本申請要求2014年5月12日提交的美國臨時申請No.61/992,184的權益，該臨時申請據此通過引用整體并入本文。

背景

再生醫(yī)學在臨床上顯示出很好的前景，但是研究人員可利用其進行實驗和臨床試驗的細胞材料的成本和可用性妨礙著該領域的發(fā)展。非常需要以高質量和低成本制造并且以加速產品開發(fā)和制造努力的量和形式遞送給轉化研究者和裝置制造者的標準化原代細胞。還需要具有足以用于組織工程改造應用(例如生物打印)的保質期的細胞形式。特別地，需要即用且穩(wěn)定形式的間充質干細胞(MSC)用于組織工程改造和細胞治療應用。

概述

本文公開了為實驗、治療和組織工程改造方案提供“即用”形式的細胞材料的組合物、裝置和方法。例如，公開了包含作為聚集體存在的冷凍或非冷凍細胞的組合物，包括包含間充質干細胞的聚集體。所述聚集體可以含有每個聚集體平均約100至200,000個細胞，包括每個聚集體約1,000至約100,000個細胞。在一些情況下，所述聚集體含有每個聚集體平均約1,000、5,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、110,000、120,000、130,000、140,000、150,000、160,000、170,000、180,000、190,000或200,000個細胞。例如，細胞聚集體可以用作組織工程改造的構成單元(building block)，例如通過3D打印，以及用于細胞治療應用的功能性可植入物體。因此，細胞聚集體的標志是聚集體內的單個細胞維持其活力和功能的能力，并且當聚集體在培養(yǎng)物中彼此融合時，它們能夠形成功能組織。因此，聚集體融合的能力可以證明良好的細胞活力和功能。聚集體還優(yōu)選具有相似的尺寸和體積。例如，在一些實施方案中，組合物中每個細胞聚集體的平均直徑方差小于5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％。

所公開的組合物還可包含足以維持至少70％的細胞活力的量的冷凍保存劑和/或生物保存劑。例如，細胞可以是具有一定量的冷凍保存劑(例如二甲亞砜(DMSO))的冷凍細胞，其足以保持細胞聚集體在-10℃至-80℃、例如-20℃下儲存至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59或60個月之后融合的能力。作為另一個實例，所述細胞可以是具有一定量的生物保存劑(例如)的非冷凍細胞，其足以保持細胞聚集體在0至25℃(例如4℃)下儲存至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天之后融合的能力。

所公開的組合物的細胞可以是當一起培養(yǎng)時能夠形成細胞聚集體且融合的任何細胞。在一些情況下，所述細胞是具有對應于所工程改造的所需組織的細胞譜系潛能的未分化的干細胞或祖細胞。所述細胞可以是單能的、寡能的、多能的(multipotent)或多能的(pluripotent)。在一些實施方案中，所述細胞是成體干細胞。所述細胞優(yōu)選是同種異體或自體的。在一些特定實施方案中，所述細胞包括間充質干細胞(MSC)。所述組合物可以含有單細胞類型，例如MSC。然而，在一些實施方案中，所述組合物含有兩種或更多種不同類型的細胞，即兩種或更多種不同譜系的細胞。所述細胞可以是動物細胞，例如人細胞。

還公開了含有細胞材料的組合物，其在儲存后適于分散，例如，通過3D打印。所公開的組合物包含懸浮在粘性基質中的細胞，使得細胞的平均細胞密度為每毫升1至100百萬個細胞，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100百萬個細胞/毫升。此外，所述粘性基質可以具有有效維持組合物中細胞密度方差小于5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％至少24小時、36小時、48小時、72小時或120小時的粘度。在一些實施方案中，所述組合物中的細胞在0℃至25℃(例如4℃)下儲存至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天后具有至少70％的細胞活力?！盎盍Α笔侵讣毎腔畹暮凸δ苄缘摹＜毎墓δ芸梢愿鶕毎念愋投煌?，但包括復制、分泌細胞因子、分泌生長因子、粘附到組織培養(yǎng)塑料、粘附到其他細胞、遷移的能力或其任何組合。在一些情況下，確定活力涉及檢測由細胞產生的一種或多種酶的存在和/或活性。如上所述，細胞可以作為聚集體存在。評價聚集體中細胞活力的一個重要方法是測試聚集體融合的能力。因此，所述組合物還可包含生物保存劑、冷凍保存劑或其組合。

用于懸浮細胞的粘性基質可以是適合于3D打印和/或組織工程改造的任何生物相容性聚合物。在一些情況下，所述聚合物是生物聚合物。例如，合適的生物聚合物包括多糖、多肽和糖蛋白。這包括天然或合成來源的細胞外基質(ECM)分子。在一些實施方案中，生物相容性聚合物包括藻酸鹽。可以調節(jié)生物相容性聚合物的粘度以維持細胞的懸浮，同時還優(yōu)選足夠流體以用于分散，例如通過經針或噴嘴注射。在特定實施方案中，所述細胞在組合物中維持密度方差小于5％、10％、15％或20％至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30天。

還公開了用于產生生物墨(bioink)組合物的試劑盒。在一些情況下，所述試劑盒包含組合物，所述組合物包含含有每個聚集體平均約1,000至約100,000個細胞的細胞聚集體。所述試劑盒還可以包含生物相容性聚合物。所述生物相容性聚合物可以與細胞聚集體在相同或不同的容器中。所述試劑盒還可以包含交聯(lián)劑。此試劑也可以與細胞聚集體在相同或不同的容器中，只要生物相容性聚合物和交聯(lián)劑在不同的容器中即可。

還公開了包含本文所述的細胞材料組合物的封閉系統(tǒng)裝置。所述封閉系統(tǒng)裝置可以被配置以作為離散單元在表面上分配組合物。例如，在一些實施方案中，每個離散單元可以包含受控量的細胞。封閉系統(tǒng)裝置的實例是盒(catridge)，例如在三維(3D)打印機裝置中使用的盒。

在附圖和下面的描述中闡述了本發(fā)明的一個或多個實施方案的細節(jié)。根據說明書和附圖以及權利要求書，本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點將是顯而易見的。

附圖說明

圖1A顯示在鋪板后粘附2小時的間充質干細胞(MSC)的圖像。圖1B是兩個批次的MSC在鋪板和擴增2代后的生長曲線。

圖2是柱狀圖，其顯示在解凍和擴增冷凍保存的MSC后，三批MSC表達CD73、CD90、CD105和CD166，而對CD45、CD34和CD14呈陰性。

圖3是顯示解凍和擴增冷凍保存的MSC后三個批次的MSC中血管生成細胞因子的分泌水平的條形圖。

圖4顯示在解凍和擴增冷凍保存的MSC后，MSC分化為成脂(A)和成骨(B)譜系。

圖5是顯示在解凍和擴增冷凍保存的MSC后MSC維持其免疫調節(jié)功能的條形圖。

圖6A和6B是顯示hMSC聚集體形成的圖像。

圖7A是顯示MSC聚集體自發(fā)融合的圖像，其指示活的和具有代謝活性的細胞。圖7B顯示MSC聚集體附著，其指示活的和具有代謝活性的細胞。

圖8是柱狀圖，其顯示當在37℃培養(yǎng)物中鋪板和孵育時，MSC聚集體繼續(xù)分泌血管生成細胞因子。

圖9是顯示MSC聚集體的吲哚胺-吡咯2，3-雙加氧酶(IDO)活性的條形圖。

圖10A是顯示包封在藻酸鹽中并擠壓到CaCl2的單細胞和聚集體MSC的圖像。圖10B是顯示在包封后用鈣熒光素-AM染色的具有高度活性的MSC聚集體(綠色)的圖像。圖10C是顯示MSC聚集體在擠壓的藻酸鹽中融合的圖像。

圖11是一系列圖像，其顯示在TC板中培養(yǎng)1天后，在4℃下于具有4％HSA的hypothermosol、培養(yǎng)基或鹽水中儲存3天和7天的hMSC聚集體。

圖12是一系列圖像，其顯示在TC板中培養(yǎng)6天后，在4℃下于具有4％HSA的hypothermosol，培養(yǎng)基或鹽水中儲存3天和7天的hMSC聚集體。

圖13是一系列圖像，其顯示在非粘附板中培養(yǎng)1天后，在4℃下于具有4％HSA的hypothermosol、培養(yǎng)基或鹽水中儲存3天和7天的hMSC聚集體。

圖14是顯示在4℃下于HTS、鹽水、培養(yǎng)基中儲存3或7天后MSC聚集體的IDO活性的條形圖。

圖15是顯示在4℃下于HTS、鹽水、培養(yǎng)基中儲存3或7天后MSC聚集體的Ang-2、FGF、HGF、IL-8、TIMP-1、TIMP-2和VEGF分泌的條形圖。

圖16是一系列圖像，其顯示冷凍保存的hMSC聚集體維持聚集體融合的能力，以及個體細胞附著到組織培養(yǎng)(TC)塑料并從聚集體生長的能力。

圖17是顯示冷凍保存的聚集體維持誘導型免疫調節(jié)表型的條形圖。

圖18是顯示冷凍保存和非冷凍MSC聚集體的Ang-2、FGF、HGF、IL-8、TIMP-1、TIMP-2和VEGF分泌的條形圖。

圖19A至19C是顯示冷凍保存的MSC聚集體能夠制成環(huán)形(圖19A-19B)的圖像，H&E染色證實整個環(huán)結構中聚集體的一致的健康融合(圖19C)。

圖20A是示出每個聚合體以1000個細胞制成的100,000個聚集體的生成的過程流程圖。圖20B是顯示細胞擴增的時間節(jié)省(天)的條形圖。

圖21A是顯示不同藻酸鹽制劑的可打印性測試的圖像。圖21B是顯示不同藻酸鹽制劑的稠度和粘性的圖表。

圖22是顯示不同藻酸鹽制劑的沉降和凝集(clumping)的圖表。

圖23是一系列圖像，其顯示在4℃下儲存7天后MSC聚集體在水凝膠中的存活和在接種到TC板上時聚集體的擴大。

圖24A和24B是顯示用于MSC聚集體產品構造(product configuration)的生物墨試劑盒的圖像。

圖25是最終MSC聚集體生物墨產品構造的圖像，其適合于在4℃下的產品運輸和儲存。

詳述

所公開的組合物、裝置和方法涉及再生醫(yī)學、基于干細胞的技術和醫(yī)療裝置、組織工程改造、生物醫(yī)學研究和開發(fā)、來源于活細胞的細胞原材料和生物功能材料領域。特別地，公開了以能夠將這些細胞或細胞來源的材料摻入生物和生物醫(yī)學產品的形式遞送的功能活細胞的穩(wěn)定組合物和制劑。

本文提供了能夠將細胞摻入工程改造組織、醫(yī)療裝置或需要功能性活細胞的其他產品的高功能活細胞的穩(wěn)定制劑。例如，公開了用于再生醫(yī)學、組織工程改造和生物打印應用的細胞組合物。本文提供的穩(wěn)定制劑使細胞或細胞聚集體以高活性和功能性的狀態(tài)保持懸浮。

所述組合物可以含有作為單細胞懸液的細胞制劑或作為在數天、數周或數月的儲存后即用的同源或異源細胞聚集細胞的細胞制劑。所述細胞制劑允許保持細胞活力和功能性。一些制劑中的細胞優(yōu)選保持懸浮而在儲存期間不沉降，并且具有遞送到特定位置同時保持活力和功能的能力。穩(wěn)定的制劑可以在冷凍(即冷凍保存)或非冷凍(生物保存)狀態(tài)下穩(wěn)定數周至數月或數年。冷凍狀態(tài)是指穩(wěn)定的制劑處于或低于冷凍溫度(例如，等于或低于0℃，通常為至少-20℃)。在一些實施方案中，以冷凍狀態(tài)儲存的制劑還包含冷凍保存劑。非冷凍狀態(tài)是指穩(wěn)定的制劑處于高于冷凍溫度(例如，等于或高于0℃)，通常為至少2℃。在一些實施方案中，非冷凍狀態(tài)包括0至37℃，例如4至24℃。

本文所用的術語“細胞”還指個體細胞、細胞系、原代培養(yǎng)物或源自這樣的細胞的培養(yǎng)物，除非特別指明?！芭囵B(yǎng)物”是指包含相同或不同類型的分離的細胞的組合物。

在一些實施方案中，所公開的組合物包含干細胞或祖細胞。多能干細胞、成體干細胞、胚泡來源的干細胞、性腺來源的干細胞、畸胎瘤來源的干細胞、全能干細胞、多能干細胞、制瘤素非依賴性干細胞(OISC)、胚胎干細胞(ES)、胚胎生殖細胞(EG)和胚胎癌細胞(EC)都是干細胞的實例。干細胞可以具有這些性質的多種不同特性和種類。例如，在一些形式中，干細胞能夠在未分化狀態(tài)下增殖至少10、15、20、30代或更多代。在一些形式中，干細胞可以增殖超過一年而不分化。干細胞還可以在增殖和/或分化時維持正常核型。干細胞還能夠保留分化成中胚層、內胚層和外胚層組織(包括生殖細胞、卵和精子)的能力。一些干細胞也可以是能夠在未分化狀態(tài)下在體外無限增殖的細胞。一些干細胞也可以通過延長培養(yǎng)維持正常核型。即使在延長培養(yǎng)后，一些干細胞也可以保持分化為所有三個胚胎胚層(內胚層、中胚層和外胚層)的衍生物的潛力。一些干細胞可以在生物體中形成任何細胞類型。一些干細胞可在某些條件下形成胚狀體，例如在不保持未分化生長的培養(yǎng)基上生長。例如，一些干細胞可以通過與胚泡融合形成嵌合體。

一些干細胞可以由多種標志物限定。例如，一些干細胞表達堿性磷酸酶。一些干細胞表達SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和/或TRA-1-81。一些干細胞不表達SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和/或TRA-1-81。一些干細胞表達Oct 4、Sox2和Nanog。應當理解，一些干細胞將在mRNA水平上表達這些干細胞，而另外一些干細胞還將例如在細胞表面或在細胞內在蛋白質水平表達它們。

在一些實施方案中，所公開的組合物包含除干細胞之外的細胞。成人體產生許多不同的細胞類型。這些不同的細胞類型包括但不限于角質化上皮細胞、濕復層屏障上皮細胞、外分泌分泌上皮細胞、激素分泌細胞、上皮吸收細胞(腸、外分泌腺和泌尿生殖道)、代謝和儲存細胞、屏障功能細胞(肺、腸、外分泌腺和泌尿生殖道)、上皮細胞內襯封閉的內部體腔、具推進功能的纖毛細胞、細胞外基質分泌細胞、收縮細胞、血液和免疫系統(tǒng)細胞、感覺傳感器細胞、自主神經元細胞、感覺器官和外周神經元支持細胞、中樞神經系統(tǒng)神經元和神經膠質細胞、晶狀體細胞、色素細胞、生殖細胞和營養(yǎng)細胞(Nurse cell)。

人體的細胞包括角質化上皮細胞、表皮角化細胞(分化表皮細胞)、表皮基底細胞(干細胞)、指甲和趾甲的角化細胞、指甲床基底細胞(干細胞)、髓質毛干細胞、皮質毛干細胞、角質毛干細胞、角質毛根皮細胞、赫胥黎氏層(Huxley′s layer)的毛根皮細胞、漢勒氏層(Henle′s layer)的毛根皮細胞、外毛根皮細胞、毛基質細胞(干細胞)、濕復層屏障上皮細胞、角膜、舌、口腔、食管、肛管、遠端尿道和陰道的復層扁平上皮的表面上皮細胞、角膜、舌、口腔、食道、肛管、遠端尿道和陰道上皮的基底細胞(干細胞)、泌尿上皮細胞(襯里膀胱和泌尿道)、外分泌性分泌上皮細胞、唾液腺粘液細胞(富含多糖的分泌)、唾液腺漿液細胞(富含糖蛋白酶的分泌)、舌中的艾伯納腺細胞(Von Ebner′s gland cell)(清洗味蕾)、乳腺細胞(乳分泌)、淚腺細胞(淚分泌)、耳中的淚腺細胞(蠟分泌)、外分泌腺汗腺暗細胞(糖蛋白分泌)、外分泌腺汗腺透明細胞(小分子分泌)、頂泌汗腺細胞(氣味分泌、性激素敏感)、眼瞼中的莫爾細胞(Moll cell)腺(專門的汗腺)、皮脂腺細胞(富含脂質的皮脂分泌)、鼻中的鮑曼氏腺細胞(清洗嗅覺上皮)、十二指腸中的布魯納氏腺細胞(酶和堿性粘液)、精囊泡細胞(分泌精液組分，包括用于游泳精子的果糖)、前列腺細胞(分泌精液組分)、球囊腺細胞(粘液分泌)、巴多林氏腺(Bartholin′s gland)細胞(陰道潤滑劑分泌)、尿道腺細胞(粘液分泌)、子宮內膜細胞(碳水化合物分泌)、呼吸和消化道的分離的杯狀細胞(粘液分泌)、胃內襯粘液細胞(粘液分泌)、胃腺產酶細胞(胃蛋白酶原分泌)、胃腺壁細胞(HCl分泌)、胰腺腺泡細胞(碳酸氫鹽和消化酶分泌)、小腸帕內特細胞(Paneth cell)(溶菌酶分泌)、肺的II型肺細胞(表面活性劑分泌)、肺的克拉拉細胞(Clara cell)、分泌激素的細胞、分泌生長激素的前垂體細胞、分泌促卵泡激素的前垂體細胞、分泌促黃體生成激素的前垂體細胞、分泌促乳素的前垂體細胞、分泌促腎上腺皮質激素的前垂體細胞、分泌促甲狀腺激素的前垂體細胞、分泌促黑素細胞激素的中間垂體細胞、分泌催產素的后垂體細胞、分泌加壓素的后垂體細胞、分泌5-羥色胺的腸道和呼吸道細胞、分泌內啡肽的腸道和呼吸道細胞、分泌生長激素抑制素的腸道和呼吸道細胞、分泌胃泌素的腸道和呼吸道細胞、分泌胰泌素的腸道和呼吸道細胞、分泌縮膽囊素的腸道和呼吸道細胞、分泌胰島素的腸道和呼吸道細胞、分泌胰高血糖素的腸道和呼吸道細胞、分泌蛙皮素的腸道和呼吸道細胞、分泌甲狀腺激素的甲狀腺細胞、分泌降血鈣素的甲狀腺細胞、分泌甲狀旁腺激素的甲狀旁腺細胞、甲狀旁腺嗜酸性細胞、分泌腎上腺素的腎上腺細胞、分泌去甲腎上腺素的腎上腺細胞、分泌類固醇激素(鹽皮質激素和糖皮質激素)的腎上腺細胞、分泌睪酮的睪丸的睪丸間質細胞、分泌雌激素的卵泡的卵泡內膜細胞、分泌孕酮的破裂卵泡的黃體細胞、腎臟腎小球旁細胞(腎素分泌)、腎的致密斑細胞、腎的極周細胞、腎的間質細胞、上皮吸收細胞(腸、外分泌腺和泌尿生殖道)、腸刷狀緣細胞(具有微絨毛)、外分泌腺條紋管細胞、膽囊上皮細胞、腎近端小管刷狀緣細胞、腎遠端小管細胞、輸出管無纖毛細胞、附睪性主細胞、附睪基底細胞、代謝和儲存細胞、肝細胞(肝細胞)、白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞、肝脂肪細胞、屏障功能細胞(肺、腸、外分泌腺和泌尿生殖道)、I型肺細胞(肺內襯空氣空間)、胰管細胞(泡心細胞)、無橫紋管細胞(汗腺、唾液腺、乳腺等)、腎小球壁細胞、腎小球足細胞、漢勒氏袢薄節(jié)片細胞(Loop of Henle thin segment cell)(腎臟中)、腎收集管細胞、管細胞(精囊、前列腺等)、上皮細胞內襯封閉的內體腔、血管和淋巴血管內皮有孔細胞、血管和淋巴血管內皮連續(xù)細胞、血管和淋巴血管內皮脾細胞、滑膜細胞(內襯關節(jié)腔、透明質酸分泌)、漿膜細胞(內襯腹膜、胸膜和心包腔)、鱗狀細胞(耳內襯外淋巴隙)、鱗狀細胞(耳內襯內淋巴隙)、具有微絨毛的內淋巴囊的柱狀細胞(耳內襯內淋巴隙)、沒有微絨毛的內淋巴囊(耳內襯內淋巴隙)、暗細胞(耳內襯內淋巴隙)、前庭膜細胞(耳內襯內淋巴隙)、血管紋基底細胞(耳內襯內淋巴隙)、血管紋緣細胞(耳內襯內淋巴隙)、柯拉狄烏司氏細胞(Cell of Claudius)(耳內襯內淋巴隙)、伯特歇爾細胞(Cell of Boettcher)(耳內襯內淋巴隙)、脈絡叢細胞(腦脊髓液分泌)、軟蛛網膜鱗狀細胞、眼的色素睫狀體上皮細胞、眼的非色素睫狀體上皮細胞、角膜內皮細胞、具推進功能的纖毛細胞、呼吸道纖毛細胞、輸卵管纖毛細胞(雌性)、子宮內膜纖毛細胞(雌性)、睪丸纖毛細胞(雄性)、輸出管纖毛細胞(雄性)、中樞神經系統(tǒng)的纖毛狀室管膜細胞(內襯腦腔)、細胞外基質分泌細胞、成釉細胞上皮細胞(牙釉質分泌)、耳前庭半月面上皮細胞(蛋白聚糖分泌)、柯替氏器齒間上皮細胞(分泌覆蓋毛細胞的蓋膜)、疏松結締組織成纖維細胞、角膜成纖維細胞、腱成纖維細胞、骨髓網狀組織成纖維細胞、其他(非上皮)成纖維細胞、血液毛細血管周細胞、椎間盤髓核細胞、成牙骨質細胞/牙骨質細胞(牙根骨樣牙基質分泌)、成牙質細胞/牙質細胞(牙齒牙質分泌)、透明軟骨軟骨細胞、纖維軟骨軟骨細胞、彈性軟骨軟骨細胞、成骨細胞/骨細胞、骨原細胞(成骨細胞的干細胞)、眼的玻璃體的玻璃體細胞、耳的外淋巴隙星狀細胞、收縮細胞、紅色骨骼肌細胞(慢)、白色骨骼肌細胞(快)、中間骨骼肌細胞、肌肉軸-核袋細胞、肌肉主軸-核鏈細胞、衛(wèi)星細胞(干細胞)、普通心肌細胞、結節(jié)心肌細胞、浦肯野纖維細胞、平滑肌細胞(各種類型)、虹膜的肌上皮細胞、外分泌腺的肌上皮細胞、血液和免疫系統(tǒng)細胞、紅細胞(血紅細胞)、巨核細胞、單核細胞、結締組織巨噬細胞(各種類型)、表皮朗格漢斯細胞、破骨細胞(骨中)、樹突狀細胞(淋巴組織中)、小膠質細胞(中樞神經系統(tǒng))、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性細胞、肥大細胞、輔助T淋巴細胞、抑制T淋巴細胞、殺傷T淋巴細胞、IgM B淋巴細胞、IgG B淋巴細胞、IgA B淋巴細胞、IgE B淋巴細胞、殺傷細胞、干細胞和用于血液和免疫系統(tǒng)的定向祖細胞(各種類型)、感覺傳感器細胞、眼感光桿細胞、眼感光器藍感光錐細胞、眼感光器綠感光錐細胞、眼光感受器紅感錐細胞、柯蒂氏器的聽覺內毛細胞、柯蒂氏器的聽覺外毛細胞、耳前庭器官的I型毛細胞(加速度和重力)、耳前庭器官的II型毛細胞(加速度和重力)、I型味蕾細胞、嗅覺神經元、嗅覺上皮的基底細胞(嗅覺神經元的干細胞)、I型頸動脈體細胞(血液pH感受器)、II型頸動脈體細胞(血液pH感受器)、表皮的默克爾細胞(觸摸感受器)、觸敏初級感覺神經元(各種類型)、冷感覺初級感覺神經元、熱敏初級感覺神經元、痛敏初級感覺神經元(各種類型)、本體感覺初級感覺神經元(各種類型)、自主神經元細胞、膽堿能神經細胞(各種類型)、腎上腺素能神經細胞(各種類型)、肽能神經細胞(各種類型)、感覺器官和外周神經支持細胞、柯蒂氏器的內支柱細胞、柯蒂氏器的外支柱細胞、柯蒂氏器的內指骨/趾骨細胞、柯蒂氏器的外指骨/趾骨細胞、柯蒂氏器的緣細胞、柯蒂氏器的漢森細胞、前庭器官支持細胞、I型味蕾支持細胞、嗅覺上皮支持細胞、施萬氏細胞、衛(wèi)星細胞(包裹周圍神經細胞體)、腸膠質細胞、中樞神經系統(tǒng)神經元和神經膠質細胞、神經元細胞(各種類型，分類仍然不良)、星形細胞膠質細胞(各種類型)、少突膠質細胞、晶狀體細胞、前晶狀體上皮細胞、含晶狀體蛋白的晶狀體纖維細胞、色素細胞、黑素細胞、視網膜色素上皮細胞、生殖細胞、卵子/卵母細胞、精母細胞、精原細胞(精細胞干細胞)、營養(yǎng)細胞、卵泡細胞、滋養(yǎng)細胞(睪丸中)及胸腺上皮細胞。

在一些情況下，所述細胞是間充質干細胞(MSC)或骨髓基質細胞(BMSC)。這些術語在本文全文中同義使用。MSC是令人感興趣的，因為它們容易從骨髓的小量抽吸物或其他間充質干細胞源中分離，并且它們容易產生單細胞來源的集落。骨髓細胞可以從髂嵴、股骨、脛骨、脊柱、肋、膝或其他間充質組織獲得。MSC的其他來源包括胚胎卵黃囊、胎盤、臍帶、皮膚、脂肪、來自關節(jié)的滑膜組織和血液。可以通過用單克隆抗體鑒定的特異性細胞表面標志物來驗證培養(yǎng)集落中MSC的存在。參見美國專利No.5,486,359和7,153,500。單細胞衍生的集落可以在約10周內擴增多達50次群體倍增，并且可以分化成成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞(Friedenstein等人，1970 Cell Tiss ue Kinet.3：393-403；Castro-Malaspina，等人，1980 Blood 56：289-301；Beresford等人，1992 J.Cell Sci.102：341-351；Prockop，1997 Science 276：71-74)、肌細胞(Wakitani等人，1995 Muscle Nerve18：1417-1426)、星形膠質細胞、少突膠質細胞和神經元(Azizi等人，1998 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：3908-3913)；Kopen等人1999Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：10711-10716；Chopp等人，2000Neuroreport II 300 1-3005；Woodbury等人，2000 Neuroscience Res，61：364-370)。在極少數情況下，細胞可以分化成所有三種種系的細胞。因此，MSC用作多種間充質細胞譜系的祖細胞，包括骨、軟骨、韌帶、腱、脂肪、肌肉、心臟組織、基質、真皮及其他結締組織。參見美國專利No.6,387,369和7,101,704。由于這些原因，目前正在測試MSC在許多人類疾病的細胞和基因治療中的潛在用途(Horwitz等人，1999 Nat.Med.5：309-313；Caplan等人，2000 Clin.Orthoped.379：567-570)。

用于產生MSC聚集體的方法描述于Prockop等人的US2012/0219572和Bartosh等人，PNAS 2010 107(31)：13724-13729中，兩者均通過引用整體并入本文用于本教導。例如，可以以促進球狀體的聚集和形成的方式培養(yǎng)MSC。例如，MSC可以從人骨髓中分離并在懸滴或非粘附皿中在完全培養(yǎng)基(含有4mM L-谷氨酰胺、10％PBS和1％青霉素/鏈霉素的DMEM低葡萄糖)中培養(yǎng)。能夠在體外支持MSC的任何培養(yǎng)基均可用于培養(yǎng)MSC?？芍С諱SC生長的培養(yǎng)基制劑包括但不限于達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、α改良的最小必需培養(yǎng)基(αMEM)和Roswell Park Memorial Institute Media1640(RPMI Media 1640)等。通常，將多至20％胎牛血清(FBS)或1至20％馬血清加入到上述培養(yǎng)基中以支持MSC的生長。然而，如果在培養(yǎng)基中以適當的濃度提供培養(yǎng)MSC所必需的生長因子、細胞因子和激素，也可以使用確定成分的培養(yǎng)基(defined medium)。在所公開的方法中有用的培養(yǎng)基可以含有一種或多種目的化合物，包括但不限于用于培養(yǎng)MSC的抗生素、促有絲分裂或分化的化合物。所述細胞可以例如在27℃至40℃(包括31℃至37℃)的溫度下生長。二氧化碳含量可以維持在2％至10％之間，氧含量可以維持在1％至22％之間。

在一些實施方案中，在足以提供足夠數量的細胞用于進一步培養(yǎng)的條件和時間下培養(yǎng)MSC。然后在促進細胞球形聚集體形成的條件下培養(yǎng)細胞。在一些實施方案中，細胞在Aggrewell板中培養(yǎng)。在一些實施方案中，將細胞培養(yǎng)為懸滴。在一些實施方案中，培養(yǎng)的MSC的每個懸滴含有約1,000至約500,000個細胞/滴。然后可以將MSC的懸滴培養(yǎng)足以形成間充質干細胞的球形聚集體的一段時間。通常，將細胞滴培養(yǎng)長達4天的時間段。

所述細胞可以來源于人或其他動物。例如，細胞可以來自小鼠、豚鼠、大鼠、牛、馬、豬、綿羊或山羊。在一些實施方案中，所述細胞來源于非人靈長類動物。在一些情況下，所述細胞是自體的或同種異體的。

在一些情況下，所述細胞獲自細胞培養(yǎng)物，其涉及群體倍增(細胞傳代)。在這些情況下，所述細胞優(yōu)選來自小于或等于50倍的群體倍增，包括在4至50、10至30之間的群體倍增。因此，細胞可以來自如下代數：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50。

有幾種生物材料可用于組織工程改造和細胞遞送，其中大多數這些材料被認為是“水凝膠”或含水凝膠。這些材料的要求是1)生物相容性：細胞必須能夠與材料組合，通常在整個材料中，并保持活力和功能；和2)在大多數情況下，水凝膠還必須促進嵌入的細胞和內源性細胞的遷移、增殖和分化。存在用于維持水凝膠的“可打印性”同時仍保持生物相容性和遷移/功能的初始需求的額外約束。這些在Malda，J等人，Adv.Mater.2013，25，5011-5028中概述。此外，可用于生物打印的許多商業(yè)來源的水凝膠描述于Murphy SV，Skardal A，Atala A.2013，Evaluation of hydrogels for bio-printing applications.J Biomed Mater Res A部分2013：101A：272-284中，包括I型膠原蛋白、膠原蛋白/纖維蛋白、纖維蛋白、Extracel^TM水凝膠、Extracel^TM UV、酪胺取代的透明質酸(TS-NaHy)、Corgel^TM、甲基纖維素-透明質酸(MC-HA)、殼聚糖、殼聚糖/膠原、藻酸鹽、藻酸鹽/明膠和聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)。

用于組織工程改造和生物打印的常見材料是藻酸鹽、膠原、纖維蛋白、纖維蛋白原、聚乙二醇(PEG)、瓊脂、瓊脂糖、殼聚糖、透明質酸、甲基丙烯酰胺、明膠、普朗尼克(pluronic)、基質膠(matrigel)、甲基纖維素和PEG-DA(二丙烯酸酯)。這些材料通常不簡單地單獨使用，而是通?；旌显谝黄鹨越M合性質(例如，藻酸鹽或PEG-DA的膠凝化特性與膠原/纖維蛋白的細胞粘附能力)制備新組合物。此外，可以從根本上設計新的水凝膠以考慮進這些性質(Guvendiren和Burdick，Current Opinion in Biotechnology 2013，24：841-846)。

用于所公開的組合物和方法的水凝膠與細胞的分配/打印相容，同時還具有在生物保存過程中具有細胞保持活力和功能數天/周/月的能力。

本文提供的組合物包含在長期儲存后保持高活力和功能的細胞。活力是指在保存或儲存之后，細胞是活的并且能夠存在與存儲之前相同的細胞功能。在一些情況下、高活力是指至少50％、55％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的初始細胞群體在保存或儲存后能夠存活、生長和發(fā)揮功能。

細胞活力可以使用本領域已知的方法測定?；盍y定是確定器官、細胞或組織維持或恢復活力的能力的測定?？梢酝ㄟ^使用0與1(或0與100％)之間的可量化指數由生存和死亡的全有或全無狀態(tài)區(qū)分活力(Pegg DE(1989).“Viability assays for preserved cells，tissues，and organs”Cryobiology 26(3)：212-231)。例如，檢查細胞中鉀與鈉的比例可以用作生存力的指標。如果細胞不具有高細胞內鉀和低細胞內鈉，則細胞膜可能不完整，和/或(2)鈉-鉀泵可能不能很好地操作。因此，許多測量細胞膜完整性的測定被用作活力的量化測量。這些可以是臺盼藍、碘化丙啶(PI)，其是可以穿透滲漏的細胞膜并且已經在市售細胞計數器中自動化的染料。其他類型的測定測量細胞群體的總代謝速率，例如測量總ATP、基于甲瓚的測定(MTT/XTT)和基于Alomar藍或基于刃天青的測定。然而，生理功能的定量測量不指示損傷修復和恢復是否可能。細胞粘附到表面、擴散并最終遷移和分裂的能力的測定可能更多地指示活細胞，但可以產生相當多的時間并且可以更少定量。據言，所有這些測試都可用作活力測定以評估冷凍保存技術的成功、物質的毒性或物質在減輕有毒物質的影響中的有效性。

在所公開的研究中，使用自動PI膜完整性測定(Chemometech Inc的NucleoCounter NC100)作為熒光活/死測定，并使用Alomar藍測量聚集體的細胞代謝。還使用了功能測試，其顯示聚集體內的細胞仍可粘附于細胞培養(yǎng)塑料并從聚集體生長出來，并且當聚集體保持在非粘附表面上時，聚集體邊緣處的細胞將與其他聚集體結合，使聚集體融合成單個較大的結構。一般的假設是，如果細胞仍然能夠粘附培養(yǎng)板上且在培養(yǎng)板上擴散，或者如果細胞聚集體融合(其為粘附和擴散的3D等同形式)，那么許多細胞功能例如細胞因子分泌、分化和hMSC的免疫調節(jié)功能得以維持。

作為儲存細胞的水溶液的結果，可以維持組合物中細胞(例如MSC)的高活力。水溶液可以例如包含減少細胞凋亡和細胞死亡的化學品和營養(yǎng)物。

因此，在一些實施方案中，所述組合物包含冷凍保存劑。冷凍保存劑的非限制性實例包括二甲亞砜(DMSO)、甘油、聚乙烯吡咯烷、聚乙二醇、白蛋白、葡聚糖、蔗糖、乙二醇、異赤蘚醇、D-核糖醇、D-甘露醇、D-山梨糖醇、異肌醇、D-乳糖、氯化膽堿、氨基酸、甲醇、乙酰胺、單乙酸甘油酯、無機鹽或其任何組合。在一些情況下，冷凍保存劑包含、CS2、CS5或CS10冷凍介質(BioLife Solutions，Inc)和5％DMSO。在一些情況下，冷凍保存劑包含1％至15％DMSO，例如2％至7.5％，包括5％DMSO。

在一些實施方案中，所公開的細胞組合物包含生物保存劑，其清除自由基、提供pH緩沖、提供膨脹/滲透支持、含有能量底物、具有在低溫下平衡細胞內狀態(tài)的離子濃度或其任何組合。例如，在一些實施方案中，所述生物保存制劑包含Hypo(BioLife Solutions，Inc.)，例如HypoFRS。HypoFRS的組分包括Trolox(6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸)、Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、H₂PO4^-、HCO3^-、HEPES、乳糖醛酸、蔗糖、甘露醇、葡萄糖、葡聚糖-40、腺苷和谷胱甘肽，pH為7.6，滲透壓為約360。因此，在一些實施方案中，所公開的細胞組合物包含2-10％DMSO和Hypo或FRS。

本文提供的組合物包含高體積和高細胞濃度的細胞。在一些實施方案中，所公開的細胞組合物包含濃度為至少1百萬個細胞/mL的至少1千萬個細胞。例如，在一些實施方案中，所述組合物包含至少1千萬、1億、10億、100億或500億個細胞，濃度為至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、60、70、80、90或1億個細胞/mL。

在一些實施方案中，所公開的細胞作為多細胞聚集體存在，其充當“微組織”，并且在打印時可用于更高階3D組織的構成單元或者用于細胞治療應用中的移植細胞的穩(wěn)定形式。因此，這些聚集體優(yōu)選具有均一的尺寸和形狀，盡管不同尺寸和形狀的多細胞聚集體在許多應用中也可能足夠。聚集體還優(yōu)選均勻地分散在細胞組合物中，以便在分配、擠出或打印時提供一致數量的細胞。

可以基于預期用途選擇聚集體的尺寸和密度。在一些實施方案中，細胞以含有至少100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、150,000或200,000個細胞/聚集體的聚集體存在。在每種組合物中，聚集體優(yōu)選具有小于5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％的直徑方差。

在一些實施方案中，將所公開的細胞懸浮在將細胞維持在懸浮液中以增強組合物內均勻分布同時還保持組合物用于擠出(例如用于生物打印)的適合性的粘性溶液(即，擠出材料)中?！熬鶆蚍植肌笔侵讣毎诿糠N組合物中具有小于5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％的密度方差。例如，粘性溶液可以是水凝膠，例如上述的那些。因此，粘度優(yōu)選足夠高以保持均勻分布，同時足夠低以適于通過生物打印機擠出。

在一些實施方案中，所公開的組合物(生物墨)的特征在于具有如下粘度：約500至1,000,000厘泊、約750至1,000,000厘泊、約1000至1,000,000厘泊、約1000至400,000厘泊、約2000至100,000厘泊、約3000至50,000厘泊、約4000至25,000厘泊、約5000至20,000厘泊或約6000至15000厘泊。粘度可以通過常規(guī)方法用粘度計測量。

在一些情況下，擠出材料也是適合組織工程改造的生物材料，例如膠原、透明質酸鹽、纖維蛋白、藻酸鹽、瓊脂糖、殼聚糖及其組合。在一些其它實施方案中，合適的水凝膠是合成聚合物。在另外一些實施方案中，合適的水凝膠包括衍生自聚(丙烯酸)及其衍生物、聚(環(huán)氧乙烷)、聚(乙二醇)及其共聚物、聚(乙烯醇)、聚磷腈及其組合的那些。

在一些實施方案中，擠出化合物包含光引發(fā)劑，其為在特定波長的光吸收時產生能夠催化聚合或縮聚反應的反應性物質的分子。這些反應區(qū)也稱為光聚合或輻射固化。光引發(fā)劑通常是含有芳族基團和羰基二者的酮。

在一些實施方案中，基于水凝膠的擠出化合物是熱致可逆凝膠(也稱為熱響應凝膠或熱凝膠)。在一些實施方案中，合適的熱致可逆水凝膠在室溫下不是液體。由聚氧丙烯和聚氧乙烯構成的聚合物在加入水溶液中時形成熱致可逆凝膠。這些聚合物具有在生物打印機裝置中可以保持的溫度下從液態(tài)變?yōu)槟z態(tài)的能力。液態(tài)到凝膠態(tài)的相變取決于溶液中聚合物的濃度和成分。

穩(wěn)定的細胞制劑可以儲存在例如傳統(tǒng)的螺旋或隔膜頂部瓶中，或者在可以從冷凍或非冷凍儲存中取出并與分配裝置集成的無菌封閉系統(tǒng)裝置內。所述分配裝置可以例如是生物打印機或自動或者自動或手動注射裝置。任選地，生物打印機可以是三維(3D)生物打印機。分配裝置可以將活細胞遞送到特定位置，同時保持細胞的無菌性和質量。因此，在一些實施方案中，所公開的細胞組合物包含在無菌或無菌生物墨盒或生物醫(yī)學注射器內。

在一些實施方案中，所公開的同源細胞群體和粘性溶液包含用于生物打印的生物墨。本文所用的“生物墨”是指包含多個細胞的液體、半固體或固體組合物。在一些實施方案中，生物墨包含細胞懸液、細胞聚集體、含細胞的凝膠、多細胞體或組織。在一些實施方案中，所述生物墨還包含載體材料。在一些實施方案中，所述生物墨還包含提供允許進行生物打印的特定生物力學性質的非細胞材料。

本文所用“生物打印”是指通過與自動化、計算機輔助的、三維原型裝置(例如，生物打印機)相容的方法利用細胞(例如，細胞溶液、含細胞的凝膠、細胞懸液、細胞濃度、多細胞聚集體、多細胞體等)的三維、精確沉積。

本文所用“盒”是指能夠接收(和容納)生物墨或支撐材料的任何物體。

在一些實施方案中，容器或盒具有無菌端口或管道，其允許細胞和生物材料從容器或盒中排出，同時在必要時保持無菌條件。

在一些實施方案中，生物打印機以特定模式并在計算機輔助設計軟件指導的特定位置從盒中分配生物墨，以形成特定的細胞構建體、組織或器官。為了制造復雜的組織構建體，生物打印機以精確的速度和均勻的量沉積生物墨。在一些實施方案中，盒包含一個分配孔口。在多種其它實施方案中，盒包含2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、20個、30個、40個、50個、60個、70個、80個、90個、100個或更多個分配孔口。在另一實施方案中，分配孔口的邊緣是平滑的或基本上平滑的。

許多類型的盒適用于生物打印機。在一些實施方案中，盒與涉及通過一個或多個分配孔口擠出半固體或固體生物墨或支撐材料的生物打印相容。在一些實施方案中，盒與涉及通過一個或多個分配孔口分配液體或半固體細胞溶液、細胞懸液或細胞濃度的生物打印相容。在一些實施方案中，盒與非連續(xù)生物打印相容。在一些實施方案中，盒與連續(xù)和/或基本上連續(xù)的生物打印相容。

在一些實施方案中，盒是毛細管或微量移液管。在一些實施方案中，盒是注射器或針。許多內徑適合于基本上圓形或圓柱形的盒。在多種實施方案中，作為非限制性實例，合適的內徑包括1、10、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多μm，包括其中的增量。在另一些多種實施方案中，作為非限制性實例，合適的內徑包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多mm，包括其中的增量。在一些實施方案中，盒具有約1μm至約1000μm的內徑。在一個特定實施方案中，盒具有約500μm的內徑。在另一個特定實施方案中，盒具有約250μm的內徑。許多內部體積適于本文公開的盒。在多種實施方案中，作為非限制性實例，合適的內部體積包括0.1、1、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000或更多ml，包括其中的增量。在另一些多種實施方案中，作為非限制性實例，合適的內部體積包括1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、199、300、400、500或更多ml，包括其中的增量。

在一些實施方案中，盒與生物墨水和/或支撐材料到2D或3D接收表面上的噴墨打印相容，例如美國專利No.7,051,654中所述。在另一些實施例中，盒包括在本文所述的計算機代碼的控制下電壓選通噴嘴或針的形式的分配孔口。

在一些實施方案中，盒被標記以指示其內容物的組成。在另一些實施例中，盒被標記以指示包含在其中的生物墨的組成。在一些實施方案中，盒的表面是有色的。在一些實施方案中，盒的外表面被染色、涂漆、用筆標記、由貼紙標記或其組合。

在一些情況下，盒是單次使用歧管系統(tǒng)，例如美國專利No.6,712,963中所述，其在本文中公開用于教導單次使用歧管單元。簡而言之，一次性管和柔性壁容器可以通過無菌連接器組裝。這些歧管可與至少一個遠程控制的夾緊閥相互作用，該夾緊閥僅接合歧管管道的外表面。這樣的歧管和夾管閥系統(tǒng)可以與蠕動型泵一起使用，其與遠程操作的夾管閥一起可以由控制器操作，該控制器在無菌環(huán)境中提供生物技術流體的自動化和精確輸送，同時避免或減少清潔和質量保證程序。

所公開的盒優(yōu)選地配置成無菌地填充生物墨，然后保護生物墨免于暴露于環(huán)境以防止污染。因此，盒優(yōu)選地具有在填充之后保持封閉系統(tǒng)的密封件。盒還應優(yōu)選能夠將生物墨中的細胞保持在特定溫度。例如，盒可以是絕緣的。

所公開的盒還優(yōu)選地配置成噴射其中的生物墨。例如，可以通過空氣壓力、液壓、螺桿驅動的活塞等噴射生物墨。由于噴射可產生顯著的壓力，因此盒優(yōu)選地由剛性材料形成。

盒具有至少一個用于噴射/分散生物墨的孔口。然而，多個孔口可以加速打印。在一些情況下，3D打印機配置有兩個或更多個盒以分配兩種或更多種類型的細胞。然而，在一些情況下，單個盒包含兩個或更多個隔室和兩個或更多個孔口，以便同時分配兩種類型的細胞?；蛘?，可以將2種或更多種細胞類型組合在懸浮在生物聚合物中的細胞聚集體中，或者2種細胞類型可以在相同水凝膠基質內以優(yōu)化的比例混合在一起并同時擠出。

在一些實施方案中，盒含有本文所公開的含有懸浮在粘性基質中的細胞的組合物，使得細胞一旦從儲存(例如冷凍或非冷凍)取出即可存活并準備打印。在一些情況下，這意味著粘性基質足夠粘稠以保持細胞均勻地分散在組合物中，即不沉降到盒的底部。

還公開了用于產生生物墨組合物的試劑盒。在一些情況下，試劑盒包含含有細胞聚集體的組合物，所述細胞聚集體包含平均至少100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300多至200,000個細胞/聚集體。試劑盒還可包含非交聯(lián)的生物相容性聚合物，例如藻酸鹽。生物相容性聚合物可以與細胞聚集體在相同或不同的容器中。試劑盒還可以包含交聯(lián)劑，例如硫酸鈣。該試劑也可以與細胞聚集體在相同或不同的容器中，只要生物相容性聚合物和交聯(lián)劑在不同的容器中即可。試劑盒可以進一步包含用于混合試劑盒的成分的器件，例如注射器。

已經描述了本發(fā)明的多個實施方案。然而，應當理解，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以進行多種修改。因此，其他實施方案在所附權利要求的范圍內。

實施例

實施例1：MSC表征

可以培養(yǎng)、擴增和冷凍保存hMSC。當細胞解凍時，它們可以粘附到塑料上、分裂和增加數量，并且具有與包括分泌血管生成細胞因子在內的治療相關的生物學功能，并且當用炎癥分子(例如干擾素γ)和多能三線分化刺激時上調免疫調節(jié)酶。

hBM-MSC可以從幾個來源以冷凍保存的形式購得。在該實驗中，將一個1千萬個hBM-MSC(供應商，RoosterBio，Frederick，MD，部分#MSC001)的小瓶解凍并鋪板到T225培養(yǎng)瓶(Corning)中擴增培養(yǎng)基(RoosterBio，部分#KT-001)中。將hMSC以3,000個細胞/cm²接種并在37℃加濕的CO₂培養(yǎng)箱中孵育。在2小時內，許多細胞粘附于培養(yǎng)皿(圖1)，這是培養(yǎng)期間細胞擴增的先決條件。將MSC培養(yǎng)擴增4至5天，然后收獲。一旦細胞達到80％至90％的視覺細胞匯合，用TrypLE收獲試劑(Thermo Fisher)收獲細胞，并用稱為Nucleocounter NC100(Chemometec)的自動化系統(tǒng)定量細胞計數和活力。還測定細胞的功能。hMSC可以連續(xù)傳代多次，每次傳代產生2至5次群體倍增，這取決于所使用的培養(yǎng)基。最終目標是獲得足夠高的群體倍增水平的細胞，使得可以由單個供體產生數千或數萬個產物，并且保持細胞的生物學功能。

MSC的特征是標準流式細胞術標志物(圖2)。將MSC在DMEM+10％血清中培養(yǎng)7至10天，并通過流式細胞術分析。該細胞對CD73、CD90、CD105和CD166呈陽性，對CD14、CD34和CD45呈陰性。

生物學功能：為了測定hMSC分泌到培養(yǎng)基中的一組生物因子，從培養(yǎng)物中收獲hMSC，并以40,000個細胞/cm²在基礎培養(yǎng)基(RoosterBio)+2％牛血清(Atlas Biologics)中鋪板到24孔板中。將細胞在37℃下孵育24小時，+/-1小時，此時在-20℃冷凍下收集細胞培養(yǎng)基。然后使用Q-Plex^TM人血管生成(9-plex，Quansys Biosystmes)基于完全定量ELISA的化學發(fā)光測定法測定收集的培養(yǎng)基，從而允許同時測量9種血管生成生物標志物ANG-2、堿性FGF、HGF、IL-8、TIMP-1、TIMP-2、TNFα、VEGF。多重ELISA提供培養(yǎng)上清液中以pg/mL計的分析物，然后將其歸一化為接種到孔中的細胞數和培養(yǎng)時間，以獲得以pg/細胞/天計的特異性細胞因子分泌度量(圖3)。

擴增的hMSC在大量培養(yǎng)中向成脂(脂肪)和成骨(骨)分化(圖4)。使用提供的方案將市售的試劑盒用于將MSC分化成脂肪細胞和成骨細胞(StemPro成脂和成骨分化試劑盒，Life Technologies)。通過用于成脂的脂質囊泡的油紅O染色(圖4A)和用于成骨的鈣的茜素紅染色(圖4B)來檢測分化。

通過將MSC暴露于IFN-γ誘導吲哚胺2，3-雙加氧酶(IDO)表達和活性是人類MSC的免疫抑制功能(T細胞抑制)的關鍵(圖5)。簡言之，將MSC以40,000個細胞/cm²鋪板到具有或不具有IFN-γ的培養(yǎng)基中。孵育24小時后，收集培養(yǎng)基上清液并冷凍。通過使用標準比色測定法定量犬尿氨酸(IDO酶活性的產物)來測量IDO活性。

MSC可從多個供應商購得，并且可以以生物保存形式(通常為冷凍保存)分布?？梢詫⑸锉４婧蟮募毎伆宓脚囵B(yǎng)物中，這些細胞在培養(yǎng)物中首先粘附然后生長。這些細胞能夠表達多種治療相關功能，例如多譜系分化、生物功能性細胞因子和因子的分泌，并且可以被誘導調節(jié)免疫系統(tǒng)。

實施例2：MSC聚集體形成和表征

解凍hBM-MSC(RoosterBio，Frederick，MD，部分#MSC001)，并鋪板到T225燒瓶中RoosterBio生長培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4至5天直到80％至90％匯合，或在解凍后直接接種到Aggrewell 400Ex板(Stem Cell Technologies)中生長培養(yǎng)基(RoosterBio)中。對于在聚集體形成之前的細胞擴增，將細胞以3000個細胞/cm2接種，并在37℃培養(yǎng)箱中孵育直到準備好收獲。用TrypLE(Thermo Fisher)收獲細胞，并以1000個細胞/聚集體的密度鋪板到Aggrewell 400Ex中RoosterBio生長培養(yǎng)基中。在使用前根據制造商的說明用沖洗溶液沖洗Aggrewell一次。吸出沖洗溶液，并將單個細胞逐滴接種到每個微孔中以確保均勻的細胞分布。過夜，hMSC在37℃孵育的每個微孔中融合并形成多細胞聚集體(aggs)(圖6A)。通過用生長培養(yǎng)基沖洗從孔中收集的聚集體并轉移到50ml錐形管中。在通過重力使聚集體沉積在管的底部之后，通過在管中吸出生長培養(yǎng)基來獲得濃縮的聚集體(圖6B)。通常需要100,000至1,000,000個聚集體，每個聚集體1000至100,000個細胞以運行實驗或創(chuàng)建臨床尺寸的組織片。

將新鮮收集的hMSC聚集體鋪板到非粘附有蓋培養(yǎng)皿或平板中以培養(yǎng)多細胞聚集體。如果接種在非粘附培養(yǎng)板中，則聚集體將快速融合在一起(圖7A)，而如果接種到組織培養(yǎng)(TC)塑料中，則聚集體將附著到板上，并且單個細胞將生長到培養(yǎng)皿上(圖7B)。將培養(yǎng)物在37℃培養(yǎng)箱中孵育過夜，然后拍攝圖像。

將MSC聚集體接種到平板中用于細胞因子分析，并在37℃下孵育24小時，+/-1小時，此時在-20℃冷凍下收集細胞培養(yǎng)基。然后使用Q-Plex^TM人血管生成(9-plex，Quansys Biosystmes)基于完全定量ELISA的化學發(fā)光測定法測定收集的培養(yǎng)基，從而允許同時測量9種血管生成生物標志物ANG-2、堿性FGF、HGF、IL-8、TIMP-1、TIMP-2、TNFα、VEGF。多重ELISA提供培養(yǎng)上清液中以pg/mL計的分析物，然后將其歸一化為接種到孔中的細胞數和培養(yǎng)時間，以獲得以pg/細胞/天計的特異性細胞因子分泌量度(圖8)。MSC聚集體還能夠在干擾素γ存在下維持上調IDO活性的能力。

本實施例證明hMSC可以在細胞擴增后或解凍后直接形成聚集體。細胞維持其粘附培養(yǎng)塑料和融合的能力，這是MSC聚集體的關鍵屬性。聚集體內的細胞還保持諸如多譜系分化、細胞因子分泌和免疫調節(jié)的功能。

實施例3：在水凝膠中的聚集體包封和定制構建體的擠出

對于細胞包封，將單個hMSC細胞或新鮮收集的hMSC聚集體懸浮于溶解于不具有Ca²⁺或Mg²⁺的DPBS中的2％藻酸鹽(FMC BioPolymer)中。用針將細胞逐滴擠出至6.6mg/ml的CalCl₂溶液中以形成球形珠或擠出成有蓋培養(yǎng)皿中的定制形狀，然后浸入CaCl₂溶液以允許構建體交聯(lián)。吸出CaCl₂溶液并用生長培養(yǎng)基更換，然后在37℃培養(yǎng)箱中孵育構建體以使細胞成熟。用2μM鈣熒光素-AM/DPBS對包封的MSC進行染色并用熒光顯微鏡成像，其在藻酸鹽凝膠中顯示出具有高活力的聚集體(圖10B)。這些聚集體在培養(yǎng)5天后也保持其在凝膠中融合的能力(圖10C)。

結果與討論：

MSC聚集體對于生物打印是有吸引力的構型，這是因為容易打印以及聚集時細胞存活的機會更高。具有高活力的hMSC聚集體顯示它們可以使用Aggrewell^TM板一致地產生。這些聚集體具有融合在一起并附著在表面上以增殖的能力，兩者都是代謝活性細胞的關鍵功能參數。在37℃下于培養(yǎng)基中孵育新鮮收集的聚集體后早至幾小時觀察到了聚集體融合。

由于生物打印應用需要將細胞嵌入細胞相容性生物材料中，我們證明了封裝在2％藻酸鹽中并擠壓成定制形狀的單個細胞和聚集MSC具有高活力(圖10B)，并且它們維持其在培養(yǎng)物中融合的能力(圖10C)，因此確認聚集體細胞用于生物制造和生物打印應用的可行性。

雖然這種新產品形式已經在研究中使用，但是以聚集形式遞送這些細胞的許多實際方面還沒有得到解決。該領域中有許多假設收獲細胞，制成聚集體，然后立即使用。然而，為了廣泛采用，必須開發(fā)該技術以使MSC聚合體能夠立即使用?；旧?，必須使生物保存技術適應于MSC聚集體，并且必須維持其關鍵功能。

本文公開了hMSC聚集體的生物保存的最佳方法，具有“即用”制劑的經濟和實際益處的概述及其有用性的證明。由于以聚集形式使用的MSC及其它細胞需要數億至數十億個細胞，標準技術將需要幾個星期才能利用不廣泛的細胞擴增技術產生細胞。公開了作為聚集體遞送的高細胞數量的制劑作為縮短直至即用的顯著時間段(數周至數月)的方式。這些“即用”制劑可以對進行該工作的實驗室有重大的經濟影響，并且可以引起更快速的發(fā)現和產品開發(fā)工作。

實施例4：生物保存的MSC聚集體

本實施例的目的是證明聚集體可以生物保存并且仍然保留關鍵功能。這里，將聚集體以非冷凍形式儲存在細胞培養(yǎng)基(RoosterBio部分#KT-001)(用于細胞治療的臨床金標準儲液，常規(guī)鹽水+4％HSA(BioMed Supply)和Hypothermosol(Biolife Solutions))中后進行測試。在非冷凍儲存中保存MSC聚集體功能數天或在冷凍保存形式中數周至數年能力將是該技術在未來商業(yè)化和易于使用的核心，并且如果MSC聚集體可以以即用形式購買的話則將節(jié)省研究人員和產品開發(fā)人員數周時間。

材料與方法

解凍hBM-MSC(RoosterBio，Frederick，MD，部分#MSC001)，并鋪板到T225燒瓶中RoosterBio^TM生長培養(yǎng)基(RoosterBio Inc.)中，培養(yǎng)4至5天直至80％至90％匯合，或在解凍后直接接種到Aggrewell^TM 400Ex板(Stem Cell Technologies)中RoosterBio^TM生長培養(yǎng)基(RoosterBio Inc.)中。對于在聚集體形成之前的細胞擴增，將細胞以3,000個細胞/cm²接種，并在37℃培養(yǎng)箱中孵育直到準備好收獲。用TrypLE收獲細胞，并以1,000個細胞/聚集體的密度接種到Aggrewell^TM 400Ex中RoosterBio^TM生長培養(yǎng)基中。在使用前根據制造商的說明用沖洗溶液沖洗Aggrewell^TM一次。吸出沖洗溶液，并將單個細胞逐滴接種到每個微孔中以確保均勻的細胞分布。過夜，hMSC在37℃孵育的每個微孔中融合并形成多細胞聚集體(圖6A)。通過用生長培養(yǎng)基沖洗從孔中收集的聚集體并轉移到50ml錐形管中。在通過重力使聚集體沉積在管的底部之后，通過在管中吸出生長培養(yǎng)基來獲得濃縮的聚集體(圖6B)。

將新鮮收集的聚集體以1500個聚集體/ml儲液(即hypothermosol，10％FBS/DMEM或4％HSA/鹽水)重懸浮。將各溶液中的聚集體等分到2ml冷凍管中，并在4℃冰箱中避光保存。

聚集體功能性(融合、細胞粘附于皿、IDO及細胞因子分泌)

在研究的第3或7天，收集來自不同條件的聚集體并用PBS沖洗一次，將250個聚集體(或250,000個細胞)重懸并接種在12孔板的每個孔中2％FBS/基礎培養(yǎng)基中，所述基礎培養(yǎng)基具有或不具有10ng/ml IFN-γ。收集另外的聚集體并鋪板到非粘附的48孔板上以允許自發(fā)融合。在孵育24小時(圖11)和6天(圖12)后，對組織培養(yǎng)板上粘附的或在浮在非粘附表面上融合的細胞拍攝圖像。將粘附培養(yǎng)物上的培養(yǎng)基收集到15ml離心管中用于IDO和細胞因子分泌測定。用250μl胰蛋白酶/EDTA處理鋪板到組織培養(yǎng)板上的聚集體，并通過每10至15分鐘吸移混合45分鐘以從聚集體釋放細胞。用Nucleo對脫落的細胞計數以進行總活細胞計數。

為了測量細胞因子分泌，使用Q-Plex^TM人血管生成(9-plex，Quansys Biosystems)基于完全定量ELISA的化學發(fā)光測定法測定收集的上清液，從而允許同時測量九種血管生成生物標志物ANG-2、堿性FGF、HGF、IL-8、TIMP-1、TIMP-2、TNFc、VEGF。多重ELISA提供了培養(yǎng)上清液中以pg/mL計的分析物，然后將其歸一化為接種到孔中的細胞數和培養(yǎng)時間，以獲得以pg/細胞/天計的特異性細胞因子分泌度量。

為了測量IDO活性，使用如上文實施例1中所述的標準比色測定法測量犬尿氨酸的量。

結果與討論：

由于生物打印應用需要細胞在打印之前保持高活力，因此優(yōu)選聚集體可以在低溫條件下儲存一段時間(1至7天)，而不影響細胞的活力和功能。圖11至13顯示在具有4％HSA的hypothermosol溶液、生長培養(yǎng)基或鹽水中儲存3或7天后，聚集體(A)融合或(B)附著的能力。在儲存在hypothermosol和生長培養(yǎng)基中的聚集體中觀察到了相似的融合和粘附程度，然而，配制在4％HSA/鹽水中的聚集體不能存活，如通過漂浮和松散聚集體結構所示的。在培養(yǎng)6天后(圖12)，粘附在TC板上的聚集體在板中繼續(xù)增殖以匯合，證明細胞保持代謝活性。

在各種制劑和儲存持續(xù)期間，生物保存的聚集體的IDO活性(圖14)和細胞因子分泌(圖15)顯示它們保持其功能性，盡管該研究表明hypothermosol中生物保存的聚集體勝過生長培養(yǎng)基和4％HSA/鹽水儲液。

實施例5：MSC聚集物冷凍保存和解凍后功能

如上所述用Aggrewell^TM 400EX制備hMSC聚集體(1000個細胞/聚集體)。以1至5M細胞/ml在5(Biolife Solutions)中重構新鮮收集的聚集體。將聚集體在控制速率冷凍裝置(Biocision)中冷凍過夜，并轉移到氣相液氮中儲存。在冷凍保存至少7天后，將2小瓶MSC聚集體解凍到2％FBS/基礎培養(yǎng)基中并接種到組織培養(yǎng)板或非粘附板上以測試聚集體融合、細胞粘附和IDO及細胞因子功能測定(如上所述)。

為了證明聚集體的活力，使用約250,000個聚集體在15ml管中制造“環(huán)”形狀，通過將聚集體接種在20μl移液管尖端周圍。在1至4天后收集融合的MSC聚集體，用4％多聚甲醛固定，然后將樣品脫水并用蘇木精和伊紅(H&E)(Alizee Pathology)染色以觀察聚集體融合的緊密度。

結果

解凍后，hMSC聚集體能夠保持融合在一起的能力(圖16A)，并且單個細胞能夠附著于組織培養(yǎng)塑料并從聚集體生長(圖16B和16C)。此外，hMSC聚集體維持具有誘導型IDO表達(圖17)以及分泌血管生成細胞因子的能力(圖18)。可以制造冷凍聚集體以形成宏觀形狀例如環(huán)(圖19A和19B)，H&E染色(圖19C)證明由已經冷凍保存的融合聚集體形成的健康宏觀組織。

討論：

這是第一個證明hMSC聚集體可以冷凍保存的實施例。此外，hMSC聚集體的關鍵功能是在冷凍保存后維持，包括單個細胞從聚集體生長到TC塑料上的能力，聚集體融合到更大的宏觀組織中的能力，以及細胞分泌細胞因子和維持其誘導型IDO活性的能力。該新的冷凍保存組合物的益處是其實用性，其中冷凍保存的產品形式使得聚集體細胞的留存、按需供應相比于制備新鮮聚集體所需的復雜和冗長的制備步驟。根據需要解凍和使用聚集體的靈活性節(jié)省了研究者或臨床醫(yī)生數周至數月的細胞培養(yǎng)時間，如圖20A中的工藝流程圖所示。當轉移到cGMP制造設施時，節(jié)省的時間量轉換成成千上萬美元(圖20B)。

實施例6：藻酸鹽生物墨開發(fā)

生物墨需要包含細胞和生物相容性水凝膠基質以在儲存期間將單個細胞或聚集體懸浮在均勻的懸液中，以防止細胞凝集并維持細胞濃度均勻性。針對2種不同的鈣源(CaCl₂和CaSO₄)測試了高粘度高M和高G藻酸鹽，包括低粘度藻酸鹽。水凝膠基質中的鈣的量可以決定水凝膠的交聯(lián)程度，因此決定打印構建體的結構和完整性。在該研究中，對由于其緩釋作用而允許充分膠凝化以配制細胞的CaSO₄的量進行滴定以獲得最佳的可打印性，從而允許使用者在膠凝化之前操作和混合溶液的合理的“時間窗口”。在這里，我們顯示中至高粘度的高G藻酸鹽可用于制備具有良好的“可打印性”的生物墨，即保持“半固體”結構的能力(其特征在于易于從噴嘴擠出，凝膠厚度足以保持在適當位置的形狀，但是不會太堅固以至于其碎裂)和粘性，這是凝膠粘附并整合到其自身上用于構建多層形狀的能力。合適的制劑還將允許聚集體在儲存期間保持在均勻溶液中，以避免沉降和凝集(圖22)，這可能阻塞打印頭。最后，打印后CaCl₂洗滌處理增強形狀，并使細胞成熟時保持結構。

方法：

在不具有Ca2+或Mg2+的DPBS中制備2％至8％中等粘度(Sigma Aldrich)或高粘度(FMC Biopolymer)藻酸鹽，其具有高G(protanal)或高M(來自Sigma的manugel&藻酸鈉)。在DPBS中制備25mg/ml CaSO₄，并用于將藻酸鹽膠凝化至適當的稠度。使用不同體積的藻酸鹽，即10％v/v/、5％v/v或2.5％v/v，用不同的藻酸鹽類型測試，并將凝膠孵育過夜以確定“凝膠化”和“可打印性”的程度。

結果：

低粘度藻酸鹽沒有交聯(lián)得足夠好以即使在藻酸鹽濃度高達8％時也部分凝膠化結構。中/高粘度藻酸鹽(這里使用Manugel(一種高M藻酸鹽)和Protanal(一種高G藻酸鹽))更合適并且顯示出制備良好的可打印制劑。氯化鈣作為二價陽離子源不是最佳的，因此使用硫酸鈣更緩慢地將鈣釋放到混合物中，產生更均勻的水凝膠。在高G藻酸鹽中較高水平的硫酸鈣導致過于剛性的凝膠，當擠出注射器針頭組件時其碎裂。硫酸鈣的中間水平(1.25mg/mL，在2％protanal中混合)是理想的，使得藻酸鹽具有平滑的噴射稠度、形成多層的能力，其中新噴出的藻酸鹽粘附到先前擠出的材料(粘性)從而形成3D結構。低水平的硫酸鈣不足以凝膠化藻酸鹽，并且其仍然是流體-對于打印是不理想的(圖21)。

在打印3D結構之后，打印結構不是立即機械穩(wěn)定的。用小體積的溶解的氯化鈣“固化”打印結構，產生機械穩(wěn)定的結構。鑒定用于生物墨的如下過程和制劑：通過注射器混合(將2個注射器與連接器連接在一起并混合2至10次)將細胞或細胞聚集體混合到2％高G、中至高粘度藻酸鹽中；將所有溶液轉移至一個注射器中，加入硫酸鈣至終濃度為1.25mg/mL，并通過注射器混合進行混合；使藻酸鹽凝膠靜置5分鐘，或長達數周；將注射器或其他盒系統(tǒng)放置在3D打印機上并打印3D組織；并且根據應用將打印的組織置于培養(yǎng)物或生物反應器中。

因此，考慮了這樣的生物墨試劑盒，其包括：非膠凝化的水凝膠聚合物(例如藻酸鹽)的注射器或其他容器；允許2個注射器無菌連接的無菌連接裝置；包含交聯(lián)劑(例如，硫酸鈣)的另一注射器，以及包含含有細胞或細胞聚集體的第三注射器(圖24A和24B)。

使用該試劑盒，最終用戶可以快速、容易地和可重復地產生用于各種應用的含細胞的生物墨。

在一些情況下，所述生物墨在運輸之前與細胞凝膠化(圖25)，使得客戶可以完全跳過上述過程并將包含生物墨的盒插入3D打印機中并直接打印(即用)，從而節(jié)省相當多的時間。

實施例7：藻酸鹽生物墨的生物保存

材料與方法

生物墨A制備

通過在不斷攪拌下，在20ml hypothermosol中稀釋0.4g protanal(高G藻酸鹽)制備hypothermosol(BioLife Solutions)中的2％藻酸鹽。將MSC聚集體混合到2ml藻酸鹽溶液中，并加入10％的25mg/ml CaSO₄并使用注射器混合，以允許部分膠凝化。用石蠟膜密封注射器并在4℃下于黑暗中儲存，直到準備用于測試。

生物墨B制備

對于具有hypothermosol和膠原的藻酸鹽生物墨，根據制造商的說明制備3mg/ml膠原(Collagen Solutions Inc.)，其中將1份緩沖溶液加入到9份冰上的膠原溶液中并充分混合。為了使聚集體與膠原和藻酸鹽合并，將MSC聚集體加入1ml的3mg/ml膠原溶液中，然后與等體積的2％藻酸鹽混合。一旦溶液充分混合，則用注射器加入10％v/v的25mg/ml CaSO₄，并充分混合以部分凝膠化生物墨溶液。類似地，用石蠟膜密封注射器并在4℃下于暗處儲存直到準備用于測試。

在儲存2周后，將50至100μl的生物墨A和B擠出到15ml離心管中。將4ml的50mM檸檬酸鈉加入到凝膠中并在37℃下孵育以溶解凝膠。將管每10分鐘反轉保持30分鐘，直到凝膠溶解。通過以200×g離心5分鐘收集細胞。吸出上清液，將細胞重懸于2％FBS/基礎培養(yǎng)基中并鋪板到TC板中以允許附著。

為了制備對照細胞，將新鮮解凍的MSC用50mM檸檬酸鈉孵育30分鐘，類似于從藻酸鹽釋放MSC的過程，然后將其離心并鋪板到TC板上。

監(jiān)測MSC在TC培養(yǎng)板上的附著，并在接種后第1天和第6天拍攝圖像(圖23)，其中觀察到生物墨B中的MSC聚集體附著在TC板上以增殖，證明用于保存MSC聚集體的高度可行的生物墨制劑。生物墨A和B的可打印性都是粘性和強的，并且3D結構可以用部分固體凝膠成形。

除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語的含義與所公開的發(fā)明所屬領域的技術人員通常理解的相同。本文引用的出版物和其引用的材料通過引用特別地并入。

本領域技術人員將認識到或者能夠僅使用常規(guī)實驗來確定本文所述的本發(fā)明的具體實施方案的許多等同變化形式。這些等同變化形式旨在被所附權利要求所涵蓋。