本申請要求于2014年5月5日提交的美國臨時專利申請No.61/988,581和于2014年10月23日提交的美國臨時專利申請No.62/067,836的優(yōu)先權，通過援引將每篇的公開內容完整收入本文。

發(fā)明領域

本文中公開了包含編碼包含人序列的C3蛋白和/或C5蛋白的核酸序列的非人動物以及包含整個或部分人的C3和/或C5基因的轉基因非人動物。本文中還公開了表達人或人源化C3和/或C5蛋白的非人動物和使用包含人或人源化C3和/或C5核酸序列的非人動物的方法。

發(fā)明背景

補體蛋白C5和C3是用于治療與補體活化有關的多種人疾病，病癥和狀況(例如眼炎癥和視網膜變性疾病)的治療性靶物。在非人動物，例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠中例行實施特異性靶向人C5或人C3蛋白的治療性分子的藥動學(PK)和藥效學(PD)的評估。然而，由于這些治療性分子不靶向內源C5或C3蛋白，在某些非人動物中不能正確測定此類治療性分子的PD。

此外，在與活化的補體系統(tǒng)有關的疾病的各種非人動物模型中評估人特異性C5或C3蛋白拮抗劑的治療功效在此類物種特異性拮抗劑不與內源C5或C3蛋白相互作用的非人動物中是成問題的。

因而，需要如下的非人動物，例如嚙齒動物，例如鼠類動物，例如小鼠或大鼠，其中所述非人動物的C5和/或C3基因是整個或部分人源化的或者是用包含分別編碼人或人源化C5和/或C3蛋白的序列的人C5和/或C3基因替換的(例如，在內源非人基因座處)。需要以分別與分別表達功能性C5和/或C3蛋白但不包含人或人源化C5和/或C3基因的年齡匹配非人動物的血清中存在的C5和/或C3蛋白的濃度相似的濃度在血清中表達人或人源化C5和/或C3蛋白的此類人源化非人動物。

貫穿本說明書，援引了多份專利，專利申請和其它類型的出版物(例如，期刊論文，電子數(shù)據(jù)庫條目，等)。在此通過援引完整收錄本文中引用的所有專利，專利申請，和其它出版物的公開內容用于所有目的。

發(fā)明概述

提供了非人動物，其包含編碼包含人序列的C3和/或C5的核酸序列。

提供了轉基因非人動物，其包含整個或部分人的C3和/或C5基因。

提供了非人動物，其表達人或人源化C3和/或C5蛋白。

提供了非人動物，其具有內源非人動物C5和/或C3基因的替換(整個或部分)。

提供了非人動物，其包含內源非人C5和/或C3基因座處的C5和/或C3人源化(整個或部分)。

提供了具有人或人源化C5和/或C3基因的非人動物，其中所述非人動物不表達內源C5和/或C3蛋白，并且以分別與表達功能性內源C5和/或C3蛋白但不包含所述替換的年齡匹配非人動物的血清中存在的C5和/或C3蛋白的濃度相似的濃度在血清中表達人或人源化C5和/或C3蛋白。

在一個方面，提供了包含人或人源化C3和/或C5核酸序列的非人動物。

在一個方面，提供了經遺傳修飾的非人動物，其包含內源C5和/或C3基因座處編碼人或人源化C5和/或C3蛋白的基因對編碼內源C5和/或C3的基因的替換。提供了如下的嚙齒動物，例如小鼠或大鼠，其包含內源嚙齒動物C5基因座處人C5基因對內源C5基因的替換，和/或包含內源嚙齒動物C3基因座處人C3基因對內源C3基因的替換。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個方面，提供了經遺傳修飾的嚙齒動物，例如小鼠或大鼠，其包含內源嚙齒動物C5基因座處編碼人或人源化C5蛋白的人C5基因對編碼C5蛋白的嚙齒動物基因的替換，其中編碼人或人源化C5蛋白的所述人C5基因的表達在所述內源嚙齒動物C5基因座處的嚙齒動物調節(jié)元件的控制下。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個實施方案中，編碼人或人源化C5蛋白的所述人C5基因包含人C5基因的外顯子2到外顯子41。

在一個實施方案中，所述嚙齒動物是不能表達小鼠C5蛋白的小鼠。

在一個實施方案中，所述嚙齒動物是表達由內源小鼠C3基因編碼的小鼠C3蛋白的小鼠。

在一個實施方案中，所述嚙齒動物是表達人或人源化C3蛋白的小鼠。

在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠，其包含內源小鼠C3基因座處編碼人或人源化C3蛋白的人C3基因對編碼C3蛋白的小鼠基因的替換。

在一個實施方案中，編碼人或人源化C3蛋白的所述人C3基因的表達在所述內源小鼠C3基因座處的小鼠調節(jié)元件的控制下。

在一個方面，提供了經遺傳修飾的嚙齒動物，例如小鼠或大鼠，其包含內源嚙齒動物C3基因座處編碼人或人源化C3蛋白的人C3基因對編碼C3蛋白的嚙齒動物基因的替換，其中編碼人或人源化C3蛋白的所述人C3基因的表達在所述內源嚙齒動物C3基因座處的嚙齒動物調節(jié)元件的控制下。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個實施方案中，編碼人或人源化C3蛋白的所述人C3基因包含人C3基因的外顯子1到外顯子41。

在一個實施方案中，編碼人或人源化C3蛋白的所述人C3基因包含人C3基因的外顯子2到外顯子41。

在一個實施方案中，所述嚙齒動物是不能表達小鼠C3蛋白的小鼠。

在一個實施方案中，所述嚙齒動物是表達由內源小鼠C5基因編碼的小鼠C5蛋白的小鼠。

在一個實施方案中，所述嚙齒動物是表達人或人源化C5蛋白的小鼠。

在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠，其包含內源小鼠C5基因座處編碼人或人源化C5蛋白的人C5基因對編碼C5蛋白的小鼠基因的替換。

在一個實施方案中，編碼人或人源化C5蛋白的所述人C5基因的表達在所述內源小鼠C5基因座處的小鼠調節(jié)元件的控制下。

在一個方面，提供了表達人或人源化C5蛋白的經遺傳修飾的嚙齒動物，例如小鼠或大鼠，其中表達人或人源化C5蛋白的嚙齒動物包含正常的補體系統(tǒng)，例如表達人或人源化C5蛋白的嚙齒動物的血液，血漿或血清中補體蛋白的水平與表達功能性內源C5蛋白的嚙齒動物的血液，血漿或血清中補體蛋白的水平相似。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個方面，提供了從人C5基因表達C5蛋白的經遺傳修飾的嚙齒動物，例如小鼠或大鼠，其中所述嚙齒動物在其血清中表達人或人源化C5蛋白。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個實施方案中，表達人或人源化C5蛋白的嚙齒動物的血清與表達功能性內源C5蛋白的嚙齒動物(例如野生型小鼠或大鼠)具有大致相同的C5蛋白水平。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個實施方案中，所述小鼠以表達功能性內源C5蛋白但不包含內源小鼠C5基因座處人C5基因對內源C5基因的替換的年齡匹配小鼠的血清中存在的C5蛋白的水平的至少約10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，110％，120％，130％，140％，150％，160％，170％，180％，190％或200％的濃度在血清中表達人或人源化C5蛋白。

在一個實施方案中，所述小鼠以表達功能性內源C5蛋白但不包含內源小鼠C5基因座處人C5基因對內源C5基因的替換的年齡匹配小鼠的血清中存在的小鼠C5蛋白水平的約10％和約200％之間，約20％和約150％之間，或約30％和約100％之間的濃度在血清中表達人或人源化C5蛋白。

在一個實施方案中，所述小鼠以約10μg/ml和約150μg/ml之間，約10μg/ml和約125μg/ml之間，或約15μg/ml和約100μg/ml之間的濃度在血清中表達人或人源化C5蛋白。

在一個實施方案中，所述小鼠以至少約10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，125或150μg/ml的濃度在血清中表達人或人源化C5蛋白。

在一個方面，提供了表達人或人源化C3蛋白的經遺傳修飾的嚙齒動物，例如小鼠或大鼠，其中表達人或人源化C3蛋白的嚙齒動物包含正常的補體系統(tǒng)，即表達人或人源化C3蛋白的嚙齒動物的血液，血漿或血清中補體蛋白的水平與表達功能性內源C3蛋白的嚙齒動物的血液，血漿或血清中補體蛋白的水平相似。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個方面，提供了自人C3基因表達C3蛋白的經遺傳修飾的嚙齒動物，例如小鼠或大鼠，其中所述嚙齒動物在其血清中表達人或人源化C3蛋白。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個實施方案中，表達人或人源化C3蛋白的嚙齒動物的血清具有與表達功能性內源C3蛋白的嚙齒動物(例如野生型小鼠或大鼠)大約相同的C3蛋白水平。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個實施方案中，所述小鼠以表達功能性內源C3蛋白但不包含內源小鼠C3基因座處人C3基因對內源C3基因的替換的年齡匹配小鼠的血清中存在的C3蛋白的水平的至少約10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％，110％，120％，130％，140％，150％，160％，170％，180％，190％或200％的濃度在血清中表達人或人源化C3蛋白(hC3)。

在一個實施方案中，所述小鼠以表達功能性內源C3蛋白但不包含內源小鼠C3基因座處人C3基因對內源C3基因的替換的年齡匹配小鼠的血清中存在的小鼠C3蛋白水平的約10％和約200％之間，約20％和約150％之間，或約30％和約100％之間的濃度在血清中表達人或人源化C3蛋白。

在一個實施方案中，所述小鼠以約100μg/ml和約1500μg/ml之間，約200μg/ml和約1250μg/ml之間，或約300μg/ml和約1000μg/ml之間的濃度在血清中表達人或人源化C3蛋白。

在一個實施方案中，所述小鼠以至少約100，200，300，400，500，600，700，800，900，1000，1250或1500μg/ml的濃度在血清中表達人或人源化C3蛋白。

在一個方面，提供了經遺傳修飾的嚙齒動物，其包含內源嚙齒動物C5基因座處編碼人或人源化C5蛋白的人C5基因對編碼C5蛋白的嚙齒動物基因的替換，其中編碼人或人源化C5蛋白的所述人C5基因的表達在所述內源嚙齒動物C5基因座處的嚙齒動物調節(jié)元件或序列的控制下，且其中所述嚙齒動物進一步包含人C3基因，其包含內源嚙齒動物C3基因座處編碼人或人源化C3蛋白的人C3基因對編碼C3蛋白的嚙齒動物基因的替換，其中編碼人或人源化C3蛋白的所述人C3基因的表達在所述內源嚙齒動物C3基因座處的嚙齒動物調節(jié)元件或序列的控制下。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個實施方案中，所述小鼠不能表達小鼠C5蛋白且不能表達小鼠C3蛋白。

在一個實施方案中，所述內源嚙齒動物C5基因座和/或嚙齒動物C3基因座處的嚙齒動物調節(jié)元件或序列來自小鼠或大鼠。

在一個實施方案中，所述嚙齒動物調節(jié)元件或序列是嚙齒動物C5基因座和/或嚙齒動物C3基因座處的內源嚙齒動物調節(jié)元件或序列，來自小鼠或大鼠。

在一個方面，提供了表達人或人源化C5和/或C3蛋白的非人動物，例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠，其中所述非人動物自內源非人C5基因座和/或內源非人C3基因座表達人或人源化C5和/或C3蛋白。在一個實施方案中，所述非人動物是嚙齒動物。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個方面，提供了自內源小鼠C5基因座表達人或人源化C5蛋白的經遺傳修飾的小鼠，其中內源小鼠C5基因已經整個或部分用人C5基因替換。

在一個實施方案中，內源小鼠C5基因座處的約75.8kb(包括外顯子2到42和3’非翻譯序列)刪除且用包含人C5基因的外顯子2到41的約97kb人C5基因序列替換。在一個具體的實施方案中，所述人C5基因包含人BAC CTD-2559I19的人C5基因的外顯子2至42。在一個具體的實施方案中，所述C5基因包含小鼠C5外顯子1和人C5外顯子2到42。

在一個方面，提供了包含編碼人或人源化C5蛋白的核苷酸序列的經遺傳修飾的小鼠，其中編碼人或人源化C5蛋白的所述核苷酸序列替換整個或部分編碼內源小鼠C5蛋白的內源核苷酸序列。

在一個方面，提供了自內源小鼠C3基因座表達人或人源化C3蛋白的遺傳修飾的小鼠，其中內源小鼠C3基因已經整個或部分用人C3基因替換。

在一個實施方案中，內源小鼠C3基因座的一部分(包括外顯子1上游的5’調節(jié)元件到外顯子41)刪除且用包含人C3基因的外顯子1上游的5’調節(jié)元件到外顯子41的人C3基因序列替換。在一個具體的實施方案中，人C3基因包含整個人C3編碼區(qū)。

在一個實施方案中，內源小鼠C3基因座的一部分(包括內含子1的一部分和外顯子2到41)刪除且用包含人C3基因的內含子1的一部分和外顯子2到外顯子41的人C3基因序列替換。在一個具體的實施方案中，C3基因包含小鼠C3外顯子1和人C3外顯子2到41。

在一個方面，提供了用于生成人源化C5嚙齒動物的方法，其包括用人C5基因序列替換編碼嚙齒動物C5蛋白的嚙齒動物C5基因序列，所述人C5基因序列包含編碼人或人源化C5蛋白的人C5基因序列的一個或多個外顯子。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個實施方案中，所述替換在內源嚙齒動物C5基因座處，而且將包含編碼人或人源化C5蛋白的人C5基因序列的一個或多個外顯子的人C5基因序列與內源嚙齒動物C5基因座處的嚙齒動物調節(jié)元件或序列可操作連接。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個實施方案中，所述嚙齒動物調節(jié)元件或序列是自小鼠衍生的。在一個實施方案中，所述嚙齒動物調節(jié)元件或序列是自大鼠衍生的。

在一個實施方案中，所述嚙齒動物調節(jié)元件或序列是嚙齒動物C5基因座處的內源嚙齒動物調節(jié)元件或序列。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個實施方案中，替換嚙齒動物C5基因序列的人C5基因序列包含人C5基因序列的至少一個外顯子。在其它實施方案中，替換嚙齒動物C5基因序列的人C5基因序列包含人C5基因序列的至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，或40個外顯子。在一個實施方案中，替換嚙齒動物C5基因序列的人C5基因序列包含人C5基因序列的所有41個外顯子。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個實施方案中，所述替換在內源嚙齒動物C5基因座處，而且將包含編碼人或人源化C5蛋白的人C5基因序列的一個或多個外顯子的人C5基因序列與內源嚙齒動物C5基因座處的內源嚙齒動物調節(jié)元件或序列可操作連接。

在一個方面，提供了用于生成人源化C5小鼠的方法，其包括用編碼人或人源化C5蛋白的人C5基因序列替換編碼小鼠C5蛋白的小鼠C5基因序列。

在一個實施方案中，所述替換在內源小鼠C5基因座處，而且將編碼人或人源化C5蛋白的人C5基因與內源小鼠C5基因座處的小鼠調節(jié)元件或序列可操作連接。

在一個實施方案中，所述替換在內源小鼠C5基因座處，而且將編碼人或人源化C5蛋白的人C5基因與內源小鼠C5基因座處的內源小鼠調節(jié)元件或序列可操作連接。

在一個方面，提供了用于生成人源化C3嚙齒動物的方法，其包括用人C3基因序列替換編碼嚙齒動物C3蛋白的嚙齒動物C3基因序列，所述人C3基因序列包含編碼人或人源化C3蛋白的人C3基因序列的一個或多個外顯子。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個實施方案中，所述替換在內源嚙齒動物C3基因座處，而且將包含編碼人或人源化C3蛋白的人C3基因序列的一個或多個外顯子的人C3基因序列與內源嚙齒動物C3基因座處的嚙齒動物調節(jié)元件或序列可操作連接。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個實施方案中，所述嚙齒動物調節(jié)元件或序列是自小鼠衍生的。在一個實施方案中，所述嚙齒動物調節(jié)元件或序列是自大鼠衍生的。

在一個實施方案中，所述嚙齒動物調節(jié)元件或序列是嚙齒動物C3基因座處的內源嚙齒動物調節(jié)元件或序列。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個實施方案中，替換嚙齒動物C3基因序列的人C3基因序列包含人C3基因序列的至少一個外顯子。在其它實施方案中，替換嚙齒動物C3基因序列的人C3基因序列包含人C3基因序列的至少2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，或40個外顯子。在一個實施方案中，替換嚙齒動物C5基因序列的人C3基因序列包含人C3基因序列的所有41個外顯子。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個實施方案中，所述替換在內源嚙齒動物C3基因座處，而且將包含編碼人或人源化C3蛋白的人C3基因序列的一個或多個外顯子的人C3基因序列與內源嚙齒動物C3基因座處的內源嚙齒動物調節(jié)元件或序列可操作連接。

在一個方面，提供了用于生成人源化C3小鼠的方法，其包括用編碼人或人源化C3蛋白的人C3基因序列替換編碼小鼠C3蛋白的小鼠C3基因序列。

在一個實施方案中，所述替換在內源小鼠C3基因座處，而且將編碼人或人源化C3蛋白的人C3基因與內源小鼠C3基因座處的內源小鼠調節(jié)元件或序列可操作連接。

在一個實施方案中，所述替換在內源小鼠C3基因座處，而且將編碼人或人源化C3蛋白的人C3基因與內源小鼠C3基因座處的小鼠調節(jié)元件或序列可操作連接。

在各個方面，本文中描述的經遺傳修飾的非人動物(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)包含其種系中的遺傳修飾。

在一個方面，提供了包含如本文中描述的遺傳修飾的非人動物(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)胚胎。

在一個方面，提供了包含如下供體細胞的非人動物(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)宿主胚胎，所述供體細胞包含如本文中描述的遺傳修飾。

在一個方面，提供了包含如本文中描述的遺傳修飾的多能或全能非人動物(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)細胞。在一個實施方案中，所述細胞是嚙齒動物細胞。在一個實施方案中，所述細胞是小鼠細胞。在一個實施方案中，所述細胞是嚙齒動物ES細胞。在一個實施方案中，所述細胞是小鼠ES細胞。

在一個方面，提供了非人動物(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)卵，其中所述非人動物卵包含異位非人動物染色體，其中所述異位非人動物染色體包含如本文中描述的遺傳修飾。在一個實施方案中，所述非人動物是嚙齒動物。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是小鼠。在一個實施方案中，所述嚙齒動物是大鼠。

在一個方面，經遺傳修飾以包含人C5基因或人C3基因的小鼠胚胎，卵，或細胞是選自下述各項的C57BL品系的小鼠的：C57BL/A，C57BL/An，C57BL/GrFa，C57BL/KaLwN，C57BL/6，C57BL/6J，C57BL/6ByJ，C57BL/6NJ，C57BL/10，C57BL/10ScSn，C57BL/10Cr，和C57BL/Ola。在另一個實施方案中，所述小鼠是選自由下述品系組成的組的129品系：129P1，129P2，129P3，129X1，129S1(例如，129S1/SV，129S1/Svlm)，129S2，129S4，129S5，129S9/SvEvH，129S6(129/SvEvTac)，129S7，129S8，129T1，129T2(見例如Festing et al.(1999)Revised nomenclature for strain 129 mice,Mammalian Genome 10:836，也見Auerbach et al.(2000)Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines)。在一個具體的實施方案中，所述經遺傳修飾的小鼠是前述129品系和前述C57BL/6品系的混合物。在另一個具體的實施方案中，所述小鼠是前述129品系的混合物，或前述BL/6品系的混合物。在一個具體實施方案中，所述混合物的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一個實施方案中，所述小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在還有另一個實施方案中，所述小鼠是BALB品系和另一種前述品系的混合物。在一個實施方案中，所述小鼠是Swiss或Swiss Webster小鼠。

在又一個方面，本文中提供了用于鑒定能夠調控補體活化的化合物的方法，其包括對本文中公開和描述的任何非人動物，例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠施用所述化合物；并測定嚙齒動物中的補體活化是否受到調控，由此鑒定能夠調控補體活化的化合物。在一個實施方案中，所述化合物是小分子化學化合物，抗體，蛋白質，抑制性核酸，或其任何組合。在本文中公開的任何實施方案的另一個實施方案中，所述化合物通過提高補體活性來調控補體活化。在本文中公開的任何實施方案的另一個實施方案中，所述化合物通過降低補體活性來調控補體活化。在本文中公開的任何實施方案的另一個實施方案中，測定嚙齒動物的血清以測定嚙齒動物中的補體活化是否受到調控。在又一個實施方案中，測定法是CH₅₀補體篩選測定法。

本文中描述的每個方面和實施方案能夠一起使用，除非根據(jù)實施方案或方面的上下文明確或清楚排除。

附圖說明

圖1提供小鼠(頂部)和人(底部)C5基因組基因座的圖示(不按比例)。標示了分別經刪除和替換以產生人源化C5小鼠的小鼠和人C5基因的區(qū)域。

圖2提供小鼠(mC3)和人源化(hC3)C3基因組基因座的圖示(不按比例)。(A)刪除跨越5’調節(jié)元件和從外顯子1到外顯子41的編碼區(qū)的小鼠C3基因，并且用人C3基因的5’調節(jié)元件和從外顯子1到外顯子41的編碼區(qū)和loxP位點替換，如分別以粗線和箭標示的。(B)刪除跨越內含子1的一部分和從外顯子2到外顯子41的編碼區(qū)的小鼠C3基因，并且用人C5基因的內含子1的一部分和從外顯子2到外顯子41的編碼區(qū)和loxP位點替換，如分別以粗線和箭標示的。

圖3顯示小鼠補體在溶血測定法中具有比人補體要低的活性。

圖4顯示物種特異性抗C5單克隆抗體以物種特異性方式阻斷補體溶血活性。

圖5顯示人源化C5小鼠是功能性小鼠C5敲除。(A)人C5或C3蛋白的添加分別重建C5或C3消減的人血清中的溶血活性。(B)小鼠(而非人)C5蛋白重建C5^-/-和人源化C5小鼠血清中的溶血活性。(C)人源化C5小鼠血清中人C5蛋白的水平比人血清中低三倍。(D)人源化C5小鼠中的給藥前補體C5水平在雄性和雌性之間變化。在人源化C5小鼠血清中存在20-100μg/mL的人C5范圍。

圖6顯示人C3和C5蛋白(而非單獨的人C5蛋白)的添加重建C5^-/-小鼠血清中的溶血活性。

圖7顯示人源化C5小鼠血清需要添加人C3蛋白以實現(xiàn)野生型水平的小鼠溶血活性。

圖8顯示使用400μg/mL人C3蛋白(A)和800μg/mL人C3蛋白(B)對來自暴露于抗人C5抗體(C5Ab)的人源化C5小鼠的血清樣品實施的溶血測定法的結果。

圖9顯示對于研究中的所有動物(A)和雌性(頂部)和雄性(底部)動物(B)，測量抗人C5抗體水平作為注射后時間的函數(shù)的藥動學測定法的結果。

圖10A顯示對野生型小鼠血清添加人C3蛋白能增強溶血功能，但沒有達到在正常人血清中觀察到的相同程度(對于來自小鼠的每個數(shù)據(jù)點，混合來自3只動物的血清)。圖10B顯示當補充人C3蛋白時，能在人源化C5^hu/hu小鼠中恢復溶血功能。

圖11顯示對自C3敲除小鼠衍生的血清添加人C3蛋白能挽救溶血功能(對于來自小鼠的每個數(shù)據(jù)點，混合來自3只動物的血清)。

圖12顯示僅將人C3蛋白添加至C5敲除小鼠血清不能挽救溶血功能(對于來自小鼠的每個數(shù)據(jù)點，混合來自3只動物的血清)。

發(fā)明詳述

補體系統(tǒng)是先天免疫系統(tǒng)的一個必要組分，并且作為針對侵入性病原體的防御機制起至關重要的作用，引發(fā)適應性免疫應答，并且?guī)椭ッ庖邚秃衔锖偷蛲黾毎ｋm然補體系統(tǒng)在許多保護性免疫功能中起至關重要的作用，但是補體活化是極其多種自身免疫和炎性疾病過程中的組織損傷的重要介導物。

本文中描述的發(fā)明格外提供了如下的非人動物，其在血清中以與非人動物中的內源C5和/或C3蛋白的野生型表達相似的濃度表達人或人源化C5和/或C3蛋白。能夠表達人或人源化C5和/或C3蛋白的非人動物的成功工程化為在適合于大規(guī)模和高通量藥物篩選測定法的實驗室動物中重演人補體系統(tǒng)提供了一種需要且有用的工具。本文中還提供了使用本文中描述的非人動物(諸如嚙齒動物)鑒定能夠調控補體活化的化合物的方法。所述方法部分基于發(fā)明人的如下發(fā)現(xiàn)，即雖然C5蛋白的補體活性是物種特異性的(即，人C5蛋白不能替代小鼠C5蛋白)，但是人C3蛋白的補體活性能夠在小鼠血清補體活性中替代小鼠C3蛋白。

通用技術

除非另外指明，本發(fā)明的實踐會采用本領域技術人員公知的分子生物學，微生物學，細胞生物學，生物化學，核酸化學，和免疫學的常規(guī)技術。文獻中完全解釋了此類技術，諸如Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第四版(Sambrook et al.,2012)和Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版(Sambrook and Russel,2001)(在本文中統(tǒng)稱為“Sambrook”)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等編,1987，包括到2014年的增補)；PCR:The Polymerase Chain Reaction(Mullis等編,1994)；Antibodies:A Laboratory Manual,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(Greenfield編,2014),Beaucage等編,Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,John Wiley&Sons,Inc.,New York,2000(包括到2014年的增補)和Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells(Makrides編,Elsevier Sciences B.V.,Amsterdam,2003)。

定義

如本文中使用的，術語“蛋白質”包括多肽，肽，多肽片段，和融合多肽。

如本文中使用的，“核酸”指單鏈或雙鏈形式的共價連接在一起的兩個或更多個脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸。

“可操作連接”表示核酸表達控制序列(諸如啟動子)和第二核酸序列之間的功能性連接，其中表達控制序列指導與第二序列對應的核酸的轉錄。

術語“替換”在提到基因替換時指將外源遺傳物質置于內源遺傳基因座處，由此用直向同源或同源核酸序列替換整個或部分內源基因。在一種情況中，用相應的人基因或其片段替換內源非人基因或其片段。相應的人基因或其片段是如下的人基因或片段，其是被替換的內源非人基因或其片段的直向同系物，同系物，或者與被替換的內源非人基因或其片段在結構和/或功能方面基本上相同或相同。如下文實施例中證明的，用與人C3和/或C5基因基因座對應的核苷酸序列替換內源非人(例如嚙齒動物，諸如小鼠)C3和/或C5基因基因座的核苷酸序列。在另一個實施方案中，在刪除內源基因或使內源基因成為非功能性(諸如通過插入錯義突變或過早終止密碼子)并將相應的人基因或其片段在分開的位置處插入種系中時能發(fā)生基因替換。

如在短語“人源化C3等位基因”，或“人源化C5等位基因”，或“人源化C3基因”，或“人源化C5基因”中使用的，術語“人源化”包括但不限于其中整個或部分內源非人C3和/或C5基因或等位基因用人C3和/或C5基因或等位基因的對應部分替換的實施方案。例如，在一些實施方案中，術語“人源化”指在不替換非人動物的內源非編碼區(qū)(諸如但不限于啟動子，5’和/或3’非翻譯區(qū)，增強子元件，等)的情況中用人C3和/或C5基因或等位基因的對應編碼區(qū)完全替換內源非人C3和/或C5基因或等位基因的編碼區(qū)(例如，外顯子)。在一些實施方案中，所述非人動物是嚙齒動物，諸如大鼠或小鼠。

“人源化蛋白質”包括但不限于其中用人C3和/或C5蛋白的對應部分替換整個或部分所編碼的內源非人C3和/或C5蛋白的實施方案。在一些實施方案中，“人源化蛋白質”可以由人源化C3和/或C5基因或等位基因編碼，但是仍然編碼完全人的C3和/或C5蛋白(諸如但不限于，其中內源非人C3和/或C5基因或等位基因的整個編碼區(qū)(例如外顯子)用人C3和/或C5基因或等位基因的對應編碼區(qū)替換，但是不替換非人動物的內源非編碼區(qū)(諸如但不限于啟動子，5’和/或3’非翻譯區(qū)，增強子元件，等)。在一些實施方案中，所述非人動物是嚙齒動物，諸如大鼠或小鼠。

如本文中使用的，“調控”指化合物改變補體系統(tǒng)的活性的能力。在一個實施方案中，化合物對補體系統(tǒng)的調控指降低受試者(例如嚙齒動物，諸如小鼠)中的補體活化。在另一個實施方案中，化合物對補體系統(tǒng)的調控指提高受試者中補體介導的活性。

如本文中使用的，術語“嚙齒動物”指嚙齒目(Rodentia)的任何成員。嚙齒動物的例子包括但不限于小鼠，大鼠，松鼠，草原土撥鼠，豪豬，河貍，豚鼠，和倉鼠。在一個實施方案中，嚙齒動物是大鼠。在另一個實施方案中，嚙齒動物是小鼠。

除非本文中另外定義，本文中使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員的通常理解相同的含義。

如本文中使用的，單數(shù)術語“一個”，“一種”，和“該/所述”包括復數(shù)所指物，除非上下文另外明確指明。

意圖是，貫穿本說明書給出的每個最大的數(shù)值限制包括每個更低的數(shù)值限制，就像在本文中明確書寫此類更低的數(shù)值限制一樣。貫穿本說明書給出的每個最小的數(shù)值限制會包括每個更高的數(shù)值限制，就像在本文中明確書寫此類更高的數(shù)值限制一樣。貫穿本說明書給出的每個數(shù)值范圍會包括落入此類較寬的數(shù)值范圍內的每個較窄的數(shù)值范圍，就像在本文中明確書寫所有此類較窄的數(shù)值范圍一樣。

補充系統(tǒng)

補體(免疫系統(tǒng)的一種必要組分)由超過30種血清和細胞蛋白質組成，它們牽涉兩種有聯(lián)系的生物化學級聯(lián)，即經典途徑和旁路途徑。補體發(fā)揮幫助免疫系統(tǒng)破壞侵入性微生物及維持組織穩(wěn)態(tài)的功能。

然而，過度或不受調節(jié)的補體活化促成組織損傷，并且與極其多種與補體活化有關的人疾病，病癥和狀況(例如眼炎癥和視網膜變性疾病)有關(參見Makrides(1998)Therapeutic inhibition of the complement system,Pharmacological Reviews 50(1):59-87；及Mollnes et al.(2006)Strategies of therapeutic complement inhibition,Molecular Immunology 43；107-121)。已知與異常補體活化有關的其它疾病或狀況包括但不限于變應性哮喘和伴隨的氣道炎癥和氣道高反應性(“AHR”)，慢性阻塞性肺病(“COPD”)，變應性支氣管肺曲菌病，過敏性肺炎，嗜酸細胞性肺炎，肺氣腫，支氣管炎，過敏性支氣管炎，支氣管擴張，囊性纖維化，結核病，過敏性肺炎，職業(yè)性哮喘，結節(jié)病，反應性氣道疾病綜合征，間質性肺病，嗜酸細胞增多綜合征，鼻炎，鼻竇炎，運動誘發(fā)性哮喘，污染誘發(fā)性哮喘，咳嗽變異性哮喘，寄生性肺病，呼吸道合胞病毒(“RSV”)感染，副流感病毒(“PIV”)感染，鼻病毒(“RV”)感染和腺病毒感染，和缺血再灌注損傷(參見例如美國專利申請公開號2005/0260198，通過援引將其收入本文)。

補體C5基因和蛋白

C5基因編碼血清補體C5蛋白，其在炎性和細胞殺傷過程中起重要作用。成熟C5蛋白由通過二硫鍵連接的α和β鏈構成。C5蛋白受到轉化酶切割，產生活化肽C5a(一種自α多肽衍生的過敏毒素，其在很大程度上是促炎性的)和C5b(一種自β多肽衍生的大分子裂解產物，其與其它補體成分形成復合物以形成膜攻擊復合物(MAC)，該膜攻擊復合物牽涉靶細胞的滲透性溶解)。

人C5。官方符號：C5；NCBI基因ID：727；主要來源：HGNC：1331；RefSeq mRNA ID：NM_001735.2；UniProt ID：P01031；基因組裝配：GRCh38；位置：chr9:120,952,335-121,050,275-鏈。

人C5基因位于染色體9上，在9q33-q34處。人C5基因具有41個外顯子且編碼長度為1676個氨基酸的前體多肽，其包含18個氨基酸的信號肽，655個氨基酸的β鏈和999個氨基酸的α鏈。在補體活化期間，α鏈受到切割，由此產生74個氨基酸的C5a，其是有力的促炎性過敏毒素。

人中的C5缺乏與對重度復發(fā)性感染的易感性增加有關。

C5基因在數(shù)種物種間是保守的，所述物種包括靈長類，例如黑猩猩，恒河猴，其它哺乳動物，例如犬，牛，嚙齒動物(例如小鼠)，雞，斑馬魚和青蛙。

小鼠C5。官方符號：Hc；NCBI基因ID：15139；主要來源：MGI：96031；RefSeq mRNA ID：NM_010406.2；UniProt ID：P06684；基因組裝配：GRCm38；位置：chr2:34,983,331-35,061,449-鏈。

小鼠C5基因位于染色體2上，在2 23.22cM處。小鼠C5基因具有42個外顯子且編碼長度為1680個氨基酸的前體多肽，其包含18個氨基酸的信號肽，656個氨基酸的β鏈和1002個氨基酸的α鏈。在補體活化期間，α鏈受到切割，由此產生77個氨基酸的C5a，其是有力的促炎性過敏毒素。

在數(shù)種常見的實驗室小鼠品系中觀察到C5缺陷，所述品系具有共同的cDNA 5’末端附近2個堿基對的刪除，其導致不能分泌C5；因此，這些小鼠是功能上C5缺陷的，即C5敲除(6種此類品系是A/HeJ，AKR/J，DBA/2J，NZB/B1NJ，SWR/J，和B10.D2/oSnJ)(參見例如Wetzel et al.(1990)Deficiency of the murine fifth complement component(C5):a 2-base pair deletion in a 5’exon,J Biol Chem 265:2435-2440)。也可以遵循本領域中已知的標準規(guī)程產生C5敲除小鼠。

補體C3基因和蛋白

C3基因編碼血清補體蛋白C3，其在經典和旁路補體活化途徑的活化中起中心作用。

人C3基因位于染色體19上，在19p13.3-p13.2處。人C3基因具有41個外顯子且編碼1663個氨基酸的前體多肽，其包含22個氨基酸的信號肽，645個氨基酸的β鏈和992個氨基酸的α鏈。在補體活化期間，α鏈受到切割，由此產生9種不同的肽，包括77個氨基酸的C5a，其是有力的促炎性過敏毒素。

人中的C3缺陷與對細菌性感染的易感性增加有關。

C3基因在數(shù)種物種之間是保守的，包括靈長類，例如黑猩猩，獼猴，其它哺乳動物，例如犬，牛，嚙齒動物(例如小鼠)，雞，斑馬魚和青蛙。

小鼠C3基因位于染色體17上，在17 29.72cM19處。小鼠C3基因具有41個外顯子且編碼1663個氨基酸的前體多肽，其包含24個氨基酸的信號肽，642個氨基酸的β鏈和993個氨基酸的α鏈。在補體活化期間，α鏈受到切割，由此產生9種不同的肽，包括78個氨基酸的C3a，其是有力的促炎性過敏毒素。

已經遵循本領域中已知的標準程序產生C3敲除小鼠(參見例如Drouin et al.(2001)Cutting edge:the absence of 3 demonstrates a role for complement in Th2effector functions in a murine model of pulmonary allergy,J Immunology 167:4141-4144)。

C5和C3補體蛋白的物種特異性

本文中顯示了，人源化C5小鼠是功能上C5缺陷的，因為至少一些內源補體蛋白展示物種特異性，即內源小鼠補體蛋白不能與人C5蛋白在功能上相互作用。對從人源化C5小鼠或C5敲除小鼠獲得的血清測試補體活性；沒有觀察到補體溶血活性，除非添加人C3和人C5蛋白兩者。

本文中還顯示，將人C3添加至自C3敲除小鼠獲得的血清能夠挽救溶血功能；當將人C3蛋白添加至血清時，在C3敲除小鼠中觀察到補體活性。

C5蛋白的補體活性是物種特異性的，即人C5蛋白不能在小鼠血清補體活性(即溶血)測定法中替代小鼠C5蛋白。

比較而言，C3蛋白的補體活性看來不是相似地物種特異性的，即人C3蛋白能夠在小鼠血清補體活性(即溶血)測定法中替代小鼠C3蛋白。

對補體系統(tǒng)的治療性抑制

用于治療性補體抑制的兩種靶物是補體活化肽C5a和C3a，其在補體活化時在經典和旁路途徑兩者中通過酶促切割分別自補體蛋白C5和C3產生(參見Markides(1998)；Mollnes et al.(2006))。

例如，通過抗體(例如美國專利No.6,355,245中公開的抗體)阻斷C5切割是在與補體活化有關的疾病中用于補體抑制的一種可能的治療性策略。

人C5和C3抑制劑的物種特異性

通常在非人動物(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)中對靶向補體蛋白C5或C3的候選治療性分子評估藥動學(PK)和藥效學(PK)。也在與補體活化有關的人疾病，病癥和狀況的非人動物(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)模型中對此類治療性分子測試體內治療功效。

然而，在嚙齒動物(特別是小鼠)中不能適當評估對人補體蛋白C5或C3特異性的治療性分子(即人特異性C5或C3抑制劑)的PD或體內治療功效，因為這些治療性分子的靶物是缺失的。由于這些蛋白質的上文提到的物種特異性，使用表達人C5或C3補體蛋白的轉基因非人動物(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)沒有克服此問題。

因而，為了在非人動物(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)中評估人特異性C5或C3蛋白拮抗劑或抑制劑的PD和體內治療性功效，期望用人C5和/或C3蛋白替換內源C5和/或C3蛋白。此外，為了避免人C5和/或C3蛋白的過表達或表達不足的潛在問題，期望在內源C5和/或C3基因基因座處將人C5和/或C3基因插入非人動物(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)的基因組中，及至少部分在內源C5和/或C3調節(jié)元件的控制下在非人動物(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)中表達人C5和/或C3蛋白。

人源化C3和/或C5非人動物的創(chuàng)建

用于產生本發(fā)明的人源化C3和/或C5動物的方法是本領域中公知的(一般參見Gene Targeting:A Practical Approach,Joyner,ed.,Oxford University Press,Inc.(2000))。在一個實施方案中，小鼠的產生可以任選地牽涉破壞鼠C3和/或C5基因及將編碼人或人源化C3和/或C5的基因引入鼠基因組中。在一個實施方案中，編碼人或人源化C3和/或C5的基因的引入在與內源鼠C3和/或C5基因相同的位置處。

可以通過將轉基因引入動物的種系中來產生本發(fā)明的轉基因非人動物?？梢允褂锰幱诟鞣N發(fā)育階段的胚胎靶細胞來引入轉基因。根據(jù)胚胎靶細胞的發(fā)育階段，使用不同的方法。對用于實施本發(fā)明的任何動物的具體品系選擇總體良好健康，良好胚胎產量，胚胎中良好的原核可見度，和良好的繁殖適度。當要產生轉基因小鼠時，常常使用諸如C57BL/6或C57BL/6 x DBA/2F₁，或FVB系的品系(可購自Charles River Labs，Boston，Mass.，The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME，或Taconic Labs.)。

可以通過本領域中已知的任何手段(諸如例如顯微注射，電穿孔，或脂轉染)來完成將轉基因引入胚胎中。例如，可以通過將構建體顯微注射入受精哺乳動物卵的原核中，以使構建體的一個或多個拷貝在發(fā)育中的哺乳動物的細胞中保留來將轉基因引入哺乳動物中。在將轉基因構建體引入受精卵中后，可以將卵在體外溫育不同量的時間，或再植入代孕宿主中，或這兩者。體外溫育至成熟在本發(fā)明的范圍內。一種常見的方法是在體外溫育胚胎約1-7天(取決于物種)，然后將它們再植入代孕宿主中。

使用標準方法完成再植入。通常，麻醉代孕宿主，并將胚胎插入輸卵管中。植入特定宿主中的胚胎的數(shù)目會隨物種而變化，但是通常會與該物種天然產生的后代的數(shù)目相當。

也可以使用逆轉錄病毒感染將轉基因引入非人動物中?？梢栽隗w外培養(yǎng)發(fā)育中的非人胚胎至胚泡期。在此時間期間，卵裂球可以是逆轉錄病毒感染的靶物(Jaenich,R.(1976)PNAS 73:1260-1264)。通過酶處理除去透明帶來獲得卵裂球的有效感染(Manipulating the Mouse Embryo,Hogan編(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,1986)。用于引入轉基因的病毒載體系統(tǒng)通常是攜帶轉基因的復制缺陷型逆轉錄病毒(Jahner et al.(1985)PNAS 82:6927-6931；Van der Putten et al.(1985)PNAS 82:6148-6152)。

用于轉基因引入的第三類靶細胞是胚胎干(ES)細胞?？梢酝ㄟ^DNA轉染或通過逆轉錄病毒介導的轉導將轉基因有效引入ES細胞中。此后，可以將此類經轉化的ES細胞與來自非人動物的胚泡組合。此后，ES細胞定殖于胚胎并有助于所得嵌合動物的種系。

可以將包含人源化C3和/或C5的轉基因動物與其它動物雜交。一種制備方式是產生一系列哺乳動物，每個含有期望的構建體或轉基因之一。經由一系列雜交，回交和選擇將此類哺乳動物一起育種，以最終產生含有所有期望構建體和/或轉基因的單一哺乳動物，其中除了存在期望的構建體和/或轉基因外，該哺乳動物與野生型在其它方面是同基因的(遺傳上相同的)。在一個實施方案中，以此方式產生包含人或人源化C3和/或C5基因的小鼠。

典型地，根據(jù)育種過程中每個特定步驟的目標，通過將同胞或親本品系與后代交配來實現(xiàn)雜交和回交。在某些情況中，可能有必要產生大量的后代，以便產生在適當?shù)娜旧w位置中含有敲除構建體和/或轉基因中每一種的單一后代。另外，可能有必要雜交或回交數(shù)個世代，以最終獲得期望的基因型。人源化C3和/或C5非人動物用于鑒定能夠調控補體系統(tǒng)的化合物的用途

在一些方面，本文中提供了用于鑒定能夠調控補體活化的候選治療性分子(即化合物)的方法。該方法利用本文中公開的任何人源化C3和/或C5嚙齒動物(例如小鼠或大鼠)。在一些實施方案中，在實驗性誘導補體活化(例如在腎缺血/再灌注模型中)后，對嚙齒動物直接施用候選化合物，并就其調控補體系統(tǒng)的能力而言評估所述化合物的效果。在其它實施方案中，使候選化合物與自這些動物獲得的血清接觸，并使用任何常用的體外評估技術(例如但不限于CH₅₀測定法)評估補體活性。

在一些實施方案中，候選化合物可以通過降低，減少或抑制補體活化來調控補體活化。與沒有用候選化合物處理的對照嚙齒動物相比，化合物可以將本文中公開的任何嚙齒動物中的補體活化降低1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％之任一。

在另一個實施方案中，候選化合物可以降低，減少或抑制補體活化長達1小時，2小時，3小時，4小時，5小時，6小時，7小時，8小時，9小時，10小時，11小時，12小時，18小時，24小時，30小時，36小時，42小時，48小時，54小時，60小時，66小時，72小時，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天或3周(包括這些值之間的任何時間段)。

在其它實施方案中，候選化合物可以通過增加，放大或活化補體活性來進一步調控補體活化。與沒有用候選化合物處理的對照嚙齒動物相比，化合物可以將本文中公開的任何嚙齒動物中的補體活化提高1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％，79％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，或100％之任一。

在另一個實施方案中，候選化合物可以增加，放大或活化補體活性長達1小時，2小時，3小時，4小時，5小時，6小時，7小時，8小時，9小時，10小時，11小時，12小時，18小時，24小時，30小時，36小時，42小時，48小時，54小時，60小時，66小時，72小時，4天，5天，6天，7天，8天，9天，10天，11天，12天，13天，14天或3周(包括這些值之間的任何時間段)。

候選化合物可以是但不限于小分子化學化合物，抗體，蛋白質，抑制性核酸或其任何組合。

1.抗體

在一些方面，候選化合物結合(諸如優(yōu)先結合)補體蛋白(例如但不限于C5或C3(例如C3a))，并且是抗體。在一些實施方案中，抗體是C5和/或C3拮抗劑，并且可以減少補體活化。在其它實施方案中，抗體是C5和/或C3激動劑，并且可以增加補體活化。

也可以基于本領域中已知的信息在基本上不影響抗體活性的情況中生成抗體的變體。例如，抗體變體可以具有由不同殘基替換的抗體分子中的至少一個氨基酸殘基。對于抗體，替代誘變最感興趣的位點通常包括高變區(qū)，但也涵蓋框架區(qū)(FR)改變。

對于抗體，一類替代變體牽涉替代親本抗體(例如人源化或人抗體)的一個或多個高變區(qū)殘基。通常，選擇用于進一步開發(fā)的所得變體相對于產生它們的親本抗體具有改善的生物學性質。用于產生此類替代變體的方便的方式牽涉使用噬菌體展示的親和力成熟。簡言之，突變幾個高變區(qū)位點(例如6-7個位點)以在每個位點處產生所有可能的氨基酸替代。以與在每個顆粒內包裝的M13的基因III產物的融合物自絲狀噬菌體顆粒展示如此產生的抗體。然后，對噬菌體展示的變體篩選其生物活性(例如結合親和力)，如本文中公開的。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點，可以實施丙氨酸掃描誘變以鑒定顯著促成抗原結合的高變區(qū)殘基。

可以通過本領域中已知的多種方法制備編碼抗體的氨基酸序列變體的核酸分子。這些方法包括但不限于自天然來源的分離(在天然存在的氨基酸序列變體的情況中)或通過抗體的早期制備變體或非變體型式的寡核苷酸介導的(或定點)誘變，PCR誘變和盒式誘變制備。

可以期望在本發(fā)明的免疫球蛋白多肽的Fc區(qū)中引入一處或多處氨基酸修飾，從而產生Fc區(qū)變體。Fc區(qū)變體可以包含人Fc區(qū)序列(例如，人IgG1，IgG2，IgG3或IgG4Fc區(qū))，其在一個或多個氨基酸位置(包括鉸鏈半胱氨酸的氨基酸位置)處包含氨基酸修飾(例如替代)。

在國際專利申請公開No.：W099/51642(通過援引將其收入本文)中描述了具有改變(即改善或減少)的C1q結合和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)的Fc區(qū)變體。此類變體可以包含在Fc區(qū)的一個或多個氨基酸位置處的氨基酸替代。也見Duncan&Winter,Nature 322:738-40(1988)；美國專利No.5,648,260；美國專利No.5,624,821；和關注Fc區(qū)變體的國際專利申請公開No.：WO94/29351，通過援引將每篇的公開內容收入本文。

2.非抗體結合多肽

在一些方面，候選化合物結合(例如優(yōu)先結合)補體蛋白(諸如C5或C3(例如C3a))，并且是非抗體結合多肽。在一些實施方案中，非抗體結合多肽是C5和/或C3拮抗劑，并且可以減少補體活化。在其它實施方案中，非抗體結合多肽是C5和/或C3激動劑，并且可以增加補體活化。

可以使用已知的多肽合成方法化學合成或者可以使用重組技術制備并純化結合多肽。結合多肽的長度通常為至少約5個氨基酸，或者長度為至少約6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，70，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，或100個氨基酸或更多，其中此類結合多肽能夠結合靶物，諸如本文中討論的任何補體蛋白(例如C5或C3)。

可以使用公知的技術在無需過度實驗的情況中鑒定結合多肽。在此方面，注意到用于對多肽文庫篩選能夠結合多肽靶物的結合多肽的技術是本領域中公知的(見例如美國專利No.5,556,762，5,750,373，4,708,871，4,833,092，5,223,409，5,403,484，5,571,689，5,663,143；PCT申請公開文本No.WO 84/03506和WO84/03564；Geysen et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，81:3998-4002(1984)；Geysen et al，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，82:178-182(1985)；Geysen et al.，J.Immunol.Meth,，102:259-274(1987)；Clackson，T.et al.，(1991)Nature，352:624；Kang，A.S.et al.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88:8363，及Smith，G.P.(1991)Current Opin.Biotechnol，2:668，通過援引將每篇的公開內容收入本文。

也在美國專利No.5,723,286，5,432,018，5,580,717，5,427,908，5,498,530，5,770,434，5,734,018，5,698,426，5,763,192，和5,723,323中公開了用于產生肽文庫和篩選這些文庫的方法，通過援引將每篇的公開內容收入本文。

可以修飾結合多肽以增強它們的抑制和/或治療效果(包括例如增強的親和力，改善的藥動學性質，諸如半衰期，穩(wěn)定性和清除率，降低的毒性等)。此類修飾包括但不限于糖基化，PEG化，用非天然存在但功能等同的氨基酸替代，連接基團等。

3.小分子

在一些方面，候選化合物結合(例如優(yōu)先結合)補體蛋白(例如C5或C3(例如C3a))，并且是小分子。在一些實施方案中，小分子是C5和/或C3拮抗劑并且可以減少補體活化。在其它實施方案中，小分子是C5和/或C3激動劑，并且可以增加補體活化。

優(yōu)選地，小分子是與如本文中定義的結合多肽或抗體不同的有機分子?？梢允褂靡阎姆椒ㄨb定并且化學合成有機小分子(參見例如PCT申請公開No.WO 00/00823和WO 00/39585)。有機小分子的大小通常是小于約2000道爾頓，或者大小是小于約1500，750，500，250或200道爾頓，其中可以使用公知的技術在無需過度實驗的情況中鑒定能夠結合如本文中描述的多肽的此類有機小分子。在此方面，注意到用于對有機小分子文庫篩選能夠結合多肽靶物的分子的技術是本領域中公知的(參見例如PCT申請公開文本No.WO 00/00823和WO 00/39585)。

有機小分子可以是例如醛，酮，肟，腙，縮氨基脲，碳二酰肼，伯胺，仲胺，叔胺，N-取代的肼，酰肼，醇，醚，硫醇，硫醚，二硫化物，羧酸，酯，酰胺，脲，氨基甲酸酯，碳酸酯，縮酮，硫縮酮(thioketals)，縮醛，硫縮醛，芳基鹵化物，磺酸芳基酯，烴基鹵化物，磺酸烴基酯，芳香族化合物，雜環(huán)化合物，苯胺，烯，炔，二醇，氨基乙醇，口惡唑烷，口惡唑啉，噻唑烷，噻唑啉，烯胺，氨苯磺胺，環(huán)氧化物，氮丙啶，異氰酸酯，磺酰氯，重氮化合物，酰氯等。

在一些方面，小分子化學化合物是組合化學文庫的組分。組合化學文庫是由較小的亞單位或單體構成的多種化學化合物的集合。組合文庫達到多種大小，范圍為幾百到幾十萬種不同種類的化學化合物。還有多種文庫類型，包括由化合物，諸如碳水化合物，寡核苷酸和小有機分子等構成的寡聚和聚合文庫。此類文庫具有多種用途，諸如化學化合物的固定化和層析分離，以及用于鑒定和表征能夠結合靶分子(例如，C5和/或C3)或介導感興趣的生物學活性(例如但不限于補體活性的抑制或活化)的配體的用途。

用于在固相支持物上合成化合物文庫的各種技術是本領域中已知的。固相支持物通常是具有經官能化以與亞單元或單體結合以形成文庫化合物的表面的聚合物體。一個文庫的合成通常牽涉大量的固相支持物。為了生成組合文庫，在仔細控制的預定的化學反應順序中將固相支持物與化合物的一個或多個亞單位和與一個或多個數(shù)目的試劑起反應。換言之，在固相支持物上“生長”文庫亞單位。文庫越大，需要的反應的數(shù)目越大，從而使追蹤構成文庫的多種化合物的化學組成的任務復雜化。在一些實施方案中，小分子的大小小于約2000道爾頓，或者大小是小于約1500，750，500，250或200道爾頓。

可以自可以在固體支持物上實施的任何類型的化學反應衍生本文中任何方面中描述的小分子藥劑。此類化學反應包括但不限于2+2環(huán)加成，包括丁二烯的捕獲；[2+3]環(huán)加成，包括異口惡唑啉，呋喃和修飾肽的合成；縮醛形成，包括二醇，醛和酮的固定化；羥醛縮合，包括醛的衍生化，丙二醇的合成；苯偶姻縮合，包括醛的衍生化；環(huán)縮合，包括苯并二氮雜和乙內酰脲，噻唑烷，轉角模擬物(turn mimetics)，卟啉，酞菁；Dieckmann環(huán)化，包括二酯的環(huán)化；第爾斯-阿爾德反應，包括丙烯酸的衍生化；親電加成，包括將醇與烯烴的加成；格里尼亞(Grignard)反應，包括醛的衍生化；Heck反應，包括二取代烯的合成；亨利(Henry)反應，包括原位合成氧化腈(見2+3環(huán)加成)；催化氫化，包括信息素和肽的合成(烯的氫化)；邁克爾(Michael)反應，包括硫烷基酮，雙環(huán)[2.2.2]辛烷的合成；Mitsunobu反應，包括芳基醚，肽基膦酸酯和硫醚的合成；親核芳香族取代，包括喹諾酮的合成；氧化，包括醛和酮的合成；Pausen-Khand環(huán)加成，包括降冰片二烯與戊炔醇的環(huán)化；光化學環(huán)化，包括螺旋烴的合成；與有機-金屬化合物的反應，包括醛和酰氯的衍生化；用復雜氫化物和錫化合物還原，包括還原羰基，羧酸，酯和硝基基團；Soai反應，包括羧基基團的還原；Stille反應，包括聯(lián)苯基衍生物的合成；Stork反應，包括取代的環(huán)己酮的合成；還原性胺化，包括喹諾酮的合成；Suzuki反應，包括苯乙酸衍生物的合成；和Wittig-Horner反應，包括醛，信息素和硫烷基酮的反應。

公開化學文庫的合成以及將那些文庫的個別化合物解卷積至個別固相支持物上的參考文獻可以參見美國專利申請No.2009/0032592；Needels et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10700-10704；及PCT申請公開文本No.WO 97/15390，通過援引將其公開內容收入本文。

4.抑制性核酸

在本發(fā)明的一個方面，候選補體調控性化合物是靶向補體系統(tǒng)的組分(例如mRNA)的一種或多種寡核苷酸。抑制性核酸可以是但不限于，反義寡核苷酸，小抑制性RNA(siRNA)或核酶中的任一種。

本發(fā)明的寡核苷酸可以是編碼補體系統(tǒng)的蛋白質組分的mRNA。寡核苷酸會通過介導其破壞或通過阻止翻譯成蛋白質而結合mRNA并干擾其功能。雖然優(yōu)選，但不需要絕對互補性。如本文中援引，與RNA的一部分“互補”的寡核苷酸序列是指具有足夠的互補性以能夠與RNA雜交，形成穩(wěn)定雙鏈體的序列。雜交的能力會取決于互補性的程度和寡核苷酸的長度兩者。通常，雜交核酸越長，其可以含有并且仍形成穩(wěn)定雙鏈體的與RNA的堿基錯配越多。本領域技術人員可以通過使用標準規(guī)程測定雜交復合物的熔點來確定可容許的錯配程度。

一般地，制造成與補體系統(tǒng)的蛋白質的mRNA雜交的互補寡核苷酸靶向mRNA的任何區(qū)域，包括靶向mRNA的5’非翻譯區(qū)，靶向AUG起始密碼子的互補序列，或者靶向3’非翻譯區(qū)。

寡核苷酸可以具有備選的核苷間連接，例如但不限于硫代磷酸酯(Mag at al.,Nucleic Acids Res.19:1437-1441,1991；和美國專利No.5,644,048)，肽核酸或PNA(Egholm,Nature,3685:566-568,1993；和美國專利No.6,656,687)，磷酰胺(Beaucage,Methods Mol.Biol.20:33-61,1993)，二硫代磷酸酯(Capaldi et al.,Nucleic Acids Res.,28:E40,2000)。其它寡核苷酸類似物包括諸如但不限于嗎啉代(Summerton,Biochim.Biophys.Acta,1489:141-158,1999)，鎖定寡核苷酸(Wahlestedt wt al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97:5633-5638,2000)，肽核苷酸或PNA(Nielsen et al.,1993；Hyrup and Nielsen,1996)或2-o-(2-甲氧基)乙基修飾的5’和3’端寡核苷酸(McKay et al.,J.Biol.Chem.,274:1715-1722,1999)。在此通過援引明確收錄所有這些參考文獻。核酸可以含有脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任何組合，和堿基的任何組合，所述堿基包括尿嘧啶，腺嘌呤，胸腺嘧啶，胞嘧啶，鳥嘌呤，肌苷，黃嘌呤，次黃嘌呤，異胞嘧啶，異鳥嘌呤等。

依照本發(fā)明的互補寡核苷酸可以包含至少一個經修飾的堿基模塊，其選自下組，所述組包括但不限于5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黃嘌呤，黃嘌呤，4-乙?；奏ぃ?-(羧基羥甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷，5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，β-D-半乳糖基辮苷(beta-D-galactosylqueosine)，肌苷，N6-異戊烯基腺嘌呤，1-甲基鳥嘌呤，1-甲基肌苷，2,2-二甲基鳥嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鳥嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶，β-D-甘露糖基辮苷(beta-D-mannosylqueosine)，5’-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N6-異戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧乙酸(uracil-5-oxyacetic acid)(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，辮苷(queosine)，2-硫代胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧乙酸(v)，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N2-羧基丙基)尿嘧啶，(acp3)_w和2,6-二氨基嘌呤。

互補寡核苷酸還可以包含至少一個經修飾的糖模塊，其選自包括但不限于阿拉伯糖，2-氟阿拉伯糖，木酮糖和己糖的組。

互補寡核苷酸的長度應當是至少10個核苷酸，并且長度范圍可以是10至約50個核苷酸，諸如長度為11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，或50個核苷酸。

評估候選化合物的功效

可以依照本領域普通技術人員公知的體外補體測定法確定在給定的非人動物(諸如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)中本發(fā)明的候選補體調控化合物，適宜的劑量，和方法的治療性功效。補體途徑在正?；罨^程期間產生眾多特異性產物，并且已經開發(fā)了靈敏且特異性的測定法，并且對于這些活化產物中的大多數(shù)是商品化的，包括小活化片段C3a，C4a，和C5a以及大活化片段Bb和sC5b-9。這些測定法中的大多數(shù)利用如下的單克隆抗體，所述單克隆抗體與在補體片段上，但不在形成它們的天然蛋白質上暴露的新抗原起反應，使得這些測定法變得非常簡單且特異性的。ELISA技術是特別常見的，盡管放射免疫測定法(RIA)也用于檢測C3a和C5a。后一類測定法測量未加工的片段及其經加工的片段(即，在循環(huán)中找到的主要形式)兩者。C3a的測量提供補體活化的一種靈敏的途徑非依賴性的指示物。膜攻擊途徑活化的流體相產物sC5b-9的檢測提供補體受活完成的證據(jù)。此外，經典途徑還產生C4a，其測量提供關于C3b抑制劑的活性及此類抑制劑是否活化經典途徑的信息。

另外，熟練技術人員也可用數(shù)種補體活化的體內模型來評估候選化合物調控補體系統(tǒng)的能力。例如，補體系統(tǒng)牽涉在缺血事件和隨后的血流恢復后遭受的缺血-再灌注損傷。能引起缺血-再灌注損傷的損傷的例子包括但不限于心肌梗死，腦缺血事件，腸缺血，及血管手術，心臟手術，創(chuàng)傷，和移植的許多方面。補體系統(tǒng)的活化在缺血-再灌注損傷的炎性事件中起作用。缺血損傷導致細胞膜的改變，影響外表面的脂質，碳水化合物，或蛋白質，使得這些暴露的表位改變且能起新抗原(經修飾的自身抗原)的作用。經典補體途徑牽涉缺血-再灌注損傷由在C3或C4方面遺傳缺陷的小鼠證實，所述小鼠在后肢的局部損傷和動物損傷模型中展現(xiàn)出相等的保護(Austen et al.(2003)Int J Immunopath Pharm 16:1)。另外，還已經顯示補體活化牽涉缺血損傷的一種腎模型(Guo et al.(2005)Ann Rev Immunol 23:821)。

通過參考以下實施例可以進一步理解本發(fā)明，所述實施例作為例示提供且不意圖為限制性的。

實施例

實施例1：用人C5基因替換內源小鼠C5基因

含有人C5基因的編碼外顯子2到42的97kb人C5基因替換跨越編碼外顯子2到41且包括3’非翻譯區(qū)的一部分的75.8kb鼠C5基因基因座。見圖1。

使用遺傳工程技術(參見Valenzuela et al.(2003)High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis,Nature Biotech,21(6):652-659)構建用于以單個打靶步驟用人C5基因替換小鼠的打靶構建體。分別從細菌人工染色體(BAC)克隆bMQ-2277L16和CTD-2559I19獲得小鼠和人C5DNA。簡言之，將通過缺口修復克隆產生的線性化打靶構建體電穿孔到F1H4小鼠胚胎干(ES)細胞(C57BL/6 x 129 F1雜合物)中，所述線性化打靶構建體含有在97kb人C5序列(從剛好在編碼外顯子2上游的內含子1延伸到編碼外顯子41和3’非翻譯區(qū))(基因組坐標：GRCh38：chr9：120,952,335-121,050,276(-鏈))和側翼為lox的(floxed)新霉素選擇盒側翼的小鼠C5上游和下游同源臂。用瞬時Cre表達載體進一步對正確打靶的ES細胞(MAID 7140)進行電穿孔以除去藥物選擇盒。通過方法(參見美國專利No.7,294,754，7,576,259，7,659,442，以及Poueymirou et al.(2007)F0generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses,Nature Biotech.25(1):91-99)將沒有藥物盒的靶定ES細胞克隆(MAID 7141)導入8細胞階段SW小鼠胚胎中。通過使用等位基因測定法的修改(參見Valenzuela et al.(2003))在小鼠等位基因的喪失和人等位基因的獲得方面測定基因型來鑒定攜帶人源化C5基因的(完全自供體ES細胞衍生的F0小鼠)。

通過天然等位基因喪失(LONA)測定法(Valenzuela et al.2003)來鑒定正確打靶的ES細胞克隆，其中通過對小鼠C5基因中的刪除靶定序列特異性的兩項TaqMan^TM定量聚合酶鏈式反應(qPCR)測定天然的未修飾的C5基因的拷貝數(shù)。qPCR測定法包括下述引物-探針集合(5’至3’書寫)：上游正向引物，CCTCCGGTTA ACTGGTTTGT GAT(SEQ ID NO：1)；上游反向引物，GCAGTGAATG GTAGACTTCC CA(SEQ ID NO：2)；上游探針FAM-AGTGACTTTA CTTTGGTTGT TCTGCTCACA-BHQ(SEQ ID NO：3)；下游正向引物，CCGGGAAAGG AAACCAAGAC(SEQ ID NO：4)；下游反向引物，CAGCACAGAC TGAGGATCCA A(SEQ ID NO：5)；下游探針，F(xiàn)AM-AGACTGTCAT TCTGGCCCGG ACCT-BHQ(SEQ ID NO：6)；其中FAM指5-羧基熒光素熒光探針，并且BHQ指黑洞猝滅劑類型的熒光猝滅劑(Biosearch Technologies)。依照制造商的建議，在384孔PCR板(MicroAmp^TM光學384孔反應板,Life Technologies)中混合自已經攝取打靶載體且并入其基因組中的ES細胞克隆純化的DNA與TaqMan^TM基因表達主混合物(Life Technologies)，并且在Applied Biosystems Prism 7900HT中循環(huán)，其在PCR過程期間收集熒光數(shù)據(jù)并確定閾值循環(huán)(Ct)，即累積熒光達到預設置的閾值時的分數(shù)(fractional)PCR循環(huán)。對于每份DNA樣品，運行上游和下游C5特異性qPCR和用于非靶向參考基因的兩項qPCR。計算每項C5特異性qPCR和每項參照基因qPCR之間的Ct值差(ΔCt)，然后為所有測定樣品計算每個ΔCt和中值ΔCt之間的差，從而為每份樣品獲得ΔΔCt值。自下述公式計算每份樣品中C5基因的拷貝數(shù)：拷貝數(shù)＝2×2^-ΔΔCt。正確打靶的克隆(其已經喪失其天然拷貝之一)會具有等于1的C5基因拷貝數(shù)。通過包含下述引物-探針集合(以5’至3’書寫)的TaqMan^TMqPCR測定法來確認人源化等位基因中人C5基因序列替換刪除的小鼠C5基因序列的確認：人上游正向引物，TGCTCTTAAA GGACCATCAT CAC(SEQ ID NO：7)；人上游反向引物，GTAAACGGAT AACGGAAAGG ATAGA(SEQ ID NO：8)；人上游探針，F(xiàn)AM-CCATTTCCAA ATGCACTTCC CAGC-BHQ(SEQ ID NO：9)；人下游正向引物，CCCACTGAAC TATCACAGGA AACA(SEQ ID NO：10)；人下游反向引物，GGAGATGCAT TCCAGTCTCT GTTA(SEQ ID NO：11)；人下游探針，F(xiàn)AM-TGAAGATGAC CTCCGGATGT AACGG-BHQ(SEQ ID NO：12)。

對于自靶定ES細胞衍生的小鼠，使用相同的LONA測定法測定自尾部活檢純化的DNA以測定它們的C5基因型并確認人源化C5等位基因已經經由種系傳遞。繁殖替換呈雜合的兩只幼畜以產生人C5基因對內源小鼠C5基因的替換呈純合的小鼠。使用替換呈純合的幼畜進行表型測定。

鼠基因座和含有人C5基因的序列的上游接合設計為在

內，其中在人C5基因的第一個核苷酸前的最后一個小鼠C5核苷酸是CTTGT中的最后一個T，并且人C5序列的第一個核苷酸是TCTGC中的第一個T，所述TCTGC跨越AsiSI位點(在圓括號內)，其中精確的接合以正斜杠標示。含有人C5基因的序列和側翼為lox的新霉素選擇盒的下游接合設計為在

內，其中人C5序列的最后一個核苷酸是AGCCT中的T，并且側翼為lox的新霉素選擇盒的第一個核苷酸是CTCGA中的第一個C，精確的接合以正斜杠標示。鼠C5基因座的序列的下游接合設計為在

內，其中側翼為lox的新霉素選擇盒的最后一個核苷酸是CTAGC中的第二個C，并且鼠C5基因座的第一個核苷酸是CAGGC中的第一個C，精確的接合以正斜杠標示。含有人C5基因的序列和鼠基因座的下游接合設計為在

內，其中人C5序列的最后一個核苷酸是AGCCT中的“T”，并且小鼠C5序列的第一個核苷酸是CAGGC中的第一個“C”；所述CAGGC跨越在除去側翼為lox的新霉素選擇盒后保留的loxP位點(在圓括號內)，其中精確的接合以正斜杠標示。

實施例2：用人C3基因替換內源小鼠C3基因

型式1：用人C3啟動子和編碼外顯子1到41進行的替換

含有人C3基因的5’調節(jié)元件和所有編碼外顯子1到41的人C3基因替換跨越5’調節(jié)元件和所有編碼外顯子2到41的鼠C5基因基因座?；旧鲜褂蒙衔膶嵤├?中描述的方法用人C3基因序列替換小鼠C3基因序列。見圖2A。

初步地，通過用側翼為lox的新霉素盒替換編碼外顯子2到41和包括聚腺苷酸化位點3’的900bp，在小鼠ES細胞中產生25kb小鼠C3基因的靶向刪除。所得小鼠ES細胞12132 ES細胞是雜合C3敲除。依照本領域中已知的規(guī)程，使用12132細胞產生C3敲除小鼠。

產生打靶構建體，并電穿孔入12132 ES細胞中，所述打靶構建體含有在人C3序列(從編碼外顯子1上游的5’調節(jié)元件延伸到編碼外顯子41和3’非翻譯區(qū))和側翼為lox的潮霉素選擇盒側翼的小鼠C3上游和下游同源臂。用瞬時Cre表達載體進一步電穿孔正確打靶的ES細胞(MAID 6148)以除去藥物選擇盒。將沒有藥物盒的靶定ES細胞克隆(MAID 6149)引入8細胞階段小鼠胚胎。如實施例1中描述的，通過在小鼠等位基因的喪失和人等位基因的獲得方面測定基因型鑒定完全自攜帶人源化C3基因的供體ES細胞衍生的F0小鼠。

通過包含下述引物-探針集合(以5’至3’書寫)的TaqMan^TMqPCR測定法來確認C3敲除12132 ES細胞中側翼為lox的新霉素盒替換刪除的小鼠C3基因序列的確認：12132TU，小鼠C3內含子1：正向引物，GGCCTGATTA CATGGACCTG TC(SEQ ID NO:17)；反向引物，CCCAGGCTTG GCTGGAATG(SEQ ID NO:18)；探針，F(xiàn)AM-TGTCCACTCT GGAAGCCCAG GC-BHQ(SEQ ID NO:19)；12132TD，小鼠C3外顯子41的3’：正向引物，GCCAGGAGAG GAAGCTGGAG(SEQ ID NO:20)；反向引物，TGGCTCAGCA GTAAAGAACA C(SEQ ID NO:21)；探針，F(xiàn)AM-ACAGATTGCT GTGAGCTGCC CAAA-BHQ(SEQ ID NO:22)；新霉素盒：正向引物，GGTGGAGAGG CTATTCGGC(SEQ ID NO:23)；反向引物，GAACACGGCG GCATCAG(SEQ ID NO:24)；探針，F(xiàn)AM-TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG-BHQ(SEQ ID NO:25)。

通過包含下述引物-探針集合(以5’至3’書寫)的TaqMan^TM qPCR測定法來確認人源化等位基因中人C3基因序列替換刪除的小鼠C3基因序列的確認：mC3-1，小鼠C3啟動子：正向引物，GCCAGCCTAG CCTACTTCA(SEQ ID NO:26)；反向引物，GCCACCCATC CCAGTTCT(SEQ ID NO:27)；探針，F(xiàn)AM-CAGCCCAGGC CCTTTAGATT GCA-BHQ(SEQ ID NO:28)；mC3-2，小鼠C3 3’非翻譯區(qū)，正向引物，TACGGTGTTA GGTTCACTAT TGGT(SEQ ID NO:29)；反向引物，GTCGCCAGCA GTCTCATACA G(SEQ ID NO:30)；探針，CAL Orange-AGTGGGCATC CCTTGCCAGG C-BHQ(SEQ ID NO:31)；潮霉素盒：正向引物，TGCGGCCGAT CTTAGCC(SEQ ID NO:32)；反向引物，TTGACCGATT CCTTGCGG(SEQ ID NO:33)；探針，F(xiàn)AM-ACGAGCGGGT TCGGCCCATT C-BHQ(SEQ ID NO:34)；hC3-1，人C3啟動子：正向引物，GGGCCTCCTA AGTTTGTTGA GTATC(SEQ ID NO:35)；反向引物，CAGGGCTGGT TCCCTAGAAA TC(SEQ ID NO:36)；探針，F(xiàn)AM-TACAATAGCA GGCACAGCAC CCA-BHQ(SEQ ID NO:37)；hC3-2，人C3內含子1：正向引物，GGCTGAGAGT GGGAGTCATG(SEQ ID NO:38)；反向引物，GCACTTGCCA ATGCCATTAT C(SEQ ID NO:39)；探針，F(xiàn)AM-CTGCTGTCCT GCCCATGTGG TTG-BHQ(SEQ ID NO:40)；hC3-3，人C3外顯子41：正向引物，CGAATGCCAA GACGAAGAGA AC(SEQ ID NO:41)；反向引物，GGGCACCCAA AGACAACCAT(SEQ ID NO:42)；探針，CAL Orange-CAGAAACAAT GCCAGGACCT CGGC-BHQ(SEQ ID NO:43)。

對于自靶定ES細胞衍生的小鼠，使用相同的LONA測定法測定自尾部活檢純化的DNA以測定它們的C3基因型并確認人源化C3等位基因已經經由種系傳遞。繁殖替換呈雜合的兩只幼畜以產生人C3基因對內源小鼠C3基因的替換呈純合的小鼠。使用替換呈純合的幼畜進行表型測定。

如上文實施例1中描述的，測定鼠C3基因座和含有人C3基因的序列的接合，含有人C3基因的序列和側翼為lox的潮霉素選擇盒的接合，及側翼為lox的潮霉素選擇盒的序列和鼠C3基因座的接合的序列。

型式2：用人C3編碼外顯子2到41進行的替換

含有人C3基因的編碼外顯子2到41的人C3基因替換跨越編碼外顯子2到41的鼠C5基因基因座?；旧鲜褂蒙衔膶嵤├?中描述的方法用人C3基因序列替換小鼠C3基因序列。見圖2B。

初步地，通過用側翼為lox的新霉素盒替換編碼外顯子2到41且包括聚腺苷酸化位點3’的900bp，在小鼠ES細胞中產生25kb小鼠C3基因的靶向刪除。所得小鼠ES細胞12132ES細胞是雜合C3敲除。

產生打靶構建體，并電穿孔入12132ES細胞中，所述打靶構建體含有在人C3序列(從編碼外顯子2上游延伸到編碼外顯子41和3’非翻譯區(qū))和側翼為lox的潮霉素選擇盒側翼的小鼠C3上游和下游同源臂。用瞬時Cre表達載體進一步電穿孔正確打靶的ES細胞(MAID 6155)以除去藥物選擇盒。將沒有藥物盒的靶定ES細胞克隆(MAID 6156)引入8細胞階段小鼠胚胎中。如實施例1中描述的，通過在小鼠等位基因的喪失和人等位基因的獲得方面測定基因型鑒定完全自攜帶人源化C3基因的供體ES細胞衍生的F0小鼠。

通過包含與上文型式1中描述的相同的引物-探針集合(以5’至3’書寫)的TaqMan^TMqPCR測定法確認C3敲除12132ES細胞中側翼為lox的新霉素盒替換刪除的小鼠C3基因序列，及人源化等位基因中人C3基因序列替換刪除的小鼠C3基因序列的確認。

對于自靶定ES細胞衍生的小鼠，使用相同的LONA測定法測定自尾部活檢純化的DNA以測定它們的C3基因型并確認人源化C3等位基因已經經由種系傳遞。繁殖替換呈雜合的兩只幼畜以產生人C3基因對內源小鼠C3基因的替換呈純合的小鼠。使用替換呈純合的幼畜進行表型測定。

如上文實施例1中描述的，測定鼠C3基因座和含有人C3基因的序列的接合，含有人C3基因的序列和側翼為lox的潮霉素選擇盒的接合，及側翼為lox的潮霉素選擇盒的序列和鼠C3基因座的接合的序列。

實施例3：小鼠血清中的補體溶血活性測定法

已經將補體與眼炎癥和視網膜變性疾病聯(lián)系起來(參見Mullins et al.(2000)Drusen associated with aging and age-related macular degeneration contain proteins common to extracellular deposits associated with atherosclerosis,elastosis,amyloidosis,and dense deposit disease,FASEB J,14(7):835-846)。通過單克隆抗體(單抗)阻斷C5切割是用于這些病癥的一種可能的治療性策略(參見Copland et al.(2009)Systemic and local anti-C5 therapy reduces the disease severity in experimental autoimmune uveoretinitis,Clinical and Experimental Immunology,159:303-314)。為了評估針對補體的療法，諸如C5和/或C3拮抗劑，測定法是在與補體活化有關的人疾病，病癥和狀況的適宜模型中在體外和在體內評估候選治療劑的功能所必需的。

方法

使用經典補體測定法CH₅₀(Gilcas et al.(2001)Classical pathway evaluation,Current Protocols in Immunology,Unit 13.1)評估補體溶血活性。自心臟收集小鼠血液，并在冰上在eppendorf管中凝結1小時；通過離心分離血清，并于-70℃貯存。通過于37℃與家兔抗綿羊溶血素一起溫育20分鐘致敏綿羊紅細胞(E)。將致敏的細胞(E_A)與來自小鼠或人的經過處理的血清或對照血清的倍增稀釋物一起于37℃溫育1小時。使完整的E_A細胞形成團粒，并取出上清液以測量541nm處的吸光度，它是溶血的一項指數(shù)。與僅緩沖液(0％裂解)或ddH₂O(100％裂解)一起溫育的E_A細胞分別充當陰性和陽性對照。相對于ddH₂O對照計算每孔中的溶血百分比和CH₅₀(Holt et al.(2001)Targeted deletion of the CD59 gene causes spontaneous intravascular hemolysis and hemoglobinuria,Blood,98(2):442-449)。如實施例1和2中描述的，用技術產生小鼠，包括C5^hu/hu，C5^-/-，C3^hu/hu，C3^-/-，和相應的對照品系。自Quidel Corp.獲得正常的，C5消減的，和C3消減的人血清，并用作對照或用于比較。添加補體組分以測試是否能恢復溶血功能。將測試的血清與補體組分；人C5(Sigma-Aldrich或Quidel Corp.,50μg/ml)，人C3(Sigma-Aldrich或Quidel Corp.,10,400,1200μg/ml)和鼠C5(Regeneron Pharmaceuticals,50μg/ml)一起于4℃溫育40分鐘。使用抗人C5單抗(100μg/ml)和抗小鼠C5單抗(Hycult Biotech，10μg/ml)來確認此系統(tǒng)用于未來藥物發(fā)現(xiàn)的特異性和效用。

結果

野生型小鼠血清具有與正常人血清相比低大約10倍的補體溶血活性。如圖3中顯示的，如使用CH₅₀值測定的，三批正?；蛞吧托∈笱逯械难a體溶血活性與兩批人血清相比低至少10倍。

抗C5單克隆抗體以物種特異性方式阻斷溶血。如圖4中顯示的，抗小鼠C5單克隆抗體(msC5Ab)阻斷正常小鼠血清中的補體溶血活性，并且抗人C5單抗(C5Ab)阻斷正常人血清和補充有人C5蛋白的人C5消減血清中，而非正常小鼠血清中的溶血活性。

人C5和C3蛋白展現(xiàn)物種特異性溶血活性。如圖5A中顯示的，人C5和C3蛋白分別能夠重建人C5和C3消減的人血清的補體溶血活性。

如圖5B中顯示的，來自C5^-/-和C3^-/-小鼠的血清顯示缺乏補體活性，并且人源化C5^hu/hu小鼠血清展現(xiàn)出無溶血活性，基本上等同于來自C5^-/-和C3^-/-小鼠的血清。對人源化C5^hu/hu小鼠血清添加小鼠C5蛋白挽救補體溶血活性，但是對人源化C5^hu/hu小鼠血清添加人C5蛋白不挽救補體活性。

如圖5C中顯示的，人源化C5^hu/hu小鼠血清的補體溶血活性的缺乏看來不是由于缺乏人C5蛋白，因為這些小鼠的血清中存在的人C5蛋白的量是正常人血清中存在的C5蛋白的量的約三分之一。圖5D顯示相對于給藥前補體C5水平，雄性和雌性人源化C5小鼠之間的變化。這些小鼠的血清中存在的人C5蛋白的范圍為20至100μg/ml，其足以顯示血清中的溶血活性。在這些實驗中正常情況下添加的人C5是50μg/ml。

需要人C5和C3蛋白二者來重建小鼠C5敲除血清中的溶血活性。如圖6中顯示的，通過將人C5蛋白添加至C5^-/-小鼠血清不能恢復補體溶血活性，而一起添加人C3和C5蛋白挽救C5^-/-小鼠血清中的溶血。

人C3蛋白的添加挽救C5^hu/hu小鼠血清中的溶血活性。如圖7中顯示的，人C3蛋白足以重建來自C5^hu/hu小鼠的血清中的補體溶血活性。

基于上述結果，人源化C5^hu/hu和/或C3^hu/hu小鼠是用來評估人特異性C5和/或C3拮抗劑的PK和PD的適宜非人動物。基于上述結果，雙重人源化C5^hu/hu和C3^hu/hu小鼠血清可以在不需要補充人C5和/或C3蛋白的情況下展現(xiàn)出補體溶血活性，由此構成用于在體內測試人特異性C5和/或C3拮抗劑的治療功效的適宜小鼠品系。

結論

野生型小鼠血清具有與人血清相比顯著更低的補體溶血活性。表達人C5的經遺傳修飾的小鼠是功能性鼠C5敲除，可能是因為小鼠轉化酶不能切割人C5蛋白。人源化C5小鼠血清需要添加人C3蛋白來實現(xiàn)野生型水平的補體溶血活性。

實施例4：人源化C5和/或C3小鼠的用途

人源化C5和/或C3小鼠對于評估人特異性C5和/或C3化合物(諸如拮抗劑，例如中和性抗C5或抗C3抗體)的藥動學(PD)是有用的。

依照本領域中已知的標準規(guī)程，例如如美國專利No.6,355,245關于抗C5抗體描述的，實施人源化C5和/或C3小鼠中的藥動學(PK)和PD測定法。

人源化C5和/或C3小鼠對于在多種疾病模型中測試人特異性C5或C3拮抗劑(例如中和性抗C5或抗C3抗體)的體內治療功效是有用的，例如但不限于：干性年齡相關黃斑變性(AMD)；濕性AMD；實驗性自身免疫性葡萄膜視網膜炎(EAU)；眼高血壓；和視神經損傷(對于與補體活化有關的疾病，病癥和狀況的列表，參見例如Makrides(1998)和Mollnes et al.(2006))。

通過高脂肪飲食和藍光損傷(參見例如Exp Eye Res.2002,75(5):543-553)，吸煙(參見例如Invest Ophthalmol Vis Sci.2006,47(2):729-737)，羧乙基吡咯(CEP)(參見例如Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.2010,51:1276-1281；Nat Med.2012,18(5):791-798)能在人源化C5和/或C3小鼠中誘導干性AMD。

還能繁殖人源化C5和/或C3小鼠成其它轉基因AMD模型，諸如例如ApoE(-/-)(參見例如Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.2000,41:2035-2042)，Mdm1(參見例如Hum.Mol.Genet.2008,17:3929-3941)，Sod1(-/-)(參見例如PNAS2006；103:11282-11287)，LDLR(-/-)(參見例如Br J Ophthalmol 2005,89:1627-1630)，和DICER1(-/-)(參見例如Nature.2011；471(7338):325-330)。

通過激光誘導的脈絡膜新血管形成(CNV)能在人源化C5和/或C3小鼠中誘導濕性AMD(參見Nat Protoc.2013,8(11):2197-2211)。

能在人源化C5和/或C3小鼠中誘導EAU(參見例如Clin Exp Immunol.2010,159(3):303-314)。

能在人源化C5和/或C3小鼠中誘導眼高血壓(參見例如Experimental Eye Research 2006,83:620-628)。

能在人源化C5和/或C3小鼠中誘導視神經損傷(參見例如J Neurotrauma 2003,20(9):895-904)。

能使用人源化C5小鼠在多種疾病模型中評估人特異性C5拮抗劑，例如但不限于：陣發(fā)性夜間血尿；視神經脊髓炎(neuromyletic optica)；腎移植；和腎損傷(參見例如美國專利No.6,355,245)。

依照本領域中已知的標準規(guī)程，例如美國專利No.6,355,245關于抗C5抗體描述的，使用人源化C5和/或C3小鼠實施治療功效測定法。

實施例5：人源化C5純合小鼠中抗C5抗體的藥動學/藥效學研究

此實施例利用依照先前實施例制備的雄性和雌性人源化C5純合小鼠來測試抗C5抗體降低補體活化的能力。

方法

在研究中使用總共25只C5^hu/hu小鼠(雄性和雌性)。在每個指定的時間點時從兩只小鼠收集血清(20μL)，其包括“給藥前”時間點以及在皮下施用15mg/kg抗人C5單克隆抗體后的3h，6h，1d，2d，4d，1W，2W，4W的時間點。于-20℃貯存樣品，直至測定補體活化的藥動學(PK)和藥效學(PD)改變。

如上文實施例3中描述的，評估補體溶血活性。如上所述，將人C3(Sigma-Aldrich或Quidel Corp.，400和800μg/ml)添加至血清以重演人補體系統(tǒng)。

結果

如圖8中顯示的，皮下注射15mg/kg抗人C5抗體在注射后降低補體活化至少一周。無論對溶血測定法添加400μg/ml(圖8A)還是800μg/ml(圖8B)人C3蛋白都觀察到此效果。

如圖9中顯示的，C5單克隆抗體的PK分析揭示了此抗體隨時間的清除，到第28天，5只小鼠中的2只具有檢測不到的水平。

實施例6：人和小鼠補體蛋白的交叉活性

此實施例使用前述實施例中描述的工程化小鼠調查人和小鼠C3和C5蛋白的交叉活性。如實施例3中討論的和如圖6中顯示的，人C5和小鼠C3蛋白不足以在缺乏內源C5的小鼠中重建溶血活性。在此研究中，觀察到小鼠C5和人C3恢復C3敲除小鼠中的溶血活性的能力。

方法

如實施例3中描述的，評估補體溶血活性。

如實施例1和2中描述的，用技術產生小鼠，包括C5^-/-，C3^-/-，和相應的對照品系。自Quidel Corp.獲得正常的，C3消減的人血清，并用作對照或用于比較。添加補體組分以測試是否能恢復溶血功能。將測試的血清與補體組分；人C3(Sigma-Aldrich或Quidel Corp.，50，100，500，1200μg/ml)；和人C5(Sigma-Aldrich或Quidel Corp.，50μg/ml))一起于4℃溫育40分鐘。使用抗人C5單抗(100μg/ml)和抗小鼠C5單抗(Hycult Biotech，10μg/ml)來確認此系統(tǒng)用于未來藥物發(fā)現(xiàn)的特異性和效用。

結果

如圖10A中顯示的，相對于野生型對照中觀察到的溶血功能，對野生型小鼠血清添加人C3蛋白能增強溶血功能。然而，當與將人C3蛋白添加回C3消減的人血清相比時，觀察到的增強小于人中顯示的增強。此外，如圖10B中顯示的，使用補充有人C3蛋白的人源化C5^hu/hu小鼠血清恢復百分比溶血。

在使用自C3敲除動物衍生的血清重復此實驗時，顯示對C3^-/-血清添加人C3蛋白挽救溶血功能，特別是隨著添加遞增濃度的人C3(圖11)。

比較而言，圖12顯示將人C3添加至C5無效動物衍生的血清不挽救溶血功能。

結論

總之，自本實施例得到的數(shù)據(jù)證明，雖然人C3能夠與鼠C5起交叉反應，但是小鼠C3類似地不能與人C5起交叉反應以在體外重演補體活性。下文表1中呈現(xiàn)了這些結果的匯總。

表1：小鼠和人C3，C5交叉活性的匯總