本發(fā)明是在由美國國立衛(wèi)生研究院授予的NIHR01HL092437的政府支持下作出的。美國政府對本發(fā)明擁有一定的權(quán)利。
技術(shù)領(lǐng)域：
本文描述的是應用于再生醫(yī)學領(lǐng)域中的方法和組合物，所述方法和組合物對造血細胞提供了有效的離體擴增并在造血移植環(huán)境中建立治療方法。
背景技術(shù)：
：造血干細胞(HSC)擁有自我更新并產(chǎn)生血液和免疫系統(tǒng)內(nèi)的所有類型的成熟細胞的獨特能力。盡管HSC的主要來源(人骨髓、流動的外周血和臍帶血)仍然被限制為供體供給物(donorsupply)，這些特征提供了HSC移植的廣泛的臨床實用性。由于需要對接受者尋找良好匹配的供體，使此類問題加劇，從而在確保供體材料合適且可靠供應方面增加了的升高的復雜性。此外，患有由基因突變引起的疾病的患者將極大地受益于基因治療技術(shù)，其中對自體材料進行離體操作，并在糾正的基因缺陷得到糾正后將其返回。在各種類型的移植類別中，開發(fā)用于離體擴增和HSC基因操作的有效技術(shù)能夠提供現(xiàn)有的供體基礎(chǔ)構(gòu)造之外的現(xiàn)成可再生資源，并建立新的基因治療技術(shù)以治療由遺傳突變引起的疾病。眾所周知，HSC自我再生由內(nèi)在和外在的信號調(diào)控。盡管在理解支持體內(nèi)造血系統(tǒng)的自我更新和分化的分子因素方面取得了重大進展，但是關(guān)于如何調(diào)節(jié)控制HSC和更原始的人造血干/祖細胞(HSPC)的離體自我更新的因素則知之甚少。此外，與胚胎干細胞(ESC)的情況不同，培養(yǎng)物中的HSC和/或HSPC的擴增通常以損失“干性”為代價。新興研究已經(jīng)表明了建立離體培養(yǎng)條件的可能性，該條件使一些HSC群(例如表達CD34和CD90標志物的HSC群)自我更新和擴增，其看起來與骨髓再生潛能一致。外在因素是否可被應用于進一步增強HSC群的擴增而不損失“干性”是未知的。此類細胞是否接受基因組修飾也是不清楚的，基因組修飾將極大地有益于離體培養(yǎng)的HSC在治療應用中的應用。因此，仍然需要用于產(chǎn)生和擴增大量的人HSC的方法，以提高細胞作為可再生治療資源用于移植的可用性。本文描述的是使造血干祖細胞有效地離體擴增的方法和組合物。使用小分子藥物和靶向細胞中的表觀遺傳狀態(tài)的生長因子/細胞因子/生長因子的組合，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)用多種化合物(例如TSA、MS-275或DOT1抑制劑)處理的HSPC擴增至少10倍。重要的是，這些結(jié)果可擴展到人臍帶血和外周流動的干/祖細胞(PBSC)。此外，在用諸如TSA或MS275的化合物處理后，HSPC功能涉及的多個基因(如HoxA9、HoxB4、GATA-2和SALL4)不受干擾，并且在處理后使用慢病毒的基因組編輯的效率大大提高。這些新方法可潛在地在治療上用于在移植環(huán)境中擴增臍帶血HSPC以及基因修飾，例如基因治療或其它基因組編輯/工程化過程(例如轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應因子核酸酶(TALEN)、鋅指核酸酶(ZFN)或成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(CRISPR))。技術(shù)實現(xiàn)要素：本文描述的是擴增造血細胞的方法，所述方法包括提供一批量(aquantityof)的造血細胞，并在至少一種小分子和至少一種生長因子的存在下對所述一批量的造血細胞進行培養(yǎng)，其中所述至少一種小分子和至少一種生長因子能夠擴增造血細胞。在另一實施方式中，所述造血細胞是造血干細胞(HSC)。在另一實施方式中，所述造血細胞是造血干祖細胞(HSPC)。在另一實施方式中，所述造血細胞分離自臍帶血。在另一實施方式中，所述造血細胞分離自骨髓。在另一實施方式中，所述造血細胞是分離自外周血。在另一實施方式中，所述至少一種小分子是組蛋白脫乙酰酶抑制劑(HDACi)。在另一實施方式中，所述HDACi包括選自曲古抑菌素(TSA)、DLS3、MS275、SAHA和HDAC6抑制劑161的一種或多種HDACi。在另一實施方式中，所述至少一種小分子包括選自5-氮雜胞苷、JQ1-S、JY1、UNC0638、JMJD3、JQ-EZ-05、SR1、DBZ、dmPGE2和UM171的一種或多種小分子。在另一實施方式中，所述至少一種生長因子包括選自干細胞因子(SCF)、flt3配體(FL)、白介素-3(IL3)和白介素-6(IL6)的一種或多種生長因子。本文進一步描述的是基因組編輯的方法，所述方法包括提供一批量的造血細胞，并在至少一種小分子和至少一種生長因子的存在下對所述一批量的造血細胞進行培養(yǎng)，使所述細胞與一種或多種載體(各載體編碼至少一種選擇盒(selectioncassette)和/或至少一種核酸酶)接觸，以及選擇表達所述選擇盒和所述核酸酶的造血細胞，其中表達所述選擇盒和所述核酸酶的細胞包含經(jīng)編輯的基因組。在另一實施方式中，所述細胞是造血干細胞(HSC)。在另一實施方式中，多能干細胞是造血干組細胞(HSPC)。在另一實施方式中，所述至少一種核酸酶是鋅指核酸酶(ZFN)。在另一實施方式中，所述至少一種核酸酶是轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應因子核酸酶(TALEN)。在另一實施方式中，所述至少一種核酸酶是CRISPR-相關(guān)蛋白(Cas)核酸酶。在另一實施方式中，所述一種或多種載體包括編碼至少一種選擇盒和至少一種核酸酶的載體。在另一實施方式中，所述量的造血細胞分離自臍帶血、骨髓或外周血。在另一實施方式中，所述方法包括向受試者給予所選擇的造血細胞。在另一實施方式中，所述造血細胞與受試者免疫相容。本文進一步描述的是通過基因組編輯的方法產(chǎn)生的一批量的細胞，所述方法包括提供一批量的造血細胞，并在至少一種小分子和至少一種生長因子的存在下對所述量的造血細胞進行培養(yǎng)，使所述細胞與一種或多種載體(各載體編碼至少一種選擇盒和/或至少一種核酸酶)接觸，以及選擇表達所述選擇盒和所述核酸酶的造血細胞，其中表達所述選擇盒和所述核酸酶的細胞包含經(jīng)編輯的基因組。本文另外描述的是擴增造血細胞的離體方法，所述方法包括從臍帶血、骨髓或外周血獲得一批量的造血干細胞(HSC)或造血干祖細胞(HSPC)，以及通過在至少一種小分子和至少一種生長因子的存在下通過培養(yǎng)HSC或HSPC將HSC或HSPC擴增至少48小時的時間段，從而使HSC或HSPC得以擴增，所述至少一種小分子選自曲古抑菌素(TSA)、DLS3、MS275、SAHA、HDAC6抑制劑161、5-氮雜胞苷、JQ1-S、JY1、UNC0638、JMJD3、JQ-EZ-05、SR1、DBZ、dmPGE2和UM171，所述至少一種生長因子選自干細胞因子(SCF)、flt3配體(FL)、白介素-3(IL3)和白介素-6(IL6)。在另一實施方式中，獲得一批量的HSPC包括對表達CD34+和/或CD90+的細胞進行分離。在另一實施方式中，所述至少48小時的時間段包括72小時、96小時、120小時、144小時或168小時。附圖說明在參考的附圖中對示例性的實施方式進行說明。旨在將本文公開的實施方式和附圖視為說明性的、而非限制性的。圖1用增加CD34+CD90+細胞的化合物進行篩選。(A)在培養(yǎng)后的化合物對CD34和CD90表達的影響。各值代表兩次獨立實驗的平均值±標準誤。(B)用所述化合物培養(yǎng)的CD34+CD90+細胞的絕對數(shù)。各值代表兩次獨立實驗的平均值±標準誤。圖2UM171影響CD34+細胞的分裂。使用商業(yè)化和合成的(以home標記)UMI171及其中間體的50nM至500nM(1uM)之間的總細胞數(shù)非常相似。圖3TSA影響CD34+細胞的分裂。(A)在細胞因子/生長因子/生長因子的存在下，用TSA、MS275或DMSO培養(yǎng)的CD34+細胞的細胞生長。所示數(shù)據(jù)是三次獨立實驗的平均值。(B)在細胞因子/生長因子/生長因子的存在下，將用TSA或DMSO處理的CSFE-標記的CD34+細胞培養(yǎng)7天。該子圖顯示了培養(yǎng)5天和7天后的CFSE熒光強度的代表性流式細胞術(shù)概圖(2個實驗中的1個)。箭頭表示已經(jīng)歷較少細胞分裂的細胞的分數(shù)。(C)該子圖顯示了培養(yǎng)5天后的CD34+CD90+細胞和CD34+CD90-細胞的CFSE熒光強度的代表性流式細胞術(shù)概圖。(D)該子圖顯示了培養(yǎng)7天后的CD34+CD90+細胞和CD34+CD90-細胞的CFSE熒光強度的代表性流式細胞術(shù)概圖。(E)在細胞因子/生長因子/生長因子的存在下，用TSA、MS275或DMSO培養(yǎng)的膜聯(lián)蛋白V陽性細胞。所示數(shù)據(jù)是兩次獨立實驗的平均值。圖4用TSA處理CB細胞增強了骨髓再增殖潛能。散點圖顯示了在用DMSO、TSA或MS275進行培養(yǎng)后，用2×104個CD34+細胞的后代移植2周后的NSG小鼠的PB中植入的人CD45+細胞的水平。圖5用TSA處理HSPC增強了骨髓再增殖潛能。散點圖顯示了在移植8周后，在NSG小鼠的PB(A)和BM(B)中植入的人CD45+細胞的水平。圖6用TSA處理CD34+細胞調(diào)節(jié)干細胞相關(guān)基因的表達。通過實時定量PCR測量野生型肽處理對基因(GATA1、GATA2、NOTCH1、BMI1、HOXB4、C-MYC、PU.1、BCL2、P53、P21、P27、MPO、TPO和CD34)的相對轉(zhuǎn)錄水平的影響。在細胞因子/生長因子/生長因子的存在下，從用TSA或DMSO培養(yǎng)3天獲得的細胞中提取總RNA。通過實時PCR確定經(jīng)TSA處理的細胞相對于經(jīng)DMSO處理的細胞的相對mRNA水平。將GAPDH用作內(nèi)部校準物(對照基因)。使用2個獨立試樣以兩重復獲得測量值。圖7人干細胞中的CD34+CD90+擴增的示意模型。(A)即使細胞處于含有細胞因子/生長因子/生長因子的培養(yǎng)基的刺激條件下，HSPC傾向于分化。在含有細胞因子/生長因子/生長因子的培養(yǎng)基中，經(jīng)組蛋白脫乙酰酶抑制劑(HDACi)處理的HSPC得到擴增而非分化。(B)CD34+CD90+細胞的分裂模型的示意模型。圖8分析CD34+CD90+細胞的流程的圖解。通過使用Ficoll-Paque、CD34+陽性篩選試劑盒(磁珠)獲得CBCD34+細胞。然后用肽處理細胞1小時，接著加入細胞因子/生長因子/生長因子(CC100；SCF、FL、IL3和IL6)和胎牛血清(FBS)。隨后，在體外和體內(nèi)對細胞進行分析。圖9用增加CD34+CD90+細胞的化合物進行篩選的實例。用所述化合物處理后，細胞擴增的特性的各種實例。圖10用增加CD34+CD90+細胞的化合物進行篩選。左側(cè)示出了化合物對培養(yǎng)后的CD34和CD90表達的影響。該結(jié)果是2次實驗中的1次的代表性數(shù)據(jù)。右側(cè)描述了在細胞因子/生長因子/生長因子的存在下用所述化合物培養(yǎng)的CD34+細胞的細胞生長。所示數(shù)據(jù)是兩次獨立實驗的平均值。圖11用TSA或MS275進行的離體培養(yǎng)期間的CD34+CD90+表達的變化。通過流式細胞術(shù)對CD34+細胞進行分選和分析。描述了后代的數(shù)量(平均值±SDV)。該子圖顯示了代表性的流式細胞術(shù)的概圖。圖12在離體培養(yǎng)期間用TSA或MS275處理CD34+細胞擴增了CD34+CD90+細胞。(A)用DMSO或TSA培養(yǎng)的CD34+細胞的百分比。(B)用DMSO或TSA培養(yǎng)的CD34+CD90+細胞的百分比。(C)用DMSO或TSA培養(yǎng)的CD34+細胞的絕對數(shù)。(D)用DMSO或TSA培養(yǎng)的CD34+CD90+細胞的絕對數(shù)。(E)用DMSO或MS275培養(yǎng)的CD34+細胞的百分比。(F)用DMSO或MS275培養(yǎng)的CD34+CD90+細胞的百分比。(G)用DMSO或MS275培養(yǎng)的CD34+細胞的絕對數(shù)。(H)用DMSO或MS275培養(yǎng)的CD34+CD90+細胞的絕對數(shù)。各值表示三次獨立實驗的平均值±標準誤。圖13經(jīng)處理細胞的表征。(A)用TSA培養(yǎng)后的大集落以及用DMSO培養(yǎng)后的小集落。所示數(shù)據(jù)代表三次獨立實驗。(B)將集落分為大集落(>50聚類)和小集落(50-5聚類)。白色棒表示小聚類。黑色棒表示大聚類。(C)野生型肽處理對集落形成細胞(CFC)的數(shù)量的影響。對原代CD34+細胞以及用DMSO、TSA和MS275處理的細胞的CFU含量進行測定。各值代表三次獨立實驗的平均值。圖14暴露至TSA或MS275一天限制了CD34+CD90+細胞的表達。用DMSO(右上)、TSA(右中)或MS275(右下)將細胞培養(yǎng)24小時，然后將細胞用PBS洗滌或不洗滌。在第3天和第5天對CD34+CD90+表達進行評價。圖15用TSA處理PBMCCD34+細胞提高了基因插入方法的效率。(A)用TSA或MS275將細胞培養(yǎng)72小時，然后在含有慢病毒顆粒的培養(yǎng)基中感染細胞。然后將培養(yǎng)基移除并用新鮮培養(yǎng)基代替。(B)在第5天用CD34和CD90表達對GFP表達進行分析。(C)具有或不具有CD34表達的GFP陽性細胞。(D)CD34+CD90+細胞和CD34+CD90-細胞的GFP表達。具體實施方式本文中引用的所有參考文獻都以引用的方式整體并入本文進行充分闡述。除非另外定義，否則本文使用的科技術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常所理解的相同的含義。Allen等，Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy，第22版，PharmaceuticalPress(2012年9月15日)；Hornyak等，IntroductiontoNanoscienceandNanotechnology，CRCPress(2008)；Singleton和Sainsbury，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology，第3版，修訂版，J.Wiley&Sons(NewYork，NY2006)；Smith，March’sAdvancedOrganicChemistryReactions，MechanismsandStructure，第7版，J.Wiley&Sons(NewYork，NY2013)；Singleton，DictionaryofDNAandGenomeTechnology，第3版，Wiley-Blackwell(2012年11月28日)；以及Green和Sambrook，MolecularCloning:ALaboratoryManual，第4版，ColdSpringHarborLaboratoryPress(ColdSpringHarbor，NY2012)，為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本申請中使用的許多術(shù)語的通用指導。關(guān)于如何制備抗體的參考文獻，參見Greenfield，AntibodiesALaboratoryManual，第2版，ColdSpringHarborPress(ColdSpringHarborNY，2013)；和Milstein，Derivationofspecificantibody-producingtissuecultureandtumorlinesbycellfusion，Eur.J.Immunol.1976年7月，6(7):511-9；Queen和Selick，Humanizedimmunoglobulins，美國專利號5,585,089(1996年12月)；以及Riechmann等，Reshapinghumanantibodiesfortherapy,Nature，1988年3月24日，332(6162):323-7。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到可用于本發(fā)明的實踐中、與本文描述的方法和材料類似或等同的許多方法和材料。實際上，本發(fā)明并不限于所描述的方法。出于本發(fā)明的目的，下面對以下術(shù)語進行定義。本文所使用的“給予(“Administering”和/或“administer”)”是指用于將藥物組合物遞送至患者的任何途徑。遞送途徑可包括非侵入性口服途徑(經(jīng)口)、局部途徑(皮膚)、經(jīng)粘膜途徑(鼻部、頰/舌下、陰道、眼部和直腸)和吸入途徑及胃腸外途徑以及本領(lǐng)域已知的其它方法。胃腸外途徑是指通常與注射相關(guān)的遞送途徑，包括眼眶內(nèi)注射、輸注、動脈內(nèi)注射、頸動脈內(nèi)注射、囊內(nèi)注射、心內(nèi)注射、皮內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射、肺內(nèi)注射、脊髓內(nèi)注射、胸骨內(nèi)注射、鞘內(nèi)注射、子宮內(nèi)注射、靜脈注射、蛛網(wǎng)膜下注射、囊下注射、皮下注射、經(jīng)粘膜注射或經(jīng)氣管注射。通過胃腸外途徑，組合物可處于用于輸注或注射的溶液或懸浮液的形式，或作為凍干的粉末。本文所使用的“調(diào)節(jié)(“Modulation”或“modulates”或“modulating”)”是指響應的上調(diào)(即激活或刺激)、下調(diào)(即抑制或遏制)或兩者組合或分開。本文所使用的“藥學上可接受的載體”是指可用于本發(fā)明中的常規(guī)的藥學上可接受的載體。本文所使用的“促進(“Promote”和/或“promoting”)”是指細胞或生物體的特定行為的增加。本文所使用的“受試者”包括所有的動物，包括哺乳動物和其它動物，包括但不限于寵物、家畜和動物園動物。術(shù)語“動物”可包括任何活的多細胞脊椎動物生物體，包括例如哺乳動物、鳥、猿、狗、貓、馬、牛、嚙齒動物等種類。同樣，術(shù)語“哺乳動物”包括人和非人哺乳動物。本文所使用的“治療有效量”是指足以在所治療的受試者中實現(xiàn)期望效果的組合物中的特定組合物或活性劑的量。治療有效量可根據(jù)多種因素而變化，包括但不限于受試者的生理狀況(包括年齡、性別、疾病類型和階段、一般身體狀況、對給定劑量的反應性、期望的臨床效果)和給予途徑。臨床和藥理學領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠通過常規(guī)實驗確定治療有效量。本文所使用的“治療(“Treat”、“treating”和“treatment”)”是指治療性處理和預防性或防治性(prophylactic/preventative)措施，其中目的在于預防或減緩(減輕)目標病癥、疾病或疾患(統(tǒng)稱為“病痛”)，即使治療最終不成功。需要治療的對象可包括已患病痛的對象以及易于患病痛的對象或者待預防病痛的人。造血干細胞(HSC)的特性和臨床應用。造血干細胞(HSC)以及它們的原始人造血干/祖細胞(HSPC)對應物擁有在血液和免疫系統(tǒng)內(nèi)自我更新并產(chǎn)生成熟細胞的獨特能力。雖然造血干細胞(HSC)明確在體內(nèi)發(fā)生自我更新分裂，但是體外自我更新的誘發(fā)是困難的。即使經(jīng)過數(shù)十年的研究，對刺激體外自我更新的因素的探求仍在繼續(xù)。HSC和HSPC的自我更新通過內(nèi)在信號和外在信號調(diào)控。已經(jīng)識別了其作用與HSC和HSPC的自我更新相關(guān)的多種因素，包括Notch配體、Wnt3a、血管生成素樣蛋白、前列腺素E2、多效生長因子和SALL4以及同源框蛋白B4。盡管在對支持體內(nèi)造血系統(tǒng)的自我更新和分化的分子因素的了解方面取得了重大進展，但是關(guān)于如何調(diào)節(jié)管控HSC和HSPC的體外和離體自我更新的因素則知之甚少。HSC和HSPC的廣泛的通用性在科學上引起極大興趣，其不僅可獲得自成體外周血(PB)、骨髓、臍帶血(CB)，而且可在體外產(chǎn)生自多能干細胞(PSC)。盡管為了充分確認來自這些類來源中各來源的細胞都相同或至少高度相似需要進行大量研究，但明確的是，所述細胞都將從促進其自我更新和擴增能力的技術(shù)中大大受益。首先，這種能力的展示將有助于在功能上表征差異和相似性。其次，這些細胞群的增加的生產(chǎn)將使它們能夠進行進一步研究，并有助于實現(xiàn)治療上相關(guān)數(shù)量的細胞的生產(chǎn)，該生產(chǎn)迄今為止難以實現(xiàn)。值得注意的是，近年來已在臨床環(huán)境中觀察到CD移植的使用方面的增加，從而為離體擴增的進一步研究呈現(xiàn)了有吸引力的領(lǐng)域。然而，CB作為造血干細胞(HSC)來源的使用受到移植中包含的HSC數(shù)量和可能的原始HSPC群的限制。為了改善結(jié)果并擴展CB移植的適用性，一個潛在的解決方案是CB的離體擴增。這也是基因治療方法中的HSC的體外操作的關(guān)鍵。盡管為了富集新鮮分離的HSC和可能的原始HSPC，除CD34之外，已對細胞表面標志物(例如CD38、CD45RA、CD49f和CD90)進行了研究，還認為具有CD34和CD90的共同表達的細胞對離體培養(yǎng)后的骨髓再增殖潛能負責。因此，有興趣了解CD34+CD90+是否能夠決定骨髓再增殖細胞的擴增。表觀遺傳狀態(tài)在命運決定中的作用。重要的是，如果HSC和HSPC命運通過在離體擴增期間被下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子(TF)加以掌控，TF則能夠在細胞分裂期間通過“標記”表觀遺傳記憶起到維持HSC和HSPC識別性的作用。因此，細胞因子/生長因子/生長因子和表觀遺傳修飾因子的組合能夠在細胞分裂期間擴增HSC和HSPC或有利于自我更新，這被認為至少部分通過維持的TF介導。鑒于CD34+CD90+細胞的有希望的候選群的擴增能力，本文描述的是聚焦于人CD34+CD90+細胞的人HSC的自我更新特性，以評價足以維持和擴增HSC和HSPC細胞的離體培養(yǎng)條件的可能性。如果能夠建立此類方法，可通過對以下的靶向、特異性修飾來進一步提高基因治療方法的效率(包括傳統(tǒng)的基因治療方法)：HSPC的遺傳學信息或基因組、或轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶(TALEN)、鋅指核酸酶(ZFN)或與成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列(CRISPR)相關(guān)的核酸內(nèi)切酶蛋白(Cas)系統(tǒng)。建立離體擴增方法以及改進的基因組編輯方法將提供免疫學上可變的移植材料的可再生資源，從而滿足長期未實現(xiàn)的迫切和緊急的臨床需求?；蚪M編輯。鑒于需要確立移植材料的免疫相容性，基因組工程學是用于再生醫(yī)學應用的強大工具。位點特異性染色體整合可靶向期望的核苷酸變化，包括：在染色體內(nèi)的安全著陸位點引入治療性基因盒、破壞特定的等位基因的編碼或非編碼區(qū)域以及校正遺傳突變以逆轉(zhuǎn)疾病表型。最近開發(fā)的使用核酸酶(例如鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶(TALEN)以及與成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列(CRISPR)相關(guān)的核酸內(nèi)切酶蛋白(Cas)系統(tǒng))的方法學能夠使雙鏈斷裂以提高基因靶向的頻率。簡言之，使用諸如ZFN的工具進行的基因組編輯可基于位點特異性的DNADSB向感興趣的基因座中的引入，。該過程的關(guān)鍵是經(jīng)由同源介導修復(HDR)或非同源末端結(jié)合(NHEJ)途徑用于有效修復DSB的細胞修復機制。這些DNA修復途徑的機制可產(chǎn)生限定的遺傳結(jié)果。例如，NHEJ修復可快速且有效地連接兩個斷裂末端，提供獲得或喪失遺傳信息的機會，使得能夠在斷裂位點處進行小的插入和/或刪除，從而能夠?qū)谢蚱茐??；蛘?，與ZFN組合提供了特異性設(shè)計的同源供體DNA，這一模板可引起基因校正或插入。由于需要細胞或組織移植(例如HSC移植)的人數(shù)遠遠大于適于移植的細胞和組織的可得到的供應，用于臨床應用的HSC中的基因組編輯的一個實例包括建立與受體在免疫學上相容的細胞。HLA是細胞表面上的蛋白，該蛋白幫助免疫系統(tǒng)將細胞識別為自身的或非自身的(外來的或來自體外)，并且通過形成位于人染色體6上的區(qū)域(稱為主要組織相容性復合物或MHC)的基因簇編碼，從而認識到MHC基因座編碼的蛋白在移植排斥中的重要作用(因此，HLA蛋白也被稱為MHC蛋白)。對于沒有匹配的相關(guān)供體的患者，通過搜索供體庫可向人提供匹配的HLA類型，盡管獲得受體的MHC蛋白與移植物的MHC蛋白之間的良好匹配幾乎是不可能的。為了提供與更大的患者群組具有廣泛的免疫相容性的細胞，HSC的產(chǎn)生和操作(例如建立同源或半合子的HLA細胞)將極大地有助于移植材料的可用性。在用于輸血的可用血液中存在類似需求，對于具有獨特血型的患者(Rh+的患者)來說尤其如此。O型和Rh陰性的造血細胞的產(chǎn)生可通用于輸血。產(chǎn)生和操作HSC的能力將極大地有益于人類疾病的治療和管理。額外的實例包括用于患有遺傳突變導致的疾病的患者的基因治療技術(shù)?；蚪M編輯的增強的機會將使離體改變自體供體材料的目標得到充分實現(xiàn)，以在校正遺傳缺陷后將其返回。目前限制基因靶向方法的是HR在大多數(shù)細胞中發(fā)生的頻率極低。與小鼠和酵母中使用的HR誘導靶向的常規(guī)方法相比，各種ZFN、TALEN和Cas系統(tǒng)特別是在靶基因座中的基因組內(nèi)產(chǎn)生位點特異性DSB能夠通過將HR的頻率提高數(shù)倍來促進基因靶向。這些新技術(shù)對于基因組工程學而言具有巨大前景，盡管產(chǎn)生特異性的ZFN、TALEN或Cas系統(tǒng)在技術(shù)上仍然極具挑戰(zhàn)性且耗時，因此限制了研究人員對它們的廣泛使用。這些基因組工程學方法仍然受限于HR事件(尤其是在人多能干細胞(PSC)、HSPC和HSC中)的低頻率。如本文進一步描述的，觀察到小分子藥物和細胞因子/生長因子/生長因子的組合可潛在地應用于經(jīng)純化的CD34+CD90+人臍帶血或外周流動的干/祖細胞(PBSC)CD34+細胞的擴增，包括用諸如TSA、MS-275或DOT1抑制劑的藥物化合物進行處理。當與經(jīng)對照處理的組比較時，經(jīng)藥物化合物處理的CD34+細胞在體外產(chǎn)生的擴增為原始HSPC(CD34+CD90+)的11倍至16倍。TSA還促進CD34+細胞的離體的慢病毒轉(zhuǎn)導。此外，在TSA或MS275藥物處理后，本發(fā)明人觀察到牽涉HSPC功能的HoxA9、HoxB4、GATA-2和SALL4基因的表達增高。這些結(jié)果表明表觀遺傳修飾因子可以影響HSPC功能以及許多關(guān)鍵基因的表達。本文描述的是擴增造血細胞的方法，所述方法包括：(a)提供一批量的造血細胞；以及(b)在至少一種小分子和至少一種生長因子的存在下對所述量的造血細胞進行培養(yǎng)，其中，所述至少一種小分子和至少一種生長因子能夠擴增造血細胞。在不同的實施方式中，造血細胞是造血干細胞(HSC)。在不同的實施方式中，造血細胞是造血干祖細胞(HSPC)。任選地，HSPC是表達CD34+和/或CD90+的細胞。在其它實施方式中，造血細胞(例如造血干細胞(HSC)或造血干祖細胞(HSPC))表達一種或多種標志物，包括Lin-、CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA-。在其它實施方式中，造血細胞(例如造血干細胞(HSC)或造血干祖細胞(HSPC))表達HOXB4、BMI1、GATA2、p21、p27、c-myc和MPO。在不同的實施方式中，所述造血細胞分離自臍帶血。在不同的實施方式中，所述造血細胞分離自骨髓。在不同的實施方式中，所述造血細胞分離自外周血。在不同的實施方式中，所述至少一種小分子是組蛋白脫乙酰酶抑制劑(HDACi)。在不同的實施方式中，所述HDACi包括選自下組的一種或多種HDACi：曲古抑菌素(TSA)、DLS3、MS275、SAHA和HDAC6抑制劑161。在不同的實施方式中，所述至少一種小分子包括選自下組的一種或多種小分子：5-氮雜胞苷、JQ1-S、JY1、UNC0638、JMJD3、JQ-EZ-05、SR1、DBZ、dmPGE2和UM171。在各種實施方式中，這些小分子的濃度可包括約2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM以上，或約25nM、50nM、100nM、150nM、250nM、500nM以上，或約500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1000nM以上，或約1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM以上，在圖1中示出了多種實施例。在不同的實施方式中，所述至少一種生長因子包括選自下組的一種或多種生長因子：干細胞因子(SCF)、flt3配體(FL)、白介素-3(IL3)和白介素-6(IL6)。在各種實施方式中，這些生長因子的濃度可包括例如約100ng/mlFL、約100ng/mlSCF、約20ng/mlIL-3和約20ng/mlIL-6。在其它實施方式中，這些生長因子的濃度可包括約200ng/ml-500ng/mlFL、約20ng/ml-1000ng/mlSCF、約5ng/ml-500ng/mlIL-3和約5ng/ml-500ng/mlIL-6。在其它實施方式中，所述生長因子包括早期的細胞因子/生長因子/生長因子，例如EPO、TPO、FL、VEGF、BMP(如BMP2、BMP4和BMP7)、GM-CSF、G-CSF和HOXB4。在一些實施方式中，在甲基纖維素培養(yǎng)基的存在下對造血細胞(例如造血干細胞(HSC)或造血干祖細胞(HSPC))進行培養(yǎng)，以促進成血管細胞生長。在不同的實施方式中，在至少一種小分子和至少一種生長因子的存在下對所述一批量的造血細胞進行培養(yǎng)，其中，所述至少一種小分子和至少一種生長因子存在至少48小時、72小時、96小時、120小時、144小時或168小時的時間段。本文進一步描述的是所述方法還涉及造血細胞(例如造血干細胞(HSC)或造血干祖細胞(HSPC))的體外擴增，以產(chǎn)生用于各種商業(yè)和臨床應用的的大量細胞。這包括例如至少10,000個、100,000個或500,000個細胞。在一些實施方式中，細胞制劑包含至少1×106個造血細胞。在其它實施方式中，細胞制劑包含至少2×106個造血細胞，且在進一步的實施方式中，包含至少3×106個造血細胞。在另外的實施方式中，細胞制劑包含至少4×106個造血細胞。本發(fā)明涉及包含10,000個至4百萬個以上的人造血細胞的溶液、制劑和組合物。此類溶液、制劑和組合物中的造血細胞的數(shù)量可以是10,000至4百萬以上的范圍內(nèi)的任何數(shù)量。該數(shù)量可以是例如20,000、50,000、100,000、500,000、1百萬等。本發(fā)明進一步涉及生產(chǎn)、儲存和分配造血細胞的方法。在一些實施方式中，本發(fā)明提供了造血細胞在制備藥物中的用途，以治療有需要的患者中的病癥?；蛘?，本發(fā)明提供了細胞培養(yǎng)物在制備藥物中的用途，以治療有需要的患者中的病癥。本發(fā)明還提供了藥物制劑在制備藥物中的用途，以治療有需要的患者中的病癥。在各種實施方式中，擴增人造血細胞包括從任何來源(包括來自胎盤或臍帶組織的臍帶血、外周血、骨髓、胚胎干細胞、誘發(fā)的多能干細胞或其它組織)或通過本領(lǐng)域已知的任何其它方法獲得造血細胞。在一些實施方式中，造血細胞(例如造血干細胞(HSC)或造血干祖細胞(HSPC))可進一步分化為造血細胞(包括但不限于血細胞(如巨核細胞、血小板、紅細胞))、或免疫細胞(如天然殺傷細胞或樹突細胞)。此類細胞可用于移植或輸血。本發(fā)明的方法使得造血細胞(例如造血干細胞(HSC)或造血干祖細胞(HSPC))能夠進行離體擴增，以用于可將自體組織移植用來治療疾病和/或病癥的多種治療方法。在其它示例中，異源組織移植可用來治療疾病和/或病癥，包括例如受試者的家族親屬。在一些示例中，這包括例如基因治療的作用。本文進一步描述的是基因組編輯的方法，所述方法包括：(a)提供一批量的造血細胞；以及(b)在至少一種小分子和至少一種生長因子的存在下對所述量的造血細胞進行培養(yǎng)；(c)使所述細胞與一種或多種載體接觸，各載體編碼至少一種選擇盒和/或至少一種核酸酶，以及選擇表達所述選擇盒和所述核酸酶的造血細胞，其中表達所述選擇盒和所述核酸酶的細胞包含經(jīng)編輯的基因組。在不同的實施方式中，細胞是造血干細胞(HSC)。在不同的實施方式中，多能干細胞是造血干祖細胞(HSPC)。任選地，HSPC是表達CD34+和/或CD90+的細胞。在其它實施方式中，造血細胞(例如造血干細胞(HSC)或造血干祖細胞(HSPC))表達一種或多種標志物，包括Lin-、CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA-。在其它實施方式中，造血細胞(例如造血干細胞(HSC)或造血干祖細胞(HSPC))表達HOXB4、BMI1、GATA2、p21、p27、c-myc和MPO。在不同的實施方式中，至少一種核酸酶是鋅指核酸酶(ZFN)。在不同的實施方式中，至少一種核酸酶是轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應物核酸酶(TALEN)。在不同的實施方式中，至少一種核酸酶是與CRISPR相關(guān)的蛋白(Cas)核酸酶。在不同的實施方式中，一種或多種載體包括編碼至少一種選擇盒和至少一種核酸酶的載體。在不同的實施方式中，所述量的造血細胞分離自臍帶血、骨髓或外周血。本文還描述了基因組編輯的方法，所述方法包括：(a)提供一批量的造血細胞；以及(b)在至少一種小分子和至少一種生長因子的存在下對所述量的造血細胞進行培養(yǎng)；(c)使所述細胞與一種或多種載體接觸，各載體編碼至少一種選擇盒和/或至少一種核酸酶，以及選擇表達所述選擇盒和所述核酸酶的造血細胞，其中表達所述選擇盒和所述核酸酶的細胞包含經(jīng)編輯的基因組；以及(d)向受試者中給予所選擇的造血細胞。在不同的實施方式中，造血細胞與受試者免疫相容。本文還描述了通過基因組編輯的方法生產(chǎn)的一批量的細胞，所述方法包括：(a)提供一批量的造血細胞；以及(b)在至少一種小分子和至少一種生長因子的存在下對所述量的造血細胞進行培養(yǎng)；(c)使所述細胞與一種或多種載體接觸，各載體編碼至少一種選擇盒和/或至少一種核酸酶，以及選擇表達所述選擇盒和所述核酸酶的造血細胞，其中表達所述選擇盒和所述核酸酶的細胞包含編輯的基因組。本文進一步描述了離體擴增造血細胞的方法，所述方法包括：(a)從臍帶血、骨髓或外周血獲得一批量的造血干細胞(HSC)或造血干祖細胞(HSPC)；以及(b)在(i)至少一種小分子和(ii)至少一種生長因子的存在下，通過培養(yǎng)HSC或HSPC將HSC或HSPC擴增至少48小時的時間段，從而使HSC或HSPC得以擴增，所述至少一種小分子選自曲古抑菌素(TSA)、DLS3、MS275、SAHA、HDAC6抑制劑161、5-氮雜胞苷、JQ1-S、JY1、UNC0638、JMJD3、JQ-EZ-05、SR1、DBZ和dmPGE2的組，所述至少一種生長因子選自干細胞因子(SCF)、flt3配體(FL)、白介素-3(IL3)和白介素-6(IL6)的組。在各種實施方式中，這些生長因子的濃度可包括例如約100ng/mlFL、約100ng/mlSCF、約20ng/mlIL-3和約20ng/mlIL-6。在其它實施方式中，生長因子包括早期的細胞因子/生長因子/生長因子，例如EPO、TPO、FL、VEGF、BMP(如BMP2、BMP4和BMP7)、GM-CSF、G-CSF和HOXB4。在一些實施方式中，在甲基纖維素培養(yǎng)基的存在下培養(yǎng)造血細胞(例如造血干細胞(HSC)或造血干祖細胞(HSPC))，以促進成血管細胞生長。在其它實施方式中，這些生長因子可包括如下的濃度：約200ng/ml-500ng/mlFL、約20ng/ml-1000ng/mlSCF、約5ng/ml-500ng/mlIL-3和約5ng/ml-500ng/mlIL-6。在不同的實施方式中，獲得一批量的HSPC包括對表達CD34+和/或CD90+的細胞進行分離。在不同的實施方式中，至少48小時的時間段包括72小時、96小時、120小時、144小時或168小時。本文進一步描述了治療受試者的疾病或病癥的方法，所述方法包括：(a)從來自需要治療疾病或病癥的受試者的臍帶血、骨髓或外周血獲得一批量的造血細胞(例如造血干細胞(HSC)或造血干祖細胞(HSPC))；(b)通過在至少一種小分子和至少一種生長因子的存在下進行培養(yǎng)，對所述量的造血細胞進行擴增，其中所述至少一種小分子和至少一種生長因子能夠擴增所述造血細胞；以及(c)向受試者給予所述造血細胞。在不同的實施方式中，所述造血細胞與受試者免疫相容。在一些實施方式中，在向受試者中給予所述造血細胞之前，使所述細胞與一種或多種載體接觸，各載體編碼至少一種選擇盒和/或至少一種核酸酶，以及選擇表達所述選擇盒和所述核酸酶的造血細胞，其中表達所述選擇盒和所述核酸酶的細胞包含經(jīng)編輯的基因組。在一些實施方式中，造血細胞(例如造血干細胞(HSC)或造血干祖細胞(HSPC))獲得自需要治療的受試者的家族親屬。在不同的實施方式中，造血細胞是造血干細胞(HSC)。在不同的實施方式中，造血細胞是造血干祖細胞(HSPC)。任選地，HSPC是表達CD34+和/或CD90+的細胞。在其它實施方式中，造血細胞(例如造血干細胞(HSC)或造血干祖細胞(HSPC))表達一種或多種標志物，包括Lin-、CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA-。在其它實施方式中，造血細胞(例如造血干細胞(HSC)或造血干祖細胞(HSPC))表達HOXB4、BMI1、GATA2、p21、p27、c-myc和MPO。在不同的實施方式中，至少一種小分子是組蛋白脫乙酰酶抑制劑(HDACi)。在不同的實施方式中，HDACi包括選自下組的一種或多種HDACi：曲古抑菌素(TSA)、DLS3、MS275、SAHA和HDAC6抑制劑161。在不同的實施方式中，至少一種小分子包括選自下組的一種或多種小分子：5-氮雜胞苷、JQ1-S、JY1、UNC0638、JMJD3、JQ-EZ-05、SR1、DBZ、dmPGE2和UM171。在各種實施方式中，這些小分子的濃度可包括(圖1中示出了多種實例)：約2nM、3nM、4nM、5nM、6nM、7nM、8nM、9nM、10nM以上，或約25nM、50nM、100nM、150nM、250nM、500nM以上，或約500nM、600nM、700nM、800nM、900nM、1000nM以上，或約1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM或10μM以上。在不同的實施方式中，至少一種生長因子包括選自下組的一種或多種生長因子：干細胞因子(SCF)、flt3配體(FL)、白介素-3(IL3)和白介素-6(IL6)。在各種實施方式中，這些生長因子的濃度可包括例如約100ng/mlFL、約100ng/mlSCF、約20ng/mlIL-3和約20ng/mlIL-6。在其它實施方式中，這些生長因子可包括如下濃度：約200ng/ml-500ng/mlFL、約20ng/ml-1000ng/mlSCF、約5ng/ml-500ng/mlIL-3和約5ng/ml-500ng/mlIL-6。在其它實施方式中，生長因子包括早期的細胞因子/生長因子/生長因子，例如EPO、TPO、FL、VEGF、BMP(如BMP2、BMP4和BMP7)、GM-CSF、G-CSF和HOXB4。在一些實施方式中，在甲基纖維素培養(yǎng)基的存在下培養(yǎng)造血細胞(例如造血干細胞(HSC)或造血干祖細胞(HSPC))，以促進成血管細胞生長。在不同的實施方式中，在至少一種小分子和至少一種生長因子的存在下對所述量的造血細胞進行培養(yǎng)，其中所述至少一種小分子和至少一種生長因子用于至少48小時、72小時、96小時、120小時、144小時或168小時的時間段。實施例實施例1CB和PBMCCD34+細胞的分離和離體培養(yǎng)根據(jù)由DF/HCC機構(gòu)審查委員會設(shè)立的規(guī)章，從Dana-Faber癌癥研究所(Dana-FaberCancerInstitute，DF/HCC；Boston，MA)的細胞操作核心設(shè)施(CellManipulationCoreFacility)獲得新鮮的CB集合。在Ficoll-Paque(StemCellTechnologies，Vancouver，BC，加拿大)上通過密度離心對CB細胞進行分離，并使用CD34陽性細胞分離試劑盒(StemCellTechnologies)對該細胞進行富集。CD34+細胞純度的范圍為60％至90％。將細胞分配為2×104/孔，并在含有30％胎牛血清(FBS；GIBCO)的IMDM中孵育，所述胎牛血清補充有CC100(SCF、FL、IL3和IL6；StemCellTechnologies)。除非另有說明，貫穿所描述的方法，適當時將結(jié)果表示為平均值±SDV。使用學生t檢驗評價統(tǒng)計學差異，顯著性p為0.05以下。實施例2CBCD3+細胞的CFU分析將H4434(StemCellTechnologies)培養(yǎng)基的試管在4℃的冰箱中解凍過夜。第二天早晨，以所需的終濃度的10倍準備CBCD34+細胞。制備2000個細胞/0.3mL的細胞懸浮液。將細胞加入至3mL培養(yǎng)基中用于兩重復培養(yǎng)。使用連接至3cc注射器的16號平端針，將細胞和培養(yǎng)基分配到培養(yǎng)皿中。各個35mm培養(yǎng)皿分配1.1mL細胞。將兩個培養(yǎng)皿放置于100mm的有蓋培養(yǎng)皿中，另外放入含有3mL無菌水的第三個無蓋的35mm培養(yǎng)皿。然后將這3個培養(yǎng)皿均覆蓋在所述的100mm的有蓋培養(yǎng)皿中。將細胞在37℃以及5％CO2和≥95％濕度下孵育14天-16天。以亮視野觀察BFU-E、CFU-GM和CFU-混合集落。在顯微鏡下對CFU進行計數(shù)。實施例3流式細胞術(shù)分析用如下對細胞進行染色：綴合至藻紅蛋白(PE)或別藻藍蛋白(APC)的抗人CD34單克隆抗體；綴合異硫氰酸熒光素(FITC)或APC、CD38APC、CD3三色(TC)、CD19TC、CD11bTC、CD41TC、CD45FITC和小鼠CD45APC的抗人CD90抗體。使用FACSCalibur流式細胞儀(BectonDickinson，SanJose，CA，USA)收集流式細胞術(shù)數(shù)據(jù)，和/或使用FLOWJO軟件對其進行分析。實施例4標記羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯以評估細胞分裂將原代CD34+細胞在37℃下用0.5μM的處于PBS中的羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(CSFE；Invirtogen，NY，USA)標記10分鐘。培養(yǎng)9天后，將細胞用CD34PE標記，并使用FACSCalibur流式細胞儀對CSFE的熒光強度的進行性下降進行分析。實施例5NSG小鼠中的CD34+細胞的植入將NSG(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ，TheJacksonLaboratory，ME，USA)小鼠在波士頓兒童醫(yī)院動物設(shè)施中飼養(yǎng)和維持。所有動物工作均已根據(jù)10-101832協(xié)議下的IACUC的規(guī)章批準并完成。通過尾靜脈，將用野生型肽和混雜肽處理的CBCD34+細胞經(jīng)靜脈注射到亞致死性照射的(220rads)8-16周齡的NSG小鼠中。在照射后24小時內(nèi)進行植入。在移植后2周和8周監(jiān)測外周血(PB)嵌合狀態(tài)。在移植后8周，監(jiān)測骨髓(BM)嵌合狀態(tài)。隨后使用FITC-綴合的抗人CD45抗體和APC-綴合的抗小鼠CD45抗體(eBiosciences，CA，USA)使這些樣品接受流式細胞術(shù)分析。按照以下計算人CD45+細胞的百分比：人CD45+細胞％＝人CD45+細胞數(shù)/(人CD45+細胞數(shù)+小鼠CD45+細胞數(shù))×100。將0.1％人CD45+細胞的閾值設(shè)定為陽性植入的可靠預測值。實施例6實時PCR本發(fā)明人使用TRIzol(Invitrogen)從用野生型或混雜的肽處理的細胞中制備RNA。本發(fā)明人使用iScriptcDNASynthesis試劑盒(Bio-Rad，CA，USA)合成cDNA。為了定量mRNA表達的水平，本發(fā)明人使用具有SYBERGreen(Bio-Rad)的iScriptone-stepRT-PCR試劑盒進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增，并通過使用SYBRgreen技術(shù)(ABI，F(xiàn)osterCity，CA，USA)對PCR產(chǎn)物進行檢測。將GAPDH用作內(nèi)源對照。所有試樣以兩重復進行操作。熱循環(huán)儀條件為：50℃2分鐘，95℃10分鐘，95℃0.30分鐘進行45個循環(huán)，以及60℃1分鐘。結(jié)果作為循環(huán)閾值(Ct)獲得，并將其歸一化為用GAPDH進行的基因表達。使用CFXManager軟件(Bio-Rad)基于2-ΔΔCT方法來分析數(shù)據(jù)。對于QPCR引物，參見表1。表1.QPCR引物實施例7慢病毒生產(chǎn)和轉(zhuǎn)導通過用慢病毒載體pLL3.7、pHR'8.9ΔVPR和pCMV-VSVG對293T細胞進行瞬時共轉(zhuǎn)染來產(chǎn)生慢病毒顆粒。在含有慢病毒顆粒和8μg/ml魚精蛋白的培養(yǎng)基中感染CD34+細胞。然后將培養(yǎng)基移除并用新鮮培養(yǎng)基代替。實施例8包括表觀遺傳修飾因子的化合物的篩選，所述化合物增多CD34+CD90+細胞據(jù)報道一些化合物(如TSA、具有5氮雜胞苷的TSA、丙戊酸、Chlamydocin和Trapoxin)擴增CD34+CD90+細胞。為了識別或確認擴增CD34+CD90+細胞的分子，本發(fā)明人使用來自PBSC的原代人CD34+細胞開發(fā)了分析法，并在培養(yǎng)4天或5天后通過高通量流式細胞術(shù)評價了CD34和CD90表達。使用這一分析法，本發(fā)明人對FDA批準的446種化合物和14種小分子藥物進行篩選，包括表2所示的一組表觀遺傳修飾因子。將人PBSCCD34+細胞進行純化并在具有胎牛血清(FBS；GIBCO；終濃度為30％)和CC100(含有如下的CD34維持培養(yǎng)基；StemCellTechnologies：干細胞因子，SCF；Flt3配體，F(xiàn)L；白介素-3，IL3；以及白介素-6，IL6)的IMDM中進行培養(yǎng)。在圖8中總結(jié)了離體培養(yǎng)方法。觀察到與經(jīng)DMSO處理的CD34+細胞相比，TSA、DLS3、MS275、SAHA、UNC0638或SR1擴增了CD34+CD90+群(圖1A、圖9和圖10)，而FDA批準的446種化合物的調(diào)查針對這一目的未產(chǎn)生潛在命中(數(shù)據(jù)未示出)。由于這些化合物的大多數(shù)影響后代的總細胞數(shù)，對CD34+CD90+細胞的絕對數(shù)進行計算。TSA、MS275和JY1擴增的CD34+CD90+細胞的絕對數(shù)超過了其它化合物擴增的該細胞的絕對數(shù)(圖1B)。這些發(fā)現(xiàn)表明表觀遺傳修飾因子(特別是除HDAC6抑制劑之外的組合蛋白脫乙酰酶抑制劑(HDACi))優(yōu)先擴增CD34+CD90+細胞，而FDA批準的446種化合物并未擴增CD34+CD90+細胞。表2.分析法中的表觀遺傳修飾因子名稱功能TSA泛HDAC抑制劑DLSJHDAC112抑制劑MS275HDAC113抑制劑SAHA泛HADC抑制劑：HDAC6161HDAC6抑制劑5-氮雜胞苷低甲基化劑JQ1-SBET抑制劑JY1DOT1L抑制劑UNC0638H3K9me2甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑JMJDJ組蛋白HJLys27(H3K27)脫甲基酶抑制劑JQ-EZ-05EZH2抑制劑；H3K27me3甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑SR1芳烴受體的拮抗劑DBZγ分泌酶抑制劑dmPGE2穩(wěn)定的前列腺素E2(PGE2)衍生物實施例9在離體培養(yǎng)期間，PBMCCD34+細胞中的TSA或MS-275使CD34+CD90+細胞優(yōu)先擴增為了進一步研究TSA或MS-275在PBSCCD34+細胞擴增中的作用，如圖11、圖12B和圖12F所示，與經(jīng)DMSO處理的細胞相比，TSA處理使CD34+CD90+細胞在第3天、第5天和第7天優(yōu)先擴增(p<0.05)。與經(jīng)DMSO處理的細胞相比，在經(jīng)MS275處理的細胞中看到類似的結(jié)果(p<0.05)。相反，用TSA和MS275的生長率比起用DMSO的生長率低約2倍(圖3A；DMSO10.7×104±1.12vsTSA28.3×104±0.49；p<0.05，vsMS27516.7×104±1.06)。通過定量CD34+(圖11、圖12C和圖12G)和CD34+CD90+(圖11、圖12D和圖12H)亞群的絕對細胞數(shù)，觀察到通過TSA或MS275處理的CD34+CD90+細胞的絕對數(shù)從第5天至第7天增加。為了評估經(jīng)TSA處理的培養(yǎng)物中觀察到的較低的總的有核細胞數(shù)是否歸因于分化或增殖方面的延遲，本發(fā)明人進行了細胞-分裂-監(jiān)測染料羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)分析、熒光細胞質(zhì)染色，這使得在體外培養(yǎng)后能夠?qū)D34+細胞的細胞分裂進行計數(shù)。雖然66.0％的未處理的CD34+細胞在第5天時分裂至少超過4次，但僅9.02％的經(jīng)TSA處理的細胞經(jīng)歷了類似數(shù)量的細胞分裂(圖3B)。在第7天觀察到類似的結(jié)果(圖3B)。然后，本發(fā)明人研究了TSA處理是否如表面標志物所評估的通過自我更新增殖使CD34+CD90+細胞增加。使用CD34+CD90-細胞作為對照群，在體外培養(yǎng)5天和7天后，使用CSFE分析法對TSA處理時的CD34+CD90+細胞的細胞分裂概況進行分析。有趣的是，雖然31.4％的CD34+CD90+細胞分裂較少，但在第5天時約66.7％的細胞比起CD34+CD90-細胞分裂得更多。在第7天觀察到類似的結(jié)果(圖3D)。為了研究在經(jīng)TSA處理的培養(yǎng)物中觀察到的較低的總的有核細胞數(shù)是否可能歸因于細胞凋亡，在第3天、第5天和第7天對經(jīng)TSA、MS275或DMSO處理的細胞進行膜聯(lián)蛋白V染色。觀察到50nMTSA和500nMMS275并沒有顯著增加凋亡的細胞(圖3E)?？傊?jīng)TSA處理的CD34細胞的較低擴增率似乎是起因于較慢的細胞分裂，而非起因于細胞凋亡的誘發(fā)。所述數(shù)據(jù)表明，TSA處理誘發(fā)CD34+CD90+細胞的自我更新增殖，雖然細胞分裂速率較慢且分化趨勢較弱。實施例10用TSA或MS-275處理CBCD34+細胞增強了體內(nèi)骨髓再生潛能由于CD34+CD90+細胞是具有嚴重的聯(lián)合免疫缺陷(SCID)再增殖活性(SRA)的CD34+亞群，本發(fā)明人接下來測試了通過TSA或MS-275處理介導的此類細胞的優(yōu)先擴增是否能夠產(chǎn)生增加的體外造血分化/增殖和SRA體內(nèi)植入。本發(fā)明人首先用TSA或MS-275處理對PBMCCD34+細胞進行了處理，接著對甲基纖維素中的體外集落形成進行了評估。涂布后8天，衍生自CFU-GM的大多數(shù)的經(jīng)TSA或MS275處理的集落比起對照組大得多(圖13A)。為了對大集落和小集落定量，本發(fā)明人分別將大集落分類為>50聚類，并將小集落分類為5-50聚類。然而經(jīng)細胞因子/生長因子處理的細胞產(chǎn)生高比例的小集落，經(jīng)TSA處理的細胞主要產(chǎn)生大集落(圖13B)。涂布后14天，與其它對照組相比，PBMCCD34+細胞的處理產(chǎn)生集落形成細胞(CFC)含量的類似分布(圖13C)，其中盡管BFU-E的百分比略微增加，大多數(shù)集落仍是CFUGM。在用細胞因子/生長因子以及用單獨的細胞因子或TSA對CBCD34+細胞進行培養(yǎng)期間，從第5天到第7天總細胞數(shù)顯著增加?；谏鲜龅捏w外表型分析，在用單獨的細胞因子或TSA培養(yǎng)5天或7天后，本發(fā)明人將細胞移植到NSG小鼠中，以評價作為增強的HSPC功能的量度的免疫缺陷(SCID)再增殖活性(SRA)。由于Vanheuden等報道了通過體外培養(yǎng)后的CD34+CD38CD90+CD45RA-細胞介導了嚴重的聯(lián)合免疫缺陷(SCID)再增殖活性(rSRA)，本發(fā)明人在移植2周后首次分析了外周血(PB)中的SRA活性。本發(fā)明人觀察到，與用細胞因子處理的CBCD34+細胞的后代相比，用TSA處理的2×104個CBCD34+細胞的第5天的后代移植的小鼠具有更高的人CD45+植入百分比(通過≥0.1％人CD45+細胞定義)(圖4)。實施例11用TSA處理PBMCCD34+細胞增加了基因插入方法的效率接下來，本發(fā)明人研究了通過TSA進行的CD34+CD90+細胞的擴增是否能夠影響慢病毒轉(zhuǎn)導效率。將編碼綠色熒光蛋白(GFP)的轉(zhuǎn)移載體用于評價慢病毒轉(zhuǎn)導。用或不用TSA對PBMCCD34+細胞培養(yǎng)3天，接著用魚精蛋白進行兩次48小時的慢病毒轉(zhuǎn)導(圖15A)。觀察到用TSA處理的CD34+GFP+細胞的百分比比起未處理的細胞的百分比更高(圖15B和圖15C)。有趣的是，與CD34+CD90+細胞相比，CD34+CD90-細胞中的GFP陽性細胞的百分比更高(圖15B和圖15D)。這些數(shù)據(jù)表明TSA促進了離體CD34+細胞的慢病毒轉(zhuǎn)導。實施例12用TSA處理PBSCCD34+細胞調(diào)節(jié)干細胞相關(guān)基因的表達接下來，為了研究對TSA處理后觀察到的功能性HSC和HSPC擴增負責的分子機制，本發(fā)明人使用實時PCR檢查了參與干細胞的自我更新或分化的許多基因的表達水平。本發(fā)明人在用TSA處理的細胞中觀察到GATA1、GATA2、HOXA9、HOXB4、PTEN、SALL4、p53、TPO和CD34基因的更高水平的轉(zhuǎn)錄物(圖6；p<0.05)，表明這些因子在PBSCCD34+細胞中有助于增強的增高的自我更新性質(zhì)。實施例13討論將在異種移植中起始植入的造血細胞在操作上被定義為SCID再增殖細胞(SRC)。這一模型為測量人HSC活性提供了體內(nèi)直接定量分析，且Lin-CD34+CD38-CD90+CD45RA-臍帶血部分在SRC活性方面得到增強。在其它方面，據(jù)報道新鮮干細胞在培養(yǎng)后失去自我更新功能，而CD34+CD38-細胞方面的增加與SRC無關(guān)。因此，其它HSC標志物(如CD90)已被用于確認培養(yǎng)物中的原始HSPC候選亞群。在用細胞因子/生長因子進行的CD34+細胞體外培養(yǎng)期間，SCID再增殖細胞活性與分裂不超過2次的CD90+細胞相關(guān)。多個研究人員報道，原始HSC比起相對定向的細胞分裂更慢。雖然HSC在體內(nèi)緩慢循環(huán)，但在各種細胞因子組合的存在下，CD34+細胞快速循環(huán)并在培養(yǎng)中經(jīng)歷重復的細胞分裂，通常導致產(chǎn)生大量的分化的祖細胞，但骨髓再增殖細胞的數(shù)量下降。有趣的是，即使已在細胞因子/生長因子的存在下在培養(yǎng)中經(jīng)歷了5到10次細胞分裂后，暴露至表觀遺傳調(diào)節(jié)劑(例如5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5azaD)和曲古抑菌素(TSA))的臍帶血CD34+CD90+細胞維持了可分析的SRC，并具有人的多系造血細胞植入的證據(jù)。這表明在合適的離體培養(yǎng)條件下，人們或許能夠擴增HSC和/或HSPC而不犧牲它們的干細胞特性。多個報道進一步顯示出用HDAC抑制劑處理臍帶血CD34+細胞誘發(fā)了組蛋白H4乙?；妥晕腋禄虻谋磉_以及CD34+CD90+群的擴增。本發(fā)明人觀察到，盡管與對照相比總的有核細胞以及CD34+細胞的擴增率較低，TSA使培養(yǎng)中的CD34+CD90+細胞緩慢擴增，并增加了SRA。CD34+CD90+細胞的擴增和緩慢分裂的這些特征與原始HSPC的固有特性一致。據(jù)報道通過在培養(yǎng)中的CD34+CD38-CD90+CD45RA-細胞介導了快速的嚴重的聯(lián)合免疫缺陷(SCID)再增殖活性(rSRA)，并且長期SRC(LT-SRC)限于處于培養(yǎng)細胞中的CD34+CD90+細胞。雖然為了了解HSPC自我更新、較緩慢的細胞分裂和HDAC之間的關(guān)系需要進一步的研究，但是所描述的數(shù)據(jù)表明PBMCCD34+處理的HDACi處理可使原始HSPC擴增以及CD90共表達。在對肽介導的HSPC擴增的潛在機制的探尋中，本發(fā)明人已對基因表達譜進行了檢查。PBMCCD34+細胞中的多種關(guān)鍵的HSPC功能相關(guān)基因的表達受到TSA處理的影響，而GATA-1驅(qū)使造血祖細胞分化為血細胞譜系的亞群，GATA-2主要在造血干細胞和早期祖細胞中表達并在自我更新中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這可能是增加HSPC樣特性的影響因素之一。過表達HOXB4(基因同源框家族的成員)已經(jīng)成為HSPC擴增的有效刺激物。HOXB4轉(zhuǎn)錄物在具有TSA的CD34+細胞中的更強表達與HSPC自我更新中提出的作用一致。本發(fā)明人還將其基因表達譜與從用5Aaza/TSA進行的處理獲得的基因表達譜進行了比較。據(jù)報道在用5Aza/TSA處理的CBCD34+細胞中，HOXB4、BMI1、GATA2、p21、p27、c-myc和MPO的表達水平增加。不受任何特定的限制，當在HDACi和細胞因子/生長因子的組合下進行離體培養(yǎng)時，轉(zhuǎn)錄因子介導CD34+CD90+擴增是可能的(圖5)。上述多種方法和技術(shù)提供了實施本發(fā)明的多種方式。當然，將理解的是，根據(jù)本文所述的任何特定實施方式，并非所述的所有目標和優(yōu)點均必需實現(xiàn)。因此，例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認識到，可通過實現(xiàn)或優(yōu)化如本文教導的一個優(yōu)點或一組優(yōu)點而不必實現(xiàn)如本文教導或暗示的其它目標或優(yōu)點的方式來實施本方法。本文提及了多種有利和不太有利的替代方式。將理解的是，一些優(yōu)選的實施方式具體包括一種、其它或多種有利的特征，而其它的實施方式則具體地排除一種、其它或多種不利的特征，然而還有其它實施方式通過包括一種、其它或多種有利特征而特定地緩和當前的不太有利特征。此外，技術(shù)人員將認識到來自不同實施方式的多種特征的適用性。相似地，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠?qū)⑸鲜龉_的多種要素、特征和步驟以及各此類要素、特征或步驟各自的其它已知等同物混合并匹配，以根據(jù)本文所述的原理實施方法。在多種要素、特征和步驟之中，一些將被具體地包括在不同的實施方式之中，而其它的則被具體地排除在不同的實施方式之外。雖然本發(fā)明已在一些實施方式和實施例的上下文中進行了公開，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會理解的是，本發(fā)明的實施方式延伸到具體公開的實施方式之外，并延伸至其它替代性實施方式和/或用途、以及其修改物和等同物。在本發(fā)明的實施方式中已經(jīng)公開了許多變化和替代性要素。進一步的變化和替代性要素對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。其中，這些變化為但不限于擴增造血細胞的方法、修飾所述技術(shù)中使用的造血細胞的方法、通過上述技術(shù)產(chǎn)生的造血細胞的組合、與本發(fā)明的教導相關(guān)的疾病和/或病癥的治療、其中所使用的技術(shù)方案的用途和組成和技術(shù)以及通過本發(fā)明的教導產(chǎn)生的產(chǎn)物的具體用途。本發(fā)明的各種實施方式可特定地包括或排除這些變化或要素中的任一者。在一些實施方式中，用于描述和請求保護本發(fā)明的一些實施方式的表示成分、特性(如濃度、反應條件等)的量的數(shù)字將被理解為在一些示例中通過術(shù)語“約”修飾。因此，在一些實施方式中，在書面描述和所附的權(quán)利要求中闡述的數(shù)值參數(shù)是近似值，其可根據(jù)具體實施方式所尋求獲得的期望特性而變化。在一些實施方式中，數(shù)值參數(shù)應當根據(jù)所報告的有效數(shù)字的數(shù)值并通過應用普通的舍入技術(shù)來解釋。盡管闡述本發(fā)明的一些實施方式的寬范圍的數(shù)值范圍和參數(shù)是近似值，但是在特定實施例中盡可能精確地報道了所闡述的數(shù)值。在本發(fā)明的一些實施方式中呈現(xiàn)的數(shù)值可能包含一些誤差，該誤差必然地由它們各自的測試測量中發(fā)現(xiàn)的標準偏差產(chǎn)生。在一些實施方式中，在描述本發(fā)明特定實施方式的上下文中(尤其是在如下的一些權(quán)利要求的上下文中)使用的術(shù)語“一”、“一個”、“所述/該”和類似的提法可被解釋為涵蓋單數(shù)和復數(shù)。本文列舉的值的范圍僅意在用作單獨提及的落在該范圍內(nèi)的各單獨值的速記方法。除非本文另外指明，否則每個單獨的值均被并入本說明書，就像在本文中單獨列舉一樣。除非本文另外指明或上下文明顯沖突，否則本文所述的所有方法可以按任何合適的順序?qū)嵤?。關(guān)于本文的一些實施方式提供的任何和所有實例或示例性語言(例如，“諸如”)的使用僅意在更好地闡明本發(fā)明，并不對本發(fā)明另外保護的范圍造成限制。本說明書中的語言不應解釋為是表示實踐本發(fā)明所必需的任何未請求保護的要素。本文所公開的本發(fā)明的替代性要素或?qū)嵤┓绞降姆纸M不應解釋為限制。各組成員可單獨或者與本文出現(xiàn)的該組的其它成員或其它要素任意組合而被提及和請求保護。出于方便和/或可專利性的原因，組的一個或多個成員可被包含在組中或從組中刪除。當任何此類包含或刪除發(fā)生時，認為本文的說明書包含經(jīng)修飾的組，從而實現(xiàn)所附權(quán)利要求中使用的所有馬庫什組的書面描述。本文對這一發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行了描述，包括本發(fā)明人已知的用于實施本發(fā)明的最佳模式。在本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員閱讀上述說明時，這些優(yōu)選實施方式的變型將變得顯而易見。在考慮之列的是，技術(shù)人員可在適當時采用此類變型，并且本發(fā)明可按本文具體描述之外的方式加以實踐。因此，如可適用的法律所允許的，這一發(fā)明的許多實施方式包括所附權(quán)利要求書中列出的主題的所有修改物和等同物。此外，除非在本文中另外指明，或除非與上下文明顯沖突，本發(fā)明涵蓋上述要素在其所有可能的變型中的任何組合。此外，在貫穿這一說明書中對專利和印刷出版物進行了許多參考。以引用的方式將上述引用的參考文獻和印刷出版物中的各自以其整體并入本文。最后，將理解的是，本文所公開的發(fā)明的實施方式是對本發(fā)明的原理的說明?？刹捎玫钠渌薷男问娇稍诒景l(fā)明的范圍內(nèi)。因此，舉例來說，而非加以限制，本發(fā)明的實施方式的替代構(gòu)造可根據(jù)本文的教導而使用。因此，本發(fā)明的實施方式不限于如精確地示出和描述的內(nèi)容。序列表<110>THEBRIGHAMANDWOMEN'SHOSPITAL,INC.DANA-FARBERCANCERINSTITUTE,INC.NATIONALUNIVERSITYOFSINGAPORECHAI,LiFEDERATION,AlexanderTATETSU,HiroTENEN,DanielG.BRADNER,James<120>用于人造血干/祖細胞的離體擴增的組合物和方法<130>043214-081011<150>61/970,787<151>2014-03-26<160>32<170>PatentInversion3.5<210>1<211>19<212>DNA<213>智人<400>1agtacctgaaccggcacct19<210>2<211>21<212>DNA<213>智人<400>2cagccaggagaaatcaaacag21<210>3<211>20<212>DNA<213>智人<400>3gcgctttgcttgctgagttt20<210>4<211>20<212>DNA<213>智人<400>4gccatgttgagacacagggt20<210>5<211>20<212>DNA<213>智人<400>5ctcctcctgcttgtgacctc20<210>6<211>20<212>DNA<213>智人<400>6cccaagctaaagtccacagc20<210>7<211>23<212>DNA<213>智人<400>7tctgactgtaccaccatccacta23<210>8<211>19<212>DNA<213>智人<400>8caaacacgcacctcaaagc19<210>9<211>19<212>DNA<213>智人<400>9gaggcgtggcagactatgc19<210>10<211>20<212>DNA<213>智人<400>10cttgtactccgtcagcgtga20<210>11<211>21<212>DNA<213>智人<400>11tggctctaatgaagatagagg21<210>12<211>20<212>DNA<213>智人<400>12ttccgatccaatctgttctg20<210>13<211>20<212>DNA<213>智人<400>13acaagatgaatgggcagaac20<210>14<211>19<212>DNA<213>智人<400>14tactgacaatcagcgcttc19<210>15<211>25<212>DNA<213>智人<400>15gatacccacctatccctcctatgtg25<210>16<211>23<212>DNA<213>智人<400>16gtggcaccacagttgacacactc23<210>17<211>20<212>DNA<213>智人<400>17tcccactccgcgtgcaaaga20<210>18<211>20<212>DNA<213>智人<400>18gccggcgtaattggggttta20<210>19<211>20<212>DNA<213>智人<400>19gtcttgtacccttgtgcctc20<210>20<211>21<212>DNA<213>智人<400>20ggtagaaatctgtcatgctgg21<210>21<211>18<212>DNA<213>智人<400>21accctcatccaacccttc18<210>22<211>18<212>DNA<213>智人<400>22gtcaatgccaccttccag18<210>23<211>25<212>DNA<213>智人<400>23tttaattgggtctcaggcaaactct25<210>24<211>25<212>DNA<213>智人<400>24ccgtctgaaacattttcttctgttc25<210>25<211>20<212>DNA<213>智人<400>25tcctcggattctctgctctc20<210>26<211>20<212>DNA<213>智人<400>26cttgttcctcctcagagtcg20<210>27<211>17<212>DNA<213>智人<400>27tctccttcgcgggcttg17<210>28<211>18<212>DNA<213>智人<400>28ccgacagcggttgaggtt18<210>29<211>25<212>DNA<213>智人<400>29tgttacaggcgtgcaaaatggaagg25<210>30<211>25<212>DNA<213>智人<400>30ctcgtgcgtttggcgttggtataga25<210>31<211>20<212>DNA<213>智人<400>31tggaaggactcatgaccaca20<210>32<211>20<212>DNA<213>智人<400>32ttcagctcagggatgacctt20當前第1頁1 2 3