≈6mmHg(平均pv9.5mmHg)；和間隙壓力pi≈-5mmHg。使用斯塔林方程(Starlingequation，參見GrangerHJ,LaineGA等。Dynamicsandcontroloftransmicrovascularfluidexchange.StaubNC,TaylorAE編輯。Edema.NewYork:RavenPress；1984.p.189–228)，計(jì)算可證實(shí)肺經(jīng)歷了間隙和淋巴負(fù)壓，這可促進(jìn)淋巴引流。例如，使用下列等式：Jv＝LS[(Pmv-Ppmv)-σ(∏mv-∏is)]，其中LS≈0.2mL/min/100g/mmHg(Kf或流濾過系數(shù)，測量對流體的滲透性和血管表面積)；Pmv≈5至10mmHg(微血管(≈毛細(xì)管)液體靜壓)；Ppmv≈-5至7mmHg(周圍微血管或間隙液體靜壓)；σ≈0.5至0.8(滲透反射系數(shù)，確定跨血管系統(tǒng)的膨脹壓梯度對凈驅(qū)動壓的相對貢獻(xiàn)，測量規(guī)定膜(如內(nèi)皮)對特定溶質(zhì)(如白蛋白)的滲透性，在膜全透時(shí)的0與全不透時(shí)的1之間變化)；Πmv≈24mmHg(肺的微血管系統(tǒng)中血液的膨脹壓)；和Πpmv≈14mmHg(周圍微血管小間隙中的膨脹壓)，所得外在壓力≈1.5-2mmHg，大約10-20cc/min的凈流體流入胞間隙。來自氣管/氣道(pt)和來自胸膜間腔(pp)的凈壓為-5mmHg，結(jié)果間隙和淋巴負(fù)壓促進(jìn)淋巴引流。呼吸期間整個肺實(shí)質(zhì)的凈負(fù)壓及其波動以及肺組織的拉伸組合起到將間隙液排出的泵的作用，如例如BhattacharyaJ等，Lungexpansionandtheperialveolarinterstitialpressuregradient.JApplPhysiol1989；66:2600-5中所討論的。因此，增加的自發(fā)通氣導(dǎo)致增加的淋巴流動，如例如AlbeldaSM等，EffectsofincreasedventilationonLunglymphflowinunanesthetizedsheep.JApplPhysiol(1985).1986Jun；60(6):2063-70所述。在用于肺評價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)間接體外肺灌注(EVLP)方案中，將值設(shè)為：pt≈7.5cmH2O，pp為0mmHg，pa≈13mmHg，pv≈6mmHg(平均pv9.5mmHg)。應(yīng)用如上所述的等式，在理想環(huán)境下(假定灌注液的生理膨脹壓和滲透反射系數(shù))流向胞間隙的凈流體流量大約為10-20cc/分鐘。在該設(shè)定下，肺被分離并因而缺乏通常由胸壁施加的生理對壓、胸膜間腔壓力和間隙壓力的波動、以及所產(chǎn)生的雙向跨肺梯度。隨著時(shí)間流逝，這導(dǎo)致靜水性間質(zhì)性肺水腫和最終的肺泡水腫和器官衰竭。這已作為回路誘導(dǎo)的肺損傷記述于例如ErasmusME等中，Normothermicexvivolungperfusionofnon-heart-beatingdonorlungsinpigs:frompretransplantfunctionanalysistowardsa6-hmachinepreservation.TransplInt2006；19:589–593。參考圖9，肺室901和培養(yǎng)基儲池903之間的壓力平衡線918和過濾器913上的限流器917平衡肺室901和培養(yǎng)基儲池903之間的壓力。這確保在呼吸循環(huán)的所有階段兩個室之間的壓力相等。該調(diào)整可適用于本文所述的所有生物反應(yīng)器，小型動物和大型動物/人二者，并可用于正負(fù)壓通氣模式和濕干式通氣模式。該壓力平衡的引入，線918使得能夠建立雙向跨肺梯度。換言之，肺可從內(nèi)部經(jīng)Ppm300壓縮(從而建立氣道正壓)，并從外部經(jīng)PPC模塊700壓縮(從而建立室正壓)。該雙向跨肺梯度的目的在于防止長期分離肺培養(yǎng)上間質(zhì)性水腫，并通過將間隙液推入血管系統(tǒng)來治療(例如在之前損傷的肺中)已經(jīng)形成的水腫，因而改善肺功能(如，順應(yīng)性、擴(kuò)散性、重量和大小)。如果靜脈壓可相對于室壓調(diào)整則可達(dá)到該梯度。通過調(diào)整培養(yǎng)基儲池903的高度，進(jìn)而調(diào)整靜脈插管中水柱的高度并引流肺靜脈回流至培養(yǎng)基室903，靜脈壓904可保持在高于或低于室壓的恒定水平。基本上，兩個室之間的平衡允許負(fù)壓通氣期間恒定的肺靜脈。相反，如果不維持平衡且Pv保持恒定，則肺室901中的負(fù)壓將導(dǎo)致靜脈流中降低的靜脈引流或反轉(zhuǎn)(如部分或完全)，而肺室901中的正壓將使肺靜脈塌陷，導(dǎo)致流出阻塞。本發(fā)明會在以下實(shí)施例中進(jìn)一步描述，所述實(shí)施例并不限制權(quán)利要求書中所描述的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1–基于無細(xì)胞肺支架和人源肺祖細(xì)胞的肺再生背景：已如下所述使用胚胎上皮細(xì)胞生成肺移植物，例如OttHC等，Regenerationandorthotopictransplantationofabioartificiallung.NatMed.2010Aug；16(8):927-33和SongJJ等，Enhancedinvivofunctionofbioartificiallungsinrats.AnnThoracSurg.2011Sep；92(3):998-1005。為了將該項(xiàng)技術(shù)轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用，應(yīng)使用患者來源的細(xì)胞。這些細(xì)胞可源自朝向表型預(yù)先分化的源自IPS的細(xì)胞。方法：從成年路易斯大鼠整塊(enblock)收集含心臟和氣管的大鼠肺。供體器官通過0.1％十二烷基硫酸鈉(“SDS”)灌注和隨后的經(jīng)肺動脈鹽水洗滌來去細(xì)胞化。然后將所得肺支架安裝在如上所述的圖2中的能夠負(fù)壓濕式通氣的生物反應(yīng)器中。將3千萬個人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞和1億個處在定形內(nèi)胚層階段的預(yù)先分化的人iPS細(xì)胞(經(jīng)皮膚成纖維細(xì)胞重編程衍生的BJRiPS細(xì)胞)分別經(jīng)由肺動脈和氣管同時(shí)遞送。接著將肺移植物安裝在生物反應(yīng)器中并在靜態(tài)器官培養(yǎng)下維持2小時(shí)使得細(xì)胞能夠移植。接著以3mL/分鐘的速率開始培養(yǎng)基灌注。濕式通氣以移植室中-20至+10厘米H2O范圍內(nèi)的壓力和8cmH2O的連續(xù)濕式氣道正壓開始。這些條件下的培養(yǎng)維持總計(jì)10天。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，使用以35cmH2O的峰吸入壓、5cmH2O的吸入正壓、以及100％和21％的FiO2的正壓通氣來使肺通氣。從靜脈線中取出血?dú)鈽悠?。接著從生物反?yīng)器收集肺移植物。右肺用于組織學(xué)生化和遺傳組織分析。左肺用作肺移植物并正位移植到大鼠模型中。結(jié)果：觀察內(nèi)皮和預(yù)先分化的IPS細(xì)胞的細(xì)胞移植。細(xì)胞活力通過TUNEL染色證實(shí)并發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)超過75％。氣體交換在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)通過血?dú)夥治鲎C實(shí)。在所有的再生移植物中完成了左肺成功的手術(shù)移植。實(shí)施例2-通過灌注和負(fù)壓通氣的肺保存：大鼠肺模型背景：供體肺目前以冷缺血狀態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)。已努力在正常的熱灌注和通氣期間體外保存肺。目前最先進(jìn)的設(shè)備也不允許維持具有良好活力的供體器官超過6至48小時(shí)。組織水腫和機(jī)械性損傷導(dǎo)致在此期間組織損傷和移植失敗。所有目前可用的系統(tǒng)都使用正壓干式通氣，這在缺乏保護(hù)性胸壁下導(dǎo)致肺移植物的機(jī)械性損傷。我們設(shè)計(jì)了負(fù)壓濕干式通氣生物反應(yīng)器并檢查能夠長期(>7天)維持有活力的肺組織的能力。方法：將3個月大的SD400大鼠用異氟烷麻醉并全身注射3000單位的肝素，接著經(jīng)肺動脈用冷卻到4攝氏度的10ml的PBS沖洗后，從中整塊收集含心臟和氣管的肺。將氣管、肺動脈(PA)和左心房(LA)以無菌方式?jīng)_洗。將肺置于500ml器官室(主室)并在37攝氏度下在培養(yǎng)器中培養(yǎng)。將如圖4所述的生物反應(yīng)器用于本試驗(yàn)。將氣管線連接至正壓歧管系統(tǒng)，提供含有5％CO2和余量的氧氣或環(huán)境空氣的連續(xù)氣道正壓(CPAP)。將PA線連接至灌注線，灌注線也連接至填充有灌注液的儲池。灌注液由500ml的RPMI、1640Glutamax、500mg白蛋白、50ml胎牛血清、5ml抗生素/抗真菌液(每mL中10,000單位的青霉素、10mg的鏈霉素、25ug的兩性霉素B)組成。主室和儲池由重調(diào)管連接，也是為了使灌注液能夠在兩室之間循環(huán)。至少每隔一天更換灌注液。灌注和回流均通過蠕動泵(Ismatec,Cole-Parmer)調(diào)節(jié)。接近于PA線監(jiān)控灌注線壓力。主室和儲池以蠕動泵(P-230,HarvardApparatus)通過通氣管連接，這能夠通過移入和移出負(fù)壓肺通氣用的空氣和流體而在主室建立正壓和負(fù)壓。在通過PEEP/CPAP肺培養(yǎng)6或7天并用或不用負(fù)壓肺通氣來灌注后，固定肺、石蠟包埋并切片。進(jìn)行H&E染色和TUNEL染色。結(jié)果：利用如下設(shè)定維持穩(wěn)定分離的肺培養(yǎng)：15cmH2OPEEP，5％CO2和余量的空氣，灌注速率1-3ml/min，在主室壓力從+10mmHg降至-20mmHg下負(fù)壓通氣，呼吸率2至4，取決于多快達(dá)到目標(biāo)負(fù)壓。所測量的灌注線壓力為8.4至30mmHg。關(guān)于組織學(xué)，在培養(yǎng)七天后觀察正常外觀的肺組織的一些區(qū)域。Tunnel染色證實(shí)了所保存的細(xì)胞活力。實(shí)施例3—人肺支架的再細(xì)胞化和培養(yǎng)分離來自4歲小兒供體的左肺，并將右肺成功插管和完全去細(xì)胞化。去細(xì)胞化后，將上下右葉分離并用于再細(xì)胞化和培養(yǎng)。對于細(xì)胞接種和培養(yǎng)，分離肺葉的主要動脈和靜脈并用設(shè)計(jì)為允許灌注液被動引流的血管插管進(jìn)行插管。將管插入主氣道并通過生物反應(yīng)器室的蓋子連接。該系統(tǒng)還允許恒定流量或壓力控制的培養(yǎng)基灌注。方法將總計(jì)500×106的肺的肺泡上皮細(xì)胞(PAEpiCs,ScienCell)通過緩慢注射遞送至氣道，接著2小時(shí)37℃靜態(tài)溫育。以60ml/min的速率開始用1.5L體積的肺的肺泡細(xì)胞生長培養(yǎng)基灌注，產(chǎn)生～8-10mmHg的壓力。灌注和培養(yǎng)在收集組織用于分析前維持4天。培養(yǎng)期間沒有觀察到污染。結(jié)果整個肺組織中多個區(qū)域的組織學(xué)分析證實(shí)了異種細(xì)胞保留但包括強(qiáng)再細(xì)胞化的多個區(qū)域。細(xì)胞分布的不一致性(patchynature)可能是由于細(xì)胞遞送的變化。肺的再細(xì)胞化區(qū)域顯示高水平的沿肺支架自然結(jié)構(gòu)的細(xì)胞附著和伸長。進(jìn)一步的TUNEL細(xì)胞活力分析表明在4天培養(yǎng)中發(fā)生非常低水平的凋亡。實(shí)施例4—尸體豬肺本實(shí)施例記述了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其中將一組尸體豬連接至生物反應(yīng)器并試驗(yàn)生物反應(yīng)器的功能。方法得到一組尸體豬肺用于試驗(yàn)。插管肺動脈和氣管，將器官置于器官室內(nèi)，并將插管連接至其相應(yīng)的輸入(分別為灌注線和通氣線)。在嘗試器官通氣之前開始用含肝素的磷酸鹽緩沖鹽水灌注。實(shí)施灌注的恒定流量和恒定壓力模式。結(jié)果一旦實(shí)現(xiàn)成功灌注，試驗(yàn)器官室的增壓模式。在通氣器官時(shí)增壓模式均成功。然而以壓力目標(biāo)增壓(+20mmHg至-150mmHg)導(dǎo)致器官體積更加明顯的變化。進(jìn)行通氣18小時(shí)(過夜)以確認(rèn)生物反應(yīng)器功能的一致性。將用于尸體肺第一試驗(yàn)的生物反應(yīng)器參數(shù)總結(jié)于表3。本實(shí)驗(yàn)并不包括連接至PPM歧管的通氣袋。這導(dǎo)致由于通氣線和膨脹的器官內(nèi)有限的氣體體積使器官室需要較大的負(fù)表壓來通氣器官。足夠大的通氣袋的添加應(yīng)當(dāng)緩解該膨脹，使氣體自由流入流出肺，響應(yīng)器官室壓力變化而不是膨脹和接觸。表3用于尸體豬肺試驗(yàn)的生物反應(yīng)器設(shè)定的總結(jié)參數(shù)值或模式溫度(C)25(臺式)通氣類型干式PEEP20mbar通氣氣體碳合氣(Carbogen)增壓模式壓力目標(biāo)器官室壓力目標(biāo)+20mmHg和-150mmHg蓄壓器范圍：真空-250mmHg至-500mmHg蓄壓器范圍：壓縮1900mmHg至2200mmHg灌注模式恒壓灌注壓力目標(biāo)+70mmHg相對于大氣壓灌注液1×PBS+肝素灌注體積4L總通氣時(shí)間18h實(shí)施例5—豬肺的保存(短期24小時(shí))本實(shí)施例記述了通氣實(shí)驗(yàn)，其中分離的豬肺連接至生物反應(yīng)器以驗(yàn)證經(jīng)短期分離肺培養(yǎng)的生物反應(yīng)器功能。監(jiān)控整個培養(yǎng)過程中的器官室壓力(圖10A,POC)、PA壓力(PPA)、PV壓力(PPV)、PEEP室壓(PPEEP)和氣管壓力(PT)。經(jīng)由NationalInstruments的緊湊型數(shù)據(jù)采集(cDAQ)系統(tǒng)組合定制開發(fā)的LabVIEW程序(NationalInstruments,Woburn,MA)實(shí)現(xiàn)灌注參數(shù)、通氣參數(shù)的控制和生物反應(yīng)器事件的記錄。系統(tǒng)中的負(fù)壓通氣為壓力控制的且受四個參數(shù)支配：呼吸率(RR)、吸入呼出(I:E)比、下限器官室壓力目標(biāo)(POC-下限)和上限器官室壓力目標(biāo)(POC-上限)。RR決定了各次呼吸的長度，而I:E比限定了各次呼吸進(jìn)入吸氣或呼氣狀態(tài)的時(shí)間間隔。POC-下限和POC-上限分別表示在吸入和呼出期間維持器官室的氣壓。POC-下限和POC-上限之差決定了呼吸的大小和肺的外部暴露的壓力范圍。因此，這些目標(biāo)相對于PEEP室壓的位置影響通氣期間的P跨壁。對于這些實(shí)驗(yàn)，POC-上限設(shè)為接近于PEEP室壓，POC-下限設(shè)為低于其10-15mmHg，依賴于肺的充分呼氣的彈性回縮，以便不使招募的氣道塌縮。在培養(yǎng)期間根據(jù)表4調(diào)整這些參數(shù)以維持膨脹并減少任何可見水腫的累積。大約以與培養(yǎng)基取樣一樣的頻率進(jìn)行調(diào)整，每24小時(shí)3-7次。表4培養(yǎng)參數(shù)調(diào)整表方法使用無菌技術(shù)取出供體肺并置于層流凈化罩中。使用定制連接器(如，各種軟管倒鉤配件，Cole-Parmer,VernonHills,IL)將氣管(T)、肺動脈(PA)和左心室口(PV)插管。接著將肺置于器官室(InstronTERM,Norwood,MA)中用于培養(yǎng)，并將PA、PV和氣管的插管附連至其相應(yīng)的連接。臨床規(guī)模的生物反應(yīng)器(圖10A)包括容納肺移植物的氣密的器官室，起到流體儲池的作用，并提供生理灌注和通氣用連接。器官室和配室置于37℃培養(yǎng)器內(nèi)以維持分離的肺培養(yǎng)的整個時(shí)期內(nèi)的溫度。該設(shè)定的重要特征在于能夠在完全密閉的系統(tǒng)中長時(shí)間(可能數(shù)周)維持無菌器官培養(yǎng)，能夠使培養(yǎng)基更換、取樣和器官干預(yù)。使用屠宰場豬肺(n＝8)以熱缺血時(shí)間>1h和冷缺血時(shí)間>24h進(jìn)行生物反應(yīng)器功能的初步驗(yàn)證。對于試驗(yàn)的各組肺，將PA、PV和氣管插管，采用組織活檢作為對照，在器官室內(nèi)連接之前將器官稱重。然后開始培養(yǎng)基灌注(灌注線在連接至PA前裝填有2L培養(yǎng)基)，募集肺，建立PEEP，并用培養(yǎng)器空氣(21％O2，5％CO2)開始負(fù)壓通氣。培養(yǎng)基含有DMEM，增補(bǔ)有1×GlutaMAX、1×MEM氨基酸(Cat.#s12800-017、35050-061和11130-051，LifeTechnologies,Carlsbad,CA)、1％v/v抗生素/抗真菌素、和110nM的氫化可的松(Cat.#sA5955和H6909Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)，含有10％w/vBSA(Cat.#A2153,Sigma)作為膠體或者不含膠體。維持培養(yǎng)24小時(shí)，在此期間在PA和PV周期性取樣灌注液。通過從PV排出室中除去1-2L的PV流出物，向器官室補(bǔ)充等量或更大體積的新鮮培養(yǎng)基，每24小時(shí)更換兩次培養(yǎng)基。在整個培養(yǎng)過程中連續(xù)監(jiān)控灌注和通氣壓。在分離肺培養(yǎng)之后，從室中取出肺，稱重并采集組織樣品用于組織學(xué)。灌注液分析從PA上游和PV下游取出灌注液(培養(yǎng)基)樣品。在培養(yǎng)期間使用含CG8+盒(Abbott)的i-STAT1分析儀(AbbottPointofCareInc.,Princeton,NJ)測量pH、PO2、PCO2和葡萄糖來分析灌注液組成。短期ILC實(shí)驗(yàn)中不測量灌注液的乳酸鹽含量。培養(yǎng)基組分的更改表示為PA和PV測量之差。因而負(fù)值表示減少，正值表示增加。組織學(xué)和免疫熒光法將組織樣品在10％福爾馬林中在真空下固定過夜，之后轉(zhuǎn)移至70％乙醇，在石蠟中包埋，以5μm切片用于染色。蘇木精和伊紅(H&E)染色用于評價(jià)一般形態(tài)學(xué)特征。末端脫氧核糖酰轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記測定(PromegaDeadEndFluorometricTUNELSystem,PromegaCorporation,Madison,WI)用于評價(jià)凋亡。通過評價(jià)每個組織樣品中六個隨機(jī)視野的每個20×視野(大約0.3419mm2)中TUNEL陽性細(xì)胞的百分比來進(jìn)行凋亡定量。將來自各個試驗(yàn)的肺的兩個以上的組織樣品用于定量。CellProfiler[19,20]用于確定每個圖像中的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。通過下列步驟進(jìn)行組織切片的一次標(biāo)記：第一脫蠟和再水化組織切片，接著在高壓釜中于檸檬酸溶液(抗原揭露液，基于檸檬酸的，Cat.#H-3300，VectorLaboratoriesInc.,Burlingame,CA)中進(jìn)行抗原修復(fù)，在PBS中洗滌切片，用PBS中的5％驢血清(Cat.#S-30-100ML,EMDMillipore,Darmstadt,Germany)封閉30分鐘，并用一抗溫育載玻片過夜(18小時(shí))。使用針對VE-鈣粘蛋白(Cat.#sc-9989,SantaCruzBiotechnology,Dallas,TX)、E-鈣粘蛋白(Cat.#610181,BDBiosciences,SanJose,CA)、ZO-1(Cat.#61-7300,LifeTechnologies,GrandIsland,NY)和pro-SPB(Cat.#AB3430,EMDMillipore)的一抗。通過下列步驟進(jìn)行一抗的二次標(biāo)記：在PBS中的0.1％的Tween中進(jìn)行第一洗滌組織切片，接著用相應(yīng)的二抗溫育30分鐘，再次用PBS中的0.1％Tween洗滌，并用含DAPI的封固劑(DAPIFluoromount-G,Cat.#0100-20,SouthernBiotech,Birmingham,AL)封固載玻片。物性參數(shù)的計(jì)算跨壁壓(PTM)計(jì)算為PTM＝PT–POC且為施加到肺以促進(jìn)通氣的機(jī)械應(yīng)力的測量指標(biāo)。正PTM對應(yīng)于吸入，負(fù)PTM對應(yīng)于呼出。器官重量的百分比變化計(jì)算為ΔW器官＝(W終–W初)/W初*100。葡萄糖和乳酸鹽的質(zhì)量消耗率(Δ葡萄糖和Δ乳酸鹽)計(jì)算為從PA到PV的濃度變化乘以灌注流速。肺血管阻力(PVR)計(jì)算為PVR＝(PPA–PPV)/Q，其中Q為灌注流速。除非另有說明，所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差或表示為箱形圖。結(jié)果針對DMEM中10％的BSA(BSA,n＝5)和僅DMEM(DMEM,n＝3)灌注組的短期(24h)ILC條件列于表5。兩組中的肺的培養(yǎng)前冷缺血時(shí)間>24小時(shí)。灌注和通氣期間兩組的PA壓力維持在相對于器官室壓力的20-40mmHg。培養(yǎng)期間調(diào)整PEEP、呼吸率、跨壁壓和I:E比以保持膨脹，并減少任何可見水腫的累積但在組間是相似的。相比于僅在DMEM中培養(yǎng)的肺，在10％BSA中培養(yǎng)24小時(shí)的肺顯示出較大的器官重量變化百分比(圖11a)。對于BSA組，在PA和PV的平均pO2值分別為131.7±6.5mmHg和79.2±8.1mmHg。對于DMEM組，在PA和PV的平均pO2值分別為156.1±6.8mmHg和101.5±2.5mmHg。整個培養(yǎng)期間在PA和PV的同時(shí)灌注液取樣允許隨著灌注實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基的溶解氣體和葡萄糖含量的變化。來自兩組的培養(yǎng)基揭示了溶解O2和葡萄糖的類似消耗與溶解CO2的相應(yīng)產(chǎn)生(圖11b)。這些觀察在整個24小時(shí)培養(yǎng)期間始終一致。取自短期ILC后的組織樣品的組織學(xué)分析(圖11c-d)揭示了天然肺結(jié)構(gòu)(nativelungarchitecture)的維持(圖11c)。TUNEL測定(圖11d-e)示出凋亡細(xì)胞百分比的統(tǒng)計(jì)上不顯著的少量增加(ANOVA,p＝0.6851)。表5短期ILC條件表實(shí)施例6—豬肺的保存(長期72小時(shí))本實(shí)施例記述了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其中將分離豬肺連接至生物反應(yīng)器以驗(yàn)證經(jīng)長期分離肺培養(yǎng)的生物反應(yīng)器功能。監(jiān)控整個培養(yǎng)過程中的器官室壓力(圖10A,POC)、PA壓力(PPA)、PV壓力(PPV)、PEEP室壓(PPEEP)和氣管壓力(PT)。經(jīng)由NationalInstruments的緊湊型數(shù)據(jù)采集(cDAQ)系統(tǒng)組合定制開發(fā)的LabVIEW程序(NationalInstruments,Woburn,MA)實(shí)現(xiàn)灌注參數(shù)、通氣參數(shù)的控制和生物反應(yīng)器事件的記錄。生物反應(yīng)器中的負(fù)壓通氣為壓力控制的且受四個參數(shù)支配：呼吸率(RR)、吸入呼出(I:E)比、下限器官室壓力目標(biāo)(POC-下限)和上限器官室壓力目標(biāo)(POC-上限)。RR決定了各次呼吸的長度，而I:E比限定了各次呼吸進(jìn)入吸氣或呼氣狀態(tài)的時(shí)間間隔。POC-下限和POC-上限分別表示在吸入和呼出期間維持器官室的氣壓。POC-下限和POC-上限之差決定了呼吸的大小和肺的外部暴露的壓力范圍。因此，這些目標(biāo)相對于PEEP室壓的位置影響通氣期間的P跨壁。對于這些實(shí)驗(yàn)，POC-上限設(shè)為接近于PEEP室壓，POC-下限設(shè)為低于其10-15mmHg，依賴于肺的充分呼氣的彈性回縮，以便不使招募的氣道塌縮。在培養(yǎng)期間根據(jù)表6調(diào)整這些參數(shù)以維持膨脹并減少任何可見水腫的累積。大約以與培養(yǎng)基取樣一樣的頻率進(jìn)行調(diào)整，每24小時(shí)3-7次。表6培養(yǎng)參數(shù)調(diào)整表方法將冷缺血時(shí)間<1h的豬肺(n＝4)用于建立長期ILC。準(zhǔn)備培養(yǎng)用器官，除了使用非膠體培養(yǎng)基以外，使用如上所述的步驟安裝于器官室內(nèi)。維持培養(yǎng)至少72小時(shí)，在此期間在PA和PV周期性取樣灌注液。培養(yǎng)基還以短期ILC所述的相同間隔更換，如果器官室儲池出現(xiàn)低(<1L)則添加額外的培養(yǎng)基。在整個培養(yǎng)過程中連續(xù)監(jiān)控灌注和通氣壓。通過用100％O2(FiO2＝1.0)通氣10分鐘并觀察灌注液中如在PV出口測量的O2分壓變化來進(jìn)行氧交換的功能性試驗(yàn)，其中ΔPVpO2＝PVpO2試驗(yàn)后–PVpO2試驗(yàn)前。該功能性試驗(yàn)方法經(jīng)比較PA處和PV處的pO2來選擇，這是由于系統(tǒng)以閉環(huán)灌注培養(yǎng)基且不在PA上游將灌注液脫氧。FiO2＝0.21和1.0時(shí)PVpO2值的比較揭示了在我們的生物反應(yīng)器系統(tǒng)的環(huán)境下對肺通氣以氧合灌注液的能力。在功能性試驗(yàn)期間中空纖維氣體交換器供給有灌注時(shí)殘留的培養(yǎng)空氣。ILC后，將肺從室中取出，并采集組織樣品用于組織學(xué)。灌注液分析從PA上游和PV下游取出灌注液(培養(yǎng)基)樣品。在培養(yǎng)期間使用含CG8+盒(Abbott)的i-STAT1分析儀(AbbottPointofCareInc.,Princeton,NJ)測量pH、PO2、PCO2和葡萄糖來分析灌注液組成。CG4+盒用于測量長期ILC實(shí)驗(yàn)中的乳酸鹽含量。培養(yǎng)基組分的更改表示為PA和PV測量之差，因而負(fù)值表示減少，正值表示增加。組織學(xué)和免疫熒光法將組織樣品在10％福爾馬林中在真空下固定過夜，之后轉(zhuǎn)移至70％乙醇，在石蠟中包埋，以5μm切片用于染色。蘇木精和伊紅(H&E)染色用于評價(jià)一般形態(tài)學(xué)特征。末端脫氧核糖酰轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記測定(PromegaDeadEndFluorometricTUNELSystem,PromegaCorporation,Madison,WI)用于評價(jià)凋亡。通過評價(jià)每個組織樣品中六個隨機(jī)視野的每個20×視野(大約0.3419mm2)中TUNEL陽性細(xì)胞的百分比來進(jìn)行凋亡定量。將來自各個試驗(yàn)的肺的兩個以上的組織樣品用于定量。CellProfiler[19,20]用于確定每個圖像中的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。通過下列步驟進(jìn)行組織切片的一次標(biāo)記：第一脫蠟和再水化組織切片，接著在高壓釜中于檸檬酸溶液(抗原揭露液，基于檸檬酸的，Cat.#H-3300，VectorLaboratoriesInc.,Burlingame,CA)中進(jìn)行抗原修復(fù)，在PBS中洗滌切片，用PBS中的5％驢血清(Cat.#S-30-100ML,EMDMillipore,Darmstadt,Germany)封閉30分鐘，并用一抗溫育載玻片過夜(18小時(shí))。使用針對VE-鈣粘蛋白(Cat.#sc-9989,SantaCruzBiotechnology,Dallas,TX)、E-鈣粘蛋白(Cat.#610181,BDBiosciences,SanJose,CA)、ZO-1(Cat.#61-7300,LifeTechnologies,GrandIsland,NY)和pro-SPB(Cat.#AB3430,EMDMillipore)的一抗。通過下列步驟進(jìn)行一抗的二次標(biāo)記：在PBS中的0.1％的Tween中進(jìn)行第一洗滌組織切片，接著用相應(yīng)的二抗溫育30分鐘，再次用PBS中的0.1％Tween洗滌，并用含DAPI的封固劑(DAPIFluoromount-G,Cat.#0100-20,SouthernBiotech,Birmingham,AL)封固載玻片。物性參數(shù)的計(jì)算跨壁壓(PTM)計(jì)算為PTM＝PT–POC且為施加到肺以促進(jìn)通氣的機(jī)械應(yīng)力的測量指標(biāo)。正PTM對應(yīng)于吸入，負(fù)PTM對應(yīng)于呼出。器官重量的百分比變化計(jì)算為ΔW器官＝(W終–W初)/W初*100。葡萄糖和乳酸鹽的質(zhì)量消耗率(Δ葡萄糖和Δ乳酸鹽)計(jì)算為從PA到PV的濃度變化乘以灌注流速。肺血管阻力(PVR)計(jì)算為PVR＝(PPA–PPV)/Q，其中Q為灌注流速。除非另有說明，所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差或表示為箱形圖。結(jié)果長期(72h)ILC條件和結(jié)果列于表7。肺在培養(yǎng)前具有大約1小時(shí)的冷缺血時(shí)間。灌注和通氣期間長期ILC時(shí)的PA壓力維持在器官室壓力或相對于器官室壓力之下20-40mmHg。培養(yǎng)期間調(diào)整PEEP、呼吸率、跨壁壓和I:E比并減少任何可見水腫的累積但在組間是相似的。長期ILC下的肺顯示O2和葡萄糖的消耗與CO2的相應(yīng)產(chǎn)生(圖12a)，盡管比在短期ILC下試驗(yàn)的肺的程度低一些(圖11b，注意y軸標(biāo)尺)。在長期ILC下的肺中還觀察到乳酸鹽的相應(yīng)產(chǎn)生(圖12a)。長期ILC下的肺的功能性試驗(yàn)揭示了氧交換能力維持了整個72h(3天)的培養(yǎng)時(shí)間(圖12b，左)。功能性試驗(yàn)后PA和PV的pO2值(圖12b，右)揭示PV處的pO2大于PA，以及與用FiO2＝0.21(FiO2為0.21的平均PApO2＝144.0±9.78mmHg)平衡時(shí)相比灌注液pO2的總體增加。培養(yǎng)基總體積隨培養(yǎng)時(shí)間增加，這是由于在器官室儲池出現(xiàn)低(<1L)時(shí)添加了新鮮培養(yǎng)基。始終一致的平均PA流速(QPA)產(chǎn)生長期ILC下肺在整個培養(yǎng)期間穩(wěn)定的PPA和PVR(圖12b)。TUNEL測定(圖11d-e)示出取自完整的72h培養(yǎng)期后的組織樣品中凋亡百分比與對照組織相比的統(tǒng)計(jì)上不顯著的少量增加(圖12d,p＝0.0692)。H&E染色(圖12e)揭示了長期ILC后肺結(jié)構(gòu)的維持。長期ILC后收集的肺組織(圖12e,72h)與培養(yǎng)前組織活檢(圖12e,0h)相比還保留VE-鈣粘蛋白、E-鈣粘蛋白、ZO-1和pro-SPB的表達(dá)和出現(xiàn)。表7長期ILC條件表實(shí)施例7—單一人肺的保存(長期72小時(shí))本實(shí)施例記述了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其中將分離人肺連接至生物反應(yīng)器以通過長期分離肺培養(yǎng)驗(yàn)證生物反應(yīng)器功能。監(jiān)控整個培養(yǎng)過程中的器官室壓力(圖10A,POC)、PA壓力(PPA)、PV壓力(PPV)、PEEP室壓(PPEEP)和氣管壓力(PT)。經(jīng)由NationalInstruments的緊湊型數(shù)據(jù)采集(cDAQ)系統(tǒng)組合定制開發(fā)的LabVIEW程序(NationalInstruments,Woburn,MA)實(shí)現(xiàn)灌注參數(shù)、通氣參數(shù)的控制和生物反應(yīng)器事件的記錄。我們的系統(tǒng)中的負(fù)壓通氣為壓力控制的且受四個參數(shù)支配：呼吸率(RR)、吸入呼出(I:E)比、下限器官室壓力目標(biāo)(POC-下限)和上限器官室壓力目標(biāo)(POC-上限)。RR決定了各次呼吸的長度，而I:E比限定了各次呼吸進(jìn)入吸氣或呼氣狀態(tài)的時(shí)間間隔。POC-下限和POC-上限分別表示在吸入和呼出期間維持器官室的氣壓。POC-下限和POC-上限之差決定了呼吸的大小或肺的外部暴露的壓力范圍。因此，這些目標(biāo)相對于PEEP室壓的位置影響通氣期間的P跨壁。對于這些實(shí)驗(yàn)，POC-上限設(shè)為接近于PEEP室壓，POC-下限設(shè)為低于其10-15mmHg，依賴于肺的充分呼氣的彈性回縮，以便不使招募的氣道塌縮。在培養(yǎng)期間根據(jù)表8調(diào)整這些參數(shù)以維持膨脹并減少任何可見水腫的累積。大約以與培養(yǎng)基取樣一樣的頻率進(jìn)行調(diào)整，每24小時(shí)3-7次。表8培養(yǎng)參數(shù)調(diào)整表方法與新英格蘭器官銀行(NEOB)協(xié)調(diào)，以標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)方式從心臟仍在跳動的供體獲得了發(fā)現(xiàn)不適合移植的捐贈人肺。捐贈前的胸部的x射線顯示少量基底肺不張，動脈氧張力為100％FiO2上116mmHg，表明受損的氣體交換。將肺遞送到冰上的無菌容器中并在到達(dá)后立即安裝到生物反應(yīng)器上。分離右肺，并在如上72小時(shí)的長期ILC中所述設(shè)定之前將PA、PV和氣管插管。從收集到再灌注的冷缺血時(shí)間為5.5小時(shí)。灌注液分析從PA上游和PV下游取出灌注液(培養(yǎng)基)樣品。在培養(yǎng)期間使用含CG8+盒(Abbott)的i-STAT1分析儀(AbbottPointofCareInc.,Princeton,NJ)測量pH、PO2、PCO2和葡萄糖來分析灌注液組成。CG4+盒用于測量長期ILC實(shí)驗(yàn)中的乳酸鹽含量。培養(yǎng)基組分的更改表示為PA和PV測量之差，因而負(fù)值表示減少，正值表示增加。組織學(xué)和免疫熒光法將組織樣品在10％福爾馬林中在真空下固定過夜，之后轉(zhuǎn)移至70％乙醇，在石蠟中包埋，以5μm切片用于染色。蘇木精和伊紅(H&E)染色用于評價(jià)一般形態(tài)學(xué)特征。末端脫氧核糖酰轉(zhuǎn)移酶dUTP缺口末端標(biāo)記測定(PromegaDeadEndFluorometricTUNELSystem,PromegaCorporation,Madison,WI)用于評價(jià)凋亡。通過評價(jià)每個組織樣品中六個隨機(jī)視野的每個20×視野(大約0.3419mm2)中TUNEL陽性細(xì)胞的百分比來進(jìn)行凋亡定量。將來自各個試驗(yàn)的肺的兩個以上的組織樣品用于定量。CellProfiler[19,20]用于確定每個圖像中的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)。通過下列步驟進(jìn)行組織切片的一次標(biāo)記：第一脫蠟和再水化組織切片，接著在高壓釜中于檸檬酸溶液(抗原揭露液，基于檸檬酸的，Cat.#H-3300，VectorLaboratoriesInc.,Burlingame,CA)中進(jìn)行抗原修復(fù)，在PBS中洗滌切片，用PBS中的5％驢血清(Cat.#S-30-100ML,EMDMillipore,Darmstadt,Germany)封閉30分鐘，并用一抗溫育載玻片過夜(18小時(shí))。使用針對VE-鈣粘蛋白(Cat.#sc-9989,SantaCruzBiotechnology,Dallas,TX)、E-鈣粘蛋白(Cat.#610181,BDBiosciences,SanJose,CA)、ZO-1(Cat.#61-7300,LifeTechnologies,GrandIsland,NY)和pro-SPB(Cat.#AB3430,EMDMillipore)的一抗。通過下列步驟進(jìn)行一抗的二次標(biāo)記：在PBS中的0.1％的Tween中進(jìn)行第一洗滌組織切片，接著用相應(yīng)的二抗溫育30分鐘，再次用PBS中的0.1％Tween洗滌，并用含DAPI的封固劑(DAPIFluoromount-G,Cat.#0100-20,SouthernBiotech,Birmingham,AL)封固載玻片。物性參數(shù)的計(jì)算跨壁壓(PTM)計(jì)算為PTM＝PT–POC且為施加到肺以促進(jìn)通氣的機(jī)械應(yīng)力的測量指標(biāo)。正PTM對應(yīng)于吸入，負(fù)PTM對應(yīng)于呼出。器官重量的百分比變化計(jì)算為ΔW器官＝(W終–W初)/W初*100。葡萄糖和乳酸鹽的質(zhì)量消耗率(Δ葡萄糖和Δ乳酸鹽)計(jì)算為從PA到PV的濃度變化乘以灌注流速。肺血管阻力(PVR)計(jì)算為PVR＝(PPA–PPV)/Q，其中Q為灌注流速。除非另有說明，所有數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差或表示為箱形圖。結(jié)果培養(yǎng)的第一人肺與之前試驗(yàn)的豬肺組的行為類似。在培養(yǎng)期間，平均PA壓力為12.10mmHg，PEEP設(shè)為8.38mmHg。呼吸率保持在每分鐘5次呼吸，I:E＝1.2，PTM在12.91至-4.47mmHg的范圍內(nèi)(ΔPTM＝17.38mmHg)。氧氣和葡萄糖的消耗隨著乳酸鹽的產(chǎn)生以可比的程度存在(圖13a)。不像豬肺，觀察到朝向CO2從培養(yǎng)基中除去的趨勢(圖13a)。氧氣交換功能也在整個培養(yǎng)期間維持(圖13b，左)。功能試驗(yàn)后的PA和PVpO2值(圖13b，右)揭示了PV處的pO2顯著高于試驗(yàn)的豬肺，以及與用FiO2＝0.21(平均PApO2＝145.1mmHg)平衡時(shí)相比灌注液pO2的總體增加。在器官室儲池出現(xiàn)低(<1L)時(shí)添加了新鮮培養(yǎng)基，結(jié)果培養(yǎng)基總體積隨培養(yǎng)時(shí)間增加(圖13c，上)。再者，始終一致的平均QPA產(chǎn)生長期ILC下人肺在整個培養(yǎng)期間穩(wěn)定的PPA和PV(圖13c)。也觀察到小的、非統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的凋亡增加(圖13d,p＝0.1352)。組織學(xué)分析揭示了長期ILC后肺結(jié)構(gòu)的維持(圖13e,H&E)。長期ILC下的人肺也保留了VE-鈣粘蛋白、E-鈣粘蛋白、ZO-1和pro-SPB的表達(dá)和出現(xiàn)(圖13e)。實(shí)施例8—大鼠肺的保存本實(shí)施例記述驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其中將新分離的大鼠肺連接至生物反應(yīng)器以試驗(yàn)生物反應(yīng)器的功能。方法將大鼠肺在生理熱條件下使用負(fù)通氣保存。如圖14A所示，將主室壓力從0調(diào)整到-8cmH2O，呼吸率為20/min。結(jié)果在第一實(shí)驗(yàn)中，添加有5％右旋糖酐的KBH(0.6ml/min)灌注液(如圖14B-C所示)導(dǎo)致灌注壓和動態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)在4小時(shí)內(nèi)降低，肺變得完全水腫。Cdyn是肺品質(zhì)的功能性參數(shù)。另外，當(dāng)使用不含右旋糖酐的KHB(0.6ml/min)時(shí)灌注壓和動態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)也在6小時(shí)內(nèi)降低。采集用0.6ml/min的KHB以及5％右旋糖酐灌注的分離肺相關(guān)的生理數(shù)據(jù)(如圖15A-C所示)。如圖15A所示調(diào)節(jié)主室壓力0--8cmH2O，呼吸率為20/min。參考圖15B，示出PA灌注壓的時(shí)程。如圖15B所示，壓力逐漸降低，動態(tài)順應(yīng)性(Cdyn)也降低。在本實(shí)驗(yàn)中，分離肺在4小時(shí)灌注后完全水腫。Cdyn定義為潮氣量(ml)除以峰主室負(fù)壓值(cmH2O)。參考圖15C，沒有分離肺被保存破壞或損傷的跡象。圖15C為示出肺標(biāo)本在用蘇木精和伊紅灌注后的染色結(jié)果的圖像。左圖，對照，100×。右圖，灌注6小時(shí)后的樣品，100×。該圖像示出生物反應(yīng)器中尸體肺的6h灌注和通氣后的正常肺結(jié)構(gòu)和細(xì)胞完整性的維持。實(shí)施例9—從人供體分離原代肺表皮本實(shí)施例記述了分離和擴(kuò)增原代人肺表皮的方案。第一，修改的新生大鼠組織消化方案(方案A)，第二，改編自文獻(xiàn)(Karp,P.H.etal.,ProtocolB)的方案。方法：方案A-基于大鼠新生肺/腎消化。測定時(shí)間＝～3小時(shí)1.制備消化培養(yǎng)基：1mg/ml分散酶(StemCellTechnologies)，含1mg/ml膠原酶2.將(a)外周肺組織～1.5”立方，或(b)主氣道(分支細(xì)支氣管)分配到50ml離心管3.向各管添加20ml的消化培養(yǎng)基4.使用小的尖頭剪刀將肺快速切成小碎塊5.在消化緩沖液中37℃溫育切碎的肺90分鐘6.從37℃移除樣品并使組織暫時(shí)沉降7.從樣品吸取流體并通過100μm的過濾器8.離心沉降濾液–300×g，5min9.在紅細(xì)胞裂解緩沖液中重懸并室溫溫育5-10min10.添加當(dāng)量體積的αMEM來洗滌11.離心沉降–300×g，5min12.計(jì)數(shù)并將細(xì)胞直接鋪至培養(yǎng)瓶。方案B-基于MolBiol.2002；188:115-37的方法。測定時(shí)間＝～24小時(shí)1.準(zhǔn)備解離液：鏈霉素蛋白酶(Roche/BoehringerMannheim,cat.no.165921)和脫氧核糖核酸酶1(Sigma,cat.no.DN-25)。對于100mL而言，在100mLαMEM中溶解140mg鏈霉素蛋白酶和10mgDnase。2.將(a)外周肺組織～1.5”立方，或(b)主氣道(分支細(xì)支氣管)分配到50ml離心管3.向各管添加20ml的消化培養(yǎng)基4.使用小的尖頭剪刀將肺快速切成小碎塊5.在消化緩沖液中4℃溫育切碎的肺24小時(shí)。解離期間不時(shí)顛倒試管以攪拌和打散細(xì)胞塊。氣管和支氣管組織需要最低40h到最高96h。6.為了結(jié)束解離，向解離液添加含10％FBS的αMEM。將離心管顛倒數(shù)次以攪拌細(xì)胞懸液。在特定的氣道中重懸細(xì)胞團(tuán)并鋪在未涂布的組織培養(yǎng)皿上。溫育懸浮液最低1h或更長時(shí)間以使成纖維細(xì)胞附著。氣道表皮細(xì)胞在沒有膠原預(yù)處理的情況下不會附著塑料表面。7.從培養(yǎng)皿中收集未附著的細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至涂布的平皿。在通過方案A和方案B消化人供體肺后，將細(xì)胞鋪在用(1)0.1％的明膠或(2)0.1mg/ml的膠原IV預(yù)涂布的培養(yǎng)瓶上。接著細(xì)胞在(1)DMEM、(2)SAGM、(3)AepiCM或(4)BEGM中生長。結(jié)果：培養(yǎng)24小時(shí)時(shí)評價(jià)細(xì)胞附著和形態(tài)學(xué)表明，方案B與平板上涂布膠原IV的組合產(chǎn)生更多的表皮樣克隆。繼續(xù)這些培養(yǎng)7天證實(shí)了相應(yīng)的這些培養(yǎng)物的擴(kuò)增能力。在DMEM中培養(yǎng)的細(xì)胞以成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞群快速生長過度，將這些培養(yǎng)物丟棄。此時(shí)，將細(xì)胞傳代并再鋪板，從而進(jìn)一步評價(jià)擴(kuò)增能力。來自各條件的細(xì)胞等份還接種到人肺基質(zhì)切片中以評價(jià)生物相容性。細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)4天后添加鈣黃綠素AM染料表明培養(yǎng)物中高水平的活力和細(xì)胞生存力并觀察到細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用。還通過在培養(yǎng)第11天免疫熒光染色、接著傳代一次來研究培養(yǎng)細(xì)胞的表型。異種表型表示1型肺泡細(xì)胞(T1α)、克拉拉細(xì)胞(CCSP)、氣道表皮細(xì)胞(CK5)、基底細(xì)胞(p63)、II型肺泡細(xì)胞(E-Cad)和間充質(zhì)細(xì)胞(波形蛋白)的子集。其他實(shí)施方案已經(jīng)記述了本發(fā)明的多個實(shí)施方案。然而，將理解的是，可進(jìn)行各種修改而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3