對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用

本申請(qǐng)要求提交于2014年11月12日的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/078,857的優(yōu)先權(quán)，該美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)通過(guò)引用以其整體并入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

該技術(shù)領(lǐng)域涉及遺傳修飾的動(dòng)物。

發(fā)明背景

1型神經(jīng)纖維瘤病(nf1)是最流行的遺傳病癥之一，在每3,000名活產(chǎn)嬰兒中發(fā)生一例，僅在美國(guó)就有超過(guò)100,000名受影響的人。nf1由神經(jīng)纖維瘤蛋白1(neurofibromin1,nf1)基因中的體細(xì)胞突變引起，其中50％的病例是遺傳的，并且50％的情況是新的突變。nf1是一種令人虛弱的疾病，因?yàn)榛颊咄ǔｏ@示出骨骼異常、脊柱側(cè)凸、學(xué)習(xí)失能、高血壓和癲癇[1]。nf1患者也有可能在其身體的整個(gè)周?chē)窠?jīng)中發(fā)展稱(chēng)為神經(jīng)纖維瘤的良性腫瘤。盡管神經(jīng)纖維瘤是良性的，但它們可以引起顯著的疼痛和移動(dòng)性(mobility)問(wèn)題。此外，繼發(fā)性遺傳變化引起在10％的患者中神經(jīng)纖維瘤的惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致惡性外周神經(jīng)鞘瘤(mpnsts)的發(fā)展[2]。mpnst是高度攻擊性和致命的肉瘤，并且目前，mpnst的唯一治療方案是完全手術(shù)切除或高劑量非特異性化療[2]。由與神經(jīng)緊密關(guān)聯(lián)，手術(shù)切除經(jīng)常不可行，并且化療經(jīng)常失敗。雖然在為這些腫瘤開(kāi)發(fā)靶向治療方面已經(jīng)付出了相當(dāng)大的努力，但沒(méi)有一個(gè)在臨床上顯示出顯著的功效，并且mpnst仍然是nf1患者死亡的主要原因。除了多種其他腫瘤類(lèi)型之外，nf1患者還具有發(fā)展為視神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤和幼年型骨髓單核細(xì)胞白血病的較高風(fēng)險(xiǎn)[3]。

附圖簡(jiǎn)述

圖1：人和豬nf1基因和蛋白的比對(duì)。nf1在人和豬之間是高度保守的。豬外顯子42對(duì)應(yīng)于人外顯子40，并且該區(qū)域的氨基酸序列也是高度保守的。氨基酸精氨酸1947(r1947)經(jīng)常在人患者中突變，并且該氨基酸在豬中是保守的。

圖2：talen設(shè)計(jì)以在nf1豬基因中創(chuàng)建r1947x突變。豬nf1外顯子42位于頂部。放大了外顯子42以顯示3個(gè)talen對(duì)的talen結(jié)合位點(diǎn)，以及精氨酸1947(r1947)氨基酸。

圖3a-d：利用talen和同源性依賴(lài)性修復(fù)(hdr)來(lái)誘導(dǎo)豬nf1基因中的r1947x突變。a.nf1基因外顯子42的野生型(wt)序列顯示在頂部。設(shè)計(jì)用于該基因座的talen(ssnf142.3talen)，并且對(duì)talen結(jié)合位點(diǎn)加下劃線(xiàn)(紅色)。設(shè)計(jì)了90堿基對(duì)的hdr寡聚物以誘導(dǎo)r1947x突變(大寫(xiě)字母是從野生型序列改變的堿基對(duì))和用于rflp分析的新型限制酶位點(diǎn)(紅色，加下劃線(xiàn))。下面顯示了所得的r1947x等位基因。b.在30攝氏度溫育3天后，細(xì)胞群的rflp分析顯示了所有三個(gè)talen都能夠以不同的速率誘導(dǎo)hdr，其中ssnf142.1是最有活性的(54.2％等位遺傳修飾)，ssnf142.2是中等活性的(45.1％等位遺傳修飾)以及ssnf142.3是所述3個(gè)talen中最低活性的(27.2％等位遺傳修飾)。c.對(duì)24個(gè)克隆的rflp分析顯示了在365堿基對(duì)處的未切割(wt)條帶和對(duì)應(yīng)于位于191和174堿基對(duì)處的消化的hdr等位基因的條帶。*指定了雜合克隆。d.對(duì)于兩個(gè)克隆的測(cè)序分析顯示了野生型等位基因和hdr等位基因兩者。

圖4a-c：talen活性與分離對(duì)于腫瘤抑制基因?yàn)殡s合的克隆的能力相關(guān)。a.圖形顯示了根據(jù)rflp為野生型、雜合，或純合克隆的百分比，所述克隆分離自ssnf142.2處理的細(xì)胞，并與預(yù)測(cè)的比率比較。為了預(yù)測(cè)純合克隆的百分比：(第3天rflp活性)∧2。為了預(yù)測(cè)雜合克隆的百分比：(第3天rflp活性x2)(1-第3天rflp活性)。對(duì)于具有比ssnf142.3更高的活性的ssnf142.2，觀察到多得多的基因修飾，偏向于純合ko克隆。b.對(duì)于ssnf142.3(具有較少活性的talen對(duì))，如預(yù)期的，回收到較少的純合ko克隆，并且野生型、雜合和純合克隆的比率更接近于所預(yù)測(cè)的比率。c.圖形顯示了ssnf142.2和ssnf142.3talen的不同活性。選擇通過(guò)rflp的10個(gè)雜合克隆用于測(cè)序分析。具有比ssnf142.3高得多的talen活性的ssnf142.2導(dǎo)致90％的在野生型等位基因中具有插入/缺失(indel)的測(cè)序克隆，而來(lái)自ssnf142.3talen處理的細(xì)胞的僅30％克隆顯示出插入/缺失。

圖5：用于在豬中順式修飾nf1和tp53的talen的設(shè)計(jì)。nf1和tp53位于豬的染色體12(人的染色體17)上極其接近。設(shè)計(jì)talen以創(chuàng)建nf1中的r1947x突變以及tp53中的y155x突變。相對(duì)于期望突變的talen結(jié)合位點(diǎn)如上所示。

圖6a-b：利用talen和同源性依賴(lài)性修復(fù)(hdr)來(lái)誘導(dǎo)豬nf1基因中的r1947x突變以及豬tp53基因中的y155x突變。a.當(dāng)共轉(zhuǎn)染入原代豬成纖維細(xì)胞時(shí)，通過(guò)rflp分析，ssnf142.3talen導(dǎo)致25.5％的等位遺傳修飾，以及通過(guò)細(xì)胞分析，sstp53e6talens導(dǎo)致11.8％的切割。b.針對(duì)24個(gè)克隆的rflp分析顯示了未切割的(野生型)條帶和對(duì)應(yīng)于針對(duì)nf1和tp53兩者的消化的hdr等位基因的條帶。*指定了雜合克隆。*指定了對(duì)nf1和tp53兩者是雜合的克隆。rflp分析顯示出：通過(guò)rflp，8.9％的克隆對(duì)nf1是雜合的，并且通過(guò)rflp，3.7％的克隆對(duì)nf1和tp53兩者是雜合的，但是所有被測(cè)序的克隆都包含nf1或tp53或兩者的野生型等位基因上的插入/缺失。

圖7：用于高限定熔解分析(highdefinitionmeltanalysis)的熔解曲線(xiàn)鑒定tp53的雜合克隆。

圖8a-c：nf1雜合豬表明增加的ras活性。a，表顯示了長(zhǎng)白農(nóng)場(chǎng)豬(landracefarmpig)和ossabaw迷你豬scnt實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。b，野生型成纖維細(xì)胞(左)和nf1r1947x/+纖維細(xì)胞(右)的western印跡。染色顯示了突變體細(xì)胞中增加的ras活性。在0、5和15分鐘收集細(xì)胞裂解物。c.相對(duì)于總ras(頂部)或gapdh(底部)標(biāo)準(zhǔn)化的ras-gtp。在兩個(gè)分析中，相較于nf1野生型細(xì)胞，nf1r1947x/+(nf1het)細(xì)胞顯示出增加的ras活性。

圖9a-d：nf1雜合豬具有nf1相關(guān)的表型。所有出生的nf1r1947x/+ossabaw迷你豬顯示出不同程度的色素沉著不足。所有的仔豬在它們的臉上顯示棕褐色/棕色色素沉著不足(9a,頂部)并且一頭仔豬在其背部顯示白色色素沉著不足(9a,底部)。9b.通過(guò)大體觀察(grossobservation)(9b,左)和x射線(xiàn)成像(9b,右)，nf1r1947x/+ossabaw迷你豬中的兩頭在尸檢時(shí)出現(xiàn)脊柱彎曲和潛在的脊柱側(cè)凸癥狀。約有20％的nf1患者記載了脊柱側(cè)凸。9c.表鑒定了在許多nf1r1947x/+ossabaw迷你豬中的一頭中觀察到存在多個(gè)牛奶咖啡斑(caféaulaitspot)。9d,1-4是在9c中鑒定的斑的照片。

發(fā)明詳述

雖然已經(jīng)開(kāi)發(fā)出數(shù)種小鼠模型來(lái)研究nf1，但是小鼠模型在其模擬(model)人類(lèi)疾病的能力方面具有局限性，并且對(duì)于新型成像技術(shù)和手術(shù)干預(yù)的開(kāi)發(fā)而言是低劣的模型。本文提供了建立nf1豬模型的材料和方法，所述模型可用于更好地理解nf1病因、疾病發(fā)展與進(jìn)展、新型成像和手術(shù)技術(shù)的應(yīng)用、以及臨床前藥物測(cè)試。此外，所述模型受益于tp53基因的敲除，并呈現(xiàn)了其實(shí)施方案。

在該研究過(guò)程中，本發(fā)明人最初不能產(chǎn)生nf1和/或tp53敲除上雜合的細(xì)胞。在該研究過(guò)程中，開(kāi)發(fā)了以下行為(action)的理論；然而，本發(fā)明不限于該理論化機(jī)制。可以理解，問(wèn)題在于nf1和tp53是腫瘤抑制基因。在細(xì)胞中主要研究了產(chǎn)生遺傳修飾的方法并涉及修飾細(xì)胞并在測(cè)試前允許它們復(fù)制。所述細(xì)胞是家畜細(xì)胞，其用于通過(guò)克隆來(lái)制備動(dòng)物。在此背景下，重要的是創(chuàng)建在原代細(xì)胞以及細(xì)胞的最少?gòu)?fù)制和/或傳代的情況下有效的方法，這是進(jìn)行有效遺傳修飾的另一個(gè)挑戰(zhàn)。由于敲除了腫瘤抑制基因，因此腫瘤抑制基因敲除上純合的細(xì)胞相對(duì)于雜合或野生型細(xì)胞是有利的。

基于這種認(rèn)識(shí)，嘗試了產(chǎn)生修飾的幾種不同方法。還有其他的限制，因?yàn)槟康闹辉谟谥苽湓趂1和tp53兩者的順式敲除上雜合的家畜細(xì)胞。這些方法之一是用靶向內(nèi)切核酸酶切割靶腫瘤抑制基因，以及為所述基因提供兩個(gè)同源性依賴(lài)性修復(fù)(hdr)模板。hdr模板中的一個(gè)具有旨在創(chuàng)建敲除的改變。但是第二個(gè)hdr模板具有野生型基因。根據(jù)以下實(shí)例，該方法是有效的。

另一種方法也使用兩個(gè)模板，其中所述模板中的一個(gè)非常接近于與野生型基因具有序列同一性。但是，產(chǎn)生了微小的改變提供容易檢測(cè)幾乎野生型(almost-wildtype)hdr模板的存在。產(chǎn)生了沉默突變以提供新型限制酶位點(diǎn)。并且修飾了敲除等位基因以具有其自身特有的限制位點(diǎn)。然后可以測(cè)試細(xì)胞以確定兩種變化是否存在。

腫瘤抑制基因

工作例描述了兩種不同腫瘤抑制基因的修飾。因此，腫瘤抑制基因通?？梢孕揎?，例如：

tp53腫瘤蛋白p53

pten磷酸化酶和tensin同源物

rbi(prb或rb1)成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤1

smad4smad家族成員4

bubib(bub1)出芽不受恩唑咪唑抑制(buddinguninhibitedbybenzimidazoles)

brca1乳腺癌1，早發(fā)

brca2乳腺癌2，早發(fā)

st14致瘤性抑制蛋白(suppressor)14

pvhlvonhippel-lindau腫瘤抑制蛋白

cd95fas受體

st5致瘤性抑制蛋白5

ypel3yippee樣3

st7致瘤性抑制蛋白7

nf2神經(jīng)纖維瘤蛋白2(merlin)

tsc1結(jié)節(jié)性硬化癥1

tsc2結(jié)節(jié)性硬化癥2

cdkn2a細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制子2a

ptchpatched

如其他地方所述，修飾可以是破壞(disruption)，敲除和抑制、具有插入/缺失(indel)、移碼、天然或野生型等位基因等。

經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物

可以制備在染色體修飾上單等位或雙等位的動(dòng)物。例如，本發(fā)明人已經(jīng)使用了同源性依賴(lài)性重組(hdr)方法來(lái)對(duì)動(dòng)物的染色體做出改變，或向其插入外源性基因。在本文的其它地方討論了如talens和重組酶融合蛋白的工具，以及常規(guī)方法。本發(fā)明人的實(shí)驗(yàn)室先前已經(jīng)證明了當(dāng)從修飾細(xì)胞的多基因群體克隆時(shí)超常的克隆效率，并倡導(dǎo)這種方法來(lái)避免通過(guò)分離集落的體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移(scnt)的克隆效率的變化(carlson等，2011)。有些人使用遺傳修飾和scnt的連續(xù)周期減少了這一負(fù)擔(dān)(kuroiwa等，2004)，然而，這既是在技術(shù)上具有挑戰(zhàn)性的又是成本過(guò)高的。在scnt之前常規(guī)地生成雙等位ko細(xì)胞的能力在大型動(dòng)物遺傳工程化中是顯著的進(jìn)步。在永生化細(xì)胞系中，使用其它方法例如zfn和稀釋克隆已經(jīng)完成了雙等位敲除(liu等，2010)。最近另一個(gè)小組證明了使用商業(yè)zfn試劑的豬ggta1的雙等位敲除(hauschild等，2011)，其中可以通過(guò)針對(duì)ggta1-依賴(lài)的表面表位缺乏的facs來(lái)富集雙等位裸細(xì)胞(bi-allelicnullcell)。雖然這些研究證明了某些有用的概念，它們沒(méi)有顯示動(dòng)物或家畜可以被修飾，因?yàn)楹?jiǎn)單的克隆稀釋對(duì)于原代成纖維細(xì)胞隔離群(isolate)通常不可行(成纖維細(xì)胞以低密度不良生長(zhǎng))，且對(duì)于大多數(shù)基因，裸細(xì)胞(nullcell)的生物學(xué)富集不可用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，靶向性核酸酶系統(tǒng)在意圖的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)處有效切割dsdna。靶向性核酸酶系統(tǒng)包括基序，其通過(guò)蛋白與dna結(jié)合或者通過(guò)核酸與dna結(jié)合而結(jié)合至關(guān)聯(lián)dna。本文報(bào)道的效率是顯著的。本發(fā)明人在其他地方公開(kāi)了進(jìn)一步提高這些效率的其他技術(shù)。

本發(fā)明的實(shí)施方案包括制備經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物的方法，所述方法包括將胚胎或細(xì)胞暴露于編碼靶向性核酸酶(例如，大范圍核酸酶(meganuclease)，鋅指，talens，引導(dǎo)rna，重組酶融合分子)的載體或mrna，其中所述靶向性核酸酶特異性結(jié)合所述胚胎或細(xì)胞中的靶染色體位點(diǎn)，創(chuàng)建對(duì)細(xì)胞染色體的改變，在代孕母體(surrogatemother)中克隆所述細(xì)胞或?qū)⑺雠咛ヒ浦驳酱心阁w中，由此所述代孕母體孕育在無(wú)報(bào)告基因的情況下并僅在靶定的染色體位點(diǎn)處遺傳修飾的動(dòng)物。靶定的位點(diǎn)可以是本文所列出的，例如，本文所述的多種基因。本文詳細(xì)描述了模板驅(qū)使的基因漸滲(introgression)方法。本發(fā)明的實(shí)施方案包括模板驅(qū)使的基因漸滲，例如，通過(guò)hdr模板，來(lái)修飾非人動(dòng)物，或任意物種的細(xì)胞的腫瘤抑制基因。

這一方法以及本文的一般方法涉及細(xì)胞和動(dòng)物。可以從下組選擇這些：非人脊椎動(dòng)物，非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，牛，馬，豬，綿羊，雞，鳥(niǎo)，兔，山羊，狗，貓，實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物，和魚(yú)類(lèi)。術(shù)語(yǔ)家畜表示馴養(yǎng)的動(dòng)物，其作為食物或生物材料商品飼養(yǎng)。術(shù)語(yǔ)偶蹄動(dòng)物表示偶蹄目(artiodactyla)的有蹄哺乳動(dòng)物，其包括牛，鹿，駱駝，河馬，綿羊和山羊，其每只腳具有偶數(shù)腳趾，通常為兩個(gè)或有時(shí)為四個(gè)。

同源性指導(dǎo)的修復(fù)(hdr)

同源性指導(dǎo)的修復(fù)(hdr)是細(xì)胞中修復(fù)ssdna和雙鏈dna(dsdna)損傷的一種機(jī)制。當(dāng)存在有與損傷位點(diǎn)具有顯著同源性的序列的hdr模板時(shí)，細(xì)胞可以使用這一修復(fù)機(jī)制。特異性結(jié)合，該術(shù)語(yǔ)在生物領(lǐng)域中通常使用時(shí)指代分子以與非靶組織相比相對(duì)較高的親和力結(jié)合靶物，并且通常涉及多個(gè)非共價(jià)相互作用，如靜電相互作用、范德華相互作用、氫鍵鍵合等等。特異性雜交是具有互補(bǔ)序列的核酸之間的特異性結(jié)合的形式。蛋白也可以特異性結(jié)合dna，例如，在talen或crispr/cas9系統(tǒng)中或通過(guò)gal4基序。等位基因的漸滲指代通過(guò)模板引導(dǎo)方法相對(duì)于內(nèi)源性等位基因?qū)⑼庠葱缘任换驈?fù)制的過(guò)程。在一些情況下，內(nèi)源性等位基因?qū)嶋H上可以被切出并由外源性核酸等位基因代替，但現(xiàn)在的理論是這一過(guò)程是復(fù)制機(jī)制。由于等位基因是基因?qū)?，它們之間具有顯著的同源性。等位基因可以是編碼蛋白的基因，或其可以具有其它功能，如編碼生物活性rna鏈，或提供位點(diǎn)以接受調(diào)節(jié)蛋白或rna。

hdr模板是包含漸滲的等位基因的核酸。模板可以是dsdna或單鏈dna(ssdna)。ssdna模板優(yōu)選的是從約20到約5000個(gè)殘基，雖然也可以使用其它長(zhǎng)度。技術(shù)人員將立即理解，明確陳述的范圍內(nèi)的所有范圍和數(shù)值都是涵蓋的；例如，從500到1500個(gè)殘基，從20到100個(gè)殘基，等等。模板可以進(jìn)一步包含側(cè)翼序列，其提供與要取代的內(nèi)源性等位基因或dna鄰近的dna的同源性。模板還可以包括結(jié)合到靶向性核酸酶系統(tǒng)的序列，并因此是系統(tǒng)的dna結(jié)合成員的關(guān)聯(lián)結(jié)合位點(diǎn)。術(shù)語(yǔ)關(guān)聯(lián)指代通常相互作用的兩種生物分子，例如受體及其配體。在hdr過(guò)程的語(yǔ)境中，生物分子中的一個(gè)可以設(shè)計(jì)為帶有結(jié)合意圖(即關(guān)聯(lián))dna位點(diǎn)或蛋白位點(diǎn)的序列。

靶向核酸酶系統(tǒng)

基因組編輯工具(如轉(zhuǎn)錄激活物樣效應(yīng)器核酸酶(talen))和鋅指核酸酶(zfn)已經(jīng)影響了許多物種中的生物技術(shù)、基因治療，以及功能基因組研究領(lǐng)域。最近，rna引導(dǎo)的內(nèi)切核酸酶(rgen)通過(guò)互補(bǔ)rna分子引導(dǎo)到其靶位點(diǎn)。cas9/crispr系統(tǒng)是regen。tracrrna是另一種此類(lèi)工具。這些是靶向性核酸酶系統(tǒng)的例子：這些系統(tǒng)具有將所述核酸酶定位到靶位點(diǎn)的dna結(jié)合成員。接著，核酸酶切割位點(diǎn)。talen和zfn具有融合到dna結(jié)合成員的核酸酶。cas9/crispr是在靶dna上找到彼此的關(guān)聯(lián)物。dna結(jié)合成員具有染色體dna中的關(guān)聯(lián)序列。dna結(jié)合成員通常根據(jù)意圖的關(guān)聯(lián)序列設(shè)計(jì)，以獲得在意圖位點(diǎn)處或附近獲得核水解作用。某些實(shí)施方案可不受限地應(yīng)用于所有此類(lèi)系統(tǒng)；包括最小化核酸酶再切割的實(shí)施方案，在意圖殘基處精確產(chǎn)生snp的實(shí)施方案，以及在dna結(jié)合位點(diǎn)處漸滲的等位基因的放置。本文中的例子已經(jīng)用talen來(lái)實(shí)施。其他實(shí)施方案涉及使用其他靶向核酸內(nèi)切核酸酶的相同的過(guò)程和動(dòng)物。

talen

術(shù)語(yǔ)talen用于本文是廣泛的，并且包括不需要另一個(gè)talen輔助而能切割雙鏈dna的單體talen。術(shù)語(yǔ)talen還用于指代工程化改造成共同起作用以在相同位點(diǎn)處切割dna的talen對(duì)的一個(gè)或兩個(gè)成員。共同起工作的talen可以稱(chēng)為左-talen和右-talen，其參考dna或talen對(duì)的手性。

tal的密碼(cipher)已有報(bào)道(pct申請(qǐng)wo2011/072246)，其中每個(gè)dna結(jié)合重復(fù)負(fù)責(zé)識(shí)別靶dna序列中的一個(gè)堿基對(duì)?？梢匝b配殘基以靶向dna序列。簡(jiǎn)言之，確定用于talen結(jié)合的靶位點(diǎn)，并創(chuàng)建包含核酸酶和一系列識(shí)別靶位點(diǎn)的rvd的融合蛋白。在結(jié)合后，核酸酶切割dna，使得細(xì)胞修復(fù)機(jī)器能夠運(yùn)行以在切割末端處產(chǎn)生遺傳修飾。術(shù)語(yǔ)talen意指包含轉(zhuǎn)錄激活物樣(tal)效應(yīng)器結(jié)合域和核酸酶域的蛋白，并包括本身功能性的單體talen以及其它要求與另一個(gè)單體talen二聚化的talan。當(dāng)兩個(gè)單體talen相同時(shí)二聚化可以產(chǎn)生同二聚體talen，或者當(dāng)單體talen不同時(shí)可以產(chǎn)生異二聚體talen。已顯示了talen在永生化的人類(lèi)細(xì)胞中通過(guò)兩種主要的真核dna修復(fù)途徑(非同源末端連接(nhej)和同源性指導(dǎo)的修復(fù))來(lái)誘導(dǎo)基因修飾。talen通常成對(duì)使用，但單體talens是已知的。用于talen(以及其它遺傳工具)處理的細(xì)胞包括培養(yǎng)細(xì)胞、永生化細(xì)胞、原代細(xì)胞、原代體細(xì)胞、受精卵、生殖細(xì)胞、原生殖細(xì)胞、胚泡，或干細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，tal效應(yīng)器可以用于將其它蛋白結(jié)構(gòu)域(例如，非核酸酶蛋白結(jié)構(gòu)域)靶向特定的核苷酸序列。例如，可以將tal效應(yīng)器與蛋白結(jié)構(gòu)域相連，所述蛋白結(jié)構(gòu)域來(lái)自(不限于)dna20相互作用酶(例如，甲基化酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶、整合酶、轉(zhuǎn)座酶，或連接酶)，轉(zhuǎn)錄活化子或抑制子，或與其它蛋白例如組蛋白相互作用或修飾其它蛋白例如組蛋白的蛋白。這種tal效應(yīng)器融合的應(yīng)用包括例如創(chuàng)建或修飾表觀遺傳調(diào)節(jié)元件，產(chǎn)生dna中的位點(diǎn)特異性插入、缺失，或修復(fù)，控制基因表達(dá)，以及修飾染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。

術(shù)語(yǔ)核酸酶包括外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶。術(shù)語(yǔ)內(nèi)切核酸酶指代能夠催化dna或rna分子(優(yōu)選dna分子)內(nèi)的核酸之間的鍵的水解(切割)的任意野生型或變體酶。內(nèi)切核酸酶的非限制性例子包括ii類(lèi)限制性?xún)?nèi)切核酸酶，如foki、hhai、hindiii、noti、bbvcl、ecori、bglii，和alwi。當(dāng)具有通常長(zhǎng)度約12-45個(gè)堿基對(duì)(bp)，更優(yōu)選14-45bp的多核苷酸識(shí)別位點(diǎn)時(shí)，內(nèi)切核酸酶還包含切點(diǎn)稀有切割內(nèi)切核酸酶(rare-cuttingendonucleases)。稀有切割內(nèi)切核酸酶在限定基因座處誘導(dǎo)dna雙鏈斷裂(dsb)。稀有切割內(nèi)切核酸酶可以是例如靶向內(nèi)切核酸酶，即由工程化鋅指域與限制性酶(如foki)或化學(xué)內(nèi)切核酸酶的催化域融合得到的嵌合鋅指核酸酶(zfn)。在化學(xué)內(nèi)切核酸酶中，化學(xué)或肽切割劑與核酸聚合物或另一個(gè)識(shí)別特定靶序列的dna綴合，從而將切割活性靶向到特定的序列?；瘜W(xué)內(nèi)切核酸酶也包括合成的核酸酶，如鄰二氮雜菲、dna切割分子，以及已知結(jié)合特定dna序列的三鏈體形成寡核苷酸(triplex-formingoligonucleotides，tfo)的綴合物。根據(jù)本發(fā)明，這些化學(xué)內(nèi)切核酸酶包含于術(shù)語(yǔ)“內(nèi)切核酸酶”中。酸酶的例子包括i-seei、i-chuli-crei、i-csmi、pi-seelpi-ttilpi-mtui、i-ceui、i-seeil1-seeiii、ho、pi-civi、pi-ctrlpi-aaei、pi-bsui、pi-dhai、pi-dralpi-mavlpi-mehi、pi-mfulpi-mfli、pi-mgalpi-mgoi、pi-minlpi-mkalpi-mlei、pi-mmai、pi-30mshlpi-msmi、pi-mthi、pi-mtui、pi-mxei、pi-npui、pi-pfulpi-rmai、pl-spbi、pi-ssplpi-faelpi-mjai、pi-pholpi-taglpi-thyi、pi-tkoi、pi-tspi、i-msol。

由talen或其它工具產(chǎn)生的遺傳修飾可以例如選自下組：插入，缺失，外源性核酸片段的插入，以及取代。術(shù)語(yǔ)插入廣泛地使用，以表示字面上的插入到染色體中或使用外源性序列作為模板用于修復(fù)。一般來(lái)說(shuō)，鑒定靶dna位點(diǎn)并創(chuàng)建將特異性結(jié)合所述位點(diǎn)的talen對(duì)。向細(xì)胞或胚胎遞送所述talen，例如，作為蛋白、mrna，或通過(guò)編碼所述talen的載體。所述talen剪切dna以產(chǎn)生雙鏈斷裂，其接著被修復(fù)，通常導(dǎo)致插入刪除的創(chuàng)建，或摻入伴隨的外源性核酸中含有的序列或多態(tài)性，所述外源性核酸被插入染色體中或作為模板用于在修飾的序列情況下的斷裂修復(fù)。這一模板驅(qū)使的修復(fù)對(duì)于改變?nèi)旧w是一個(gè)有用的過(guò)程，且提供對(duì)細(xì)胞染色體的高效改變。

術(shù)語(yǔ)外源性核酸意指加到細(xì)胞或胚胎的核酸，不論所述核酸與細(xì)胞中的天然核酸序列相同或不同。術(shù)語(yǔ)核酸片段是廣泛的，包括染色體、表達(dá)盒、基因、dna、rna、mrna，或其片段。所述細(xì)胞或胚胎可以例如選自下組：非人脊椎動(dòng)物、非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物、牛、馬、豬、綿羊、雞、鳥(niǎo)類(lèi)、兔、山羊、狗、貓、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，和魚(yú)。

一些實(shí)施方案涉及制備經(jīng)遺傳修飾的家畜和/或偶蹄動(dòng)物的組合物或方法，其包含將talen對(duì)導(dǎo)入家畜和/或偶蹄動(dòng)物的細(xì)胞或胚胎中，從而在位talen對(duì)特異性結(jié)合的位點(diǎn)處對(duì)細(xì)胞或胚胎dna做出遺傳修飾，以及從所述細(xì)胞產(chǎn)生家畜動(dòng)物和/或偶蹄動(dòng)物。直接注射可以用于細(xì)胞或胚胎，例如注射到合子、胚泡，或胚胎中?；蛘撸梢允褂糜糜诘鞍?、rna、mrna、dna，或載體導(dǎo)入的多種已知技術(shù)之任一種，將talen和/或其它因子導(dǎo)入細(xì)胞中。可以從胚胎或細(xì)胞根據(jù)已知方法(例如將胚胎移植到妊娠期的宿主中)，或各種克隆方法產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物。短語(yǔ)“在talen特異性結(jié)合的位點(diǎn)處對(duì)細(xì)胞dna的遺傳修飾”等表示當(dāng)talen特異性結(jié)合其靶位點(diǎn)時(shí)，在talen上的核酸酶切割的位點(diǎn)處做出遺傳修飾。核酸酶并不在talen對(duì)結(jié)合的地方精確切割，而是在兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)之間的確定位點(diǎn)處切割。

一些實(shí)施方案涉及對(duì)用于克隆動(dòng)物的組合物或?qū)?xì)胞的處理。細(xì)胞可以是家畜和/或偶蹄動(dòng)物細(xì)胞、培養(yǎng)的細(xì)胞、原代細(xì)胞、原代體細(xì)胞、合子、生殖細(xì)胞、原生殖細(xì)胞、胚泡，或干細(xì)胞。例如，一個(gè)實(shí)施方案是創(chuàng)建遺傳修飾的組合物或方法，其包含將培養(yǎng)物中的復(fù)數(shù)個(gè)原代細(xì)胞暴露于talen蛋白或編碼一種或多種talen的核酸。talen可以作為蛋白質(zhì)或核酸片段(例如由mrna或載體中的dna序列編碼)導(dǎo)入。

鋅指核酸酶

鋅指核酸酶(zfns)是人工限制酶，其通過(guò)將鋅指dna結(jié)合域和dna剪切結(jié)構(gòu)域融合產(chǎn)生。鋅指結(jié)構(gòu)域可以經(jīng)工程化來(lái)靶向期望的dna序列而這使得鋅指核酸酶能夠靶向復(fù)雜的基因組中的獨(dú)特序列。通過(guò)利用內(nèi)源性dna修復(fù)機(jī)制，這些試劑可以用于改變高等生物的基因組。zfn可以用于使基因失活的方法中。

鋅指dna結(jié)合域具有約30個(gè)氨基酸并折疊為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。每個(gè)指主要結(jié)合dna底物中的三聯(lián)體。關(guān)鍵位置的氨基酸殘基有助于大多數(shù)與dna位點(diǎn)的序列特異性相互作用。這些氨基酸可以在維持剩下的氨基酸的情況下改變以保留必要的結(jié)構(gòu)。通過(guò)串聯(lián)連接幾個(gè)結(jié)構(gòu)域完成與較長(zhǎng)dna序列的結(jié)合。其它的功能性，如非特異性foki剪切結(jié)構(gòu)域(n)，轉(zhuǎn)錄活化子結(jié)構(gòu)域(a)，轉(zhuǎn)錄抑制子結(jié)構(gòu)域(r)以及甲基化酶(m)可以融合到zfp以分別形成zfn，鋅指轉(zhuǎn)錄活化子(zfa)，鋅指轉(zhuǎn)錄抑制子(zfr)，以及鋅指甲基化酶(zfm)。使用鋅指和鋅指核酸酶用于制造遺傳修飾的動(dòng)物的材料和方法公開(kāi)于，例如us8,106,255，us2012/0192298，us2011/0023159,和us2011/0281306。

載體和核酸

可以將多種核酸導(dǎo)入細(xì)胞中，用于敲除的目的，用于基因的失活，獲得基因的表達(dá)，或用于其它目的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)核酸包括dna、rna，以及核酸類(lèi)似物，以及雙鏈或單鏈(即正義或反義單鏈)的核酸。核酸類(lèi)似物可以在堿基部分、糖部分，或磷酸主鏈處修飾以改進(jìn)例如核酸的穩(wěn)定性，雜交，或溶解性?？梢孕揎椕撗鹾颂橇姿嶂麈渷?lái)產(chǎn)生嗎啉代核酸，其中每一個(gè)堿基部分與六元嗎啉環(huán)或肽核酸相連，其中脫氧磷酸主鏈被假肽主鏈代替，而保留四種堿基。

靶核酸序列可以可操作地連接到調(diào)控區(qū)，如啟動(dòng)子。調(diào)控區(qū)可以是豬調(diào)控區(qū)，或者可以來(lái)自其它物種。如本文所用，可操作地連接指代將調(diào)控區(qū)相對(duì)于核酸序列以允許或促進(jìn)靶核酸轉(zhuǎn)錄的方式定位。

一般可以將啟動(dòng)子類(lèi)型可操作地連接到靶核酸序列。啟動(dòng)子的例子包括但不限于組織特異性啟動(dòng)子，組成性啟動(dòng)子，可誘導(dǎo)啟動(dòng)子，以及對(duì)特定刺激物響應(yīng)或者不響應(yīng)的啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，可以使用促進(jìn)核酸分子表達(dá)而沒(méi)有顯著的組織或時(shí)空特異性的啟動(dòng)子(例如，組成型啟動(dòng)子)。例如，可以使用β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子如雞β-肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子、泛素啟動(dòng)子、minicag啟動(dòng)子，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(gapdh)啟動(dòng)子，或3-磷酸甘油酸激酶(pgk)啟動(dòng)子及病毒啟動(dòng)子例如單純皰疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)啟動(dòng)子、sv40啟動(dòng)子，或巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子。在一些實(shí)施方案中，雞β肌動(dòng)蛋白基因啟動(dòng)子和cmv增強(qiáng)子的融合物作為啟動(dòng)子使用。見(jiàn)例如xu等，(2001)hum.genether.12:563；和kiwaki等，(1996)hum.genether.7:821。

可以用于核酸構(gòu)建體的另外的調(diào)節(jié)區(qū)包括但不限于多聚腺苷酸化序列、翻譯控制序列(例如內(nèi)部核糖體進(jìn)入?yún)^(qū)段，ires)、增強(qiáng)子、誘導(dǎo)型元件，或內(nèi)含子。這些調(diào)節(jié)區(qū)可能不是必要的，盡管它們可以通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄、mrna的穩(wěn)定性，翻譯效率等等來(lái)增加表達(dá)。在想要時(shí)核酸構(gòu)建體中可以包含此類(lèi)調(diào)節(jié)區(qū)以獲得核酸在細(xì)胞中的最優(yōu)表達(dá)。然而，有時(shí)可以在沒(méi)有此類(lèi)另外的元件的情況下獲得足夠的表達(dá)。

可以使用編碼信號(hào)肽或選擇標(biāo)志物的核酸構(gòu)建體?？梢允褂眯盘?hào)肽，使得編碼的多肽定向到特定的細(xì)胞位置(例如細(xì)胞表面)。可選擇標(biāo)志物的非限制性例子包括嘌呤霉素、更昔洛韋、腺苷脫氨酶(ada)、氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(neo、g418、aph)，二氫葉酸還原酶(dhfr)，潮霉素-b-磷酸轉(zhuǎn)移酶，胸苷激酶(tk)，以及黃嘌呤(xanthin,xanthine)-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(xgprt)。此類(lèi)標(biāo)志物對(duì)于在培養(yǎng)物中選擇穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體是有用的。其它的選擇標(biāo)志物包括熒光多肽，如綠色熒光蛋白或黃色熒光蛋白。

在一些實(shí)施方案中，編碼可選擇標(biāo)志物的序列在側(cè)翼可以有重組酶(如例如cre或flp)的識(shí)別序列。例如，可選擇標(biāo)志物在側(cè)翼可以有l(wèi)oxp識(shí)別位點(diǎn)(由cre重組酶識(shí)別的34-bp識(shí)別位點(diǎn))或者frt識(shí)別位點(diǎn)，使得可選擇標(biāo)志物可以從構(gòu)建體切除。見(jiàn)orban等,proc.natl.acad.sci.(1992)89:6861(關(guān)于cre/lox技術(shù)的綜述)及brand和dymecki,dev.cell(2004)6:7。含有由可選擇標(biāo)志物基因中斷的cre-或flp-可激活轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)座子也可以用于獲得帶有轉(zhuǎn)基因的條件性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。例如，驅(qū)動(dòng)標(biāo)志物/轉(zhuǎn)基因表達(dá)的啟動(dòng)子可以是普遍的或者組織特異性的，其可以導(dǎo)致標(biāo)志物在f0動(dòng)物(例如豬)中的普遍或組織特異性表達(dá)。轉(zhuǎn)基因的組織特異性激活可以通過(guò)例如將普遍表達(dá)標(biāo)志物中斷的轉(zhuǎn)基因的豬與以組織特異性的方式表達(dá)cre或flp的豬雜交，或通過(guò)以組織特異性的方式表達(dá)標(biāo)志物中斷的轉(zhuǎn)基因的豬與普遍表達(dá)cre或flp重組酶的豬雜交來(lái)完成。轉(zhuǎn)基因的受控表達(dá)或標(biāo)志物的受控切除允許轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，外源核酸編碼多肽。編碼多肽的核酸序列可以包括編碼“標(biāo)簽”的標(biāo)簽序列，所述標(biāo)簽設(shè)計(jì)為促進(jìn)編碼多肽的后續(xù)操作(例如，促進(jìn)定位或檢測(cè))。可以將標(biāo)簽序列插入編碼多肽的核酸序列中，使得編碼的標(biāo)簽定位于多肽的羧基或氨基末端。編碼的標(biāo)簽的非限制性例子包括谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(gst)和flag^tm標(biāo)簽(kodak,newhaven,ct)。

核酸構(gòu)建體可以使用sssicpg甲基化酶(newenglandbiolabs,ipswich,ma)甲基化。一般來(lái)說(shuō)，核酸構(gòu)建體可以與緩沖液中的s-腺苷甲硫氨酸和sssicpg-甲基化酶在37℃一起孵育?？梢酝ㄟ^(guò)將構(gòu)建體與1個(gè)單位hinp1i內(nèi)切核酸酶在37℃孵育1小時(shí)和通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定確認(rèn)超甲基化。

可以使用多種技術(shù)，將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入任意類(lèi)型的胚胎、胎兒，或成年偶蹄動(dòng)物/家畜細(xì)胞，包括例如生殖細(xì)胞，如卵母細(xì)胞或卵細(xì)胞，祖細(xì)胞、成體或胚胎干細(xì)胞，原生殖細(xì)胞，腎細(xì)胞，如pk-15細(xì)胞、胰島細(xì)胞、beta細(xì)胞、肝細(xì)胞，或成纖維細(xì)胞，如皮膚成纖維細(xì)胞中。技術(shù)的非限制性例子包括使用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)、能感染細(xì)胞的重組病毒，或脂質(zhì)體或能夠?qū)⒑怂徇f送到細(xì)胞的其它非病毒方法，如電穿孔，顯微注射，或磷酸鈣沉淀。

在轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)中，核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)錄單元(即可操作地連接到外源核酸序列的調(diào)控區(qū))側(cè)翼有轉(zhuǎn)座子的反向重復(fù)。已開(kāi)發(fā)了幾種轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)(包括，例如sleepingbeauty(見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,613,752和美國(guó)公布號(hào)2005/0003542)；frogprince(miskey等，(2003)nucleicacidsres.31:6873)；tol2(kawakami(2007)genomebiology8(suppl.l):s7；minos(pavlopoulos等，genomebiology8(suppl.l):s2,2007)；hsmar1(miskey等)molcellbiol.27:4589,2007)；以及passport來(lái)將核酸導(dǎo)入細(xì)胞(包括小鼠、人和豬細(xì)胞)中。sleepingbeauty轉(zhuǎn)座子尤其有用。轉(zhuǎn)座酶可以作為蛋白遞送，與外源核酸在相同的核酸構(gòu)建體上編碼，可以在分開(kāi)的核酸構(gòu)建體上導(dǎo)入，或作為mrna(例如，體外轉(zhuǎn)錄并加帽的mrna)提供。

核酸可以整合到載體中。載體是廣義的術(shù)語(yǔ)，其包括設(shè)計(jì)為從攜帶者(carrier)移動(dòng)到靶dna中的任意特定dna區(qū)段。載體可以稱(chēng)為表達(dá)載體，或載體系統(tǒng)，其為引起dna插入基因組或其它靶定dna序列(如附加體、質(zhì)粒，或甚至病毒/噬菌體dna區(qū)段)中需要的一組組分。在動(dòng)物中用于基因遞送的載體系統(tǒng)(如病毒載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒以及整合噬菌體病毒)，以及非病毒載體(例如轉(zhuǎn)座子))具有兩個(gè)基本組分：1)由dna(或rna，其逆轉(zhuǎn)錄成cdna)組成的載體，以及2)轉(zhuǎn)座酶、重組酶，或其它整合酶，其識(shí)別載體和dna靶序列兩者，并將載體插入靶dna序列中。載體最常含有一個(gè)或多個(gè)表達(dá)盒，其包含一個(gè)或多個(gè)表達(dá)控制序列，其中表達(dá)控制序列是分別控制并調(diào)節(jié)另一個(gè)dna序列或mrna轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的dna序列。

許多不同類(lèi)型的載體是已知的。例如，質(zhì)粒和病毒載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)是已知的。哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒通常具有復(fù)制起點(diǎn)，適合的啟動(dòng)子和可選的增強(qiáng)子，以及還有任意必要的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，多聚腺苷酸化位點(diǎn)，剪接供體和受體位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄終止序列，以及5’側(cè)翼非轉(zhuǎn)錄序列。載體的例子包括：質(zhì)粒(其也可以是其他種類(lèi)載體的攜帶者)，腺病毒、腺相關(guān)病毒(aav)、慢病毒(例如修飾的hiv-1、siv或fiv)，逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如asv、alv或momlv)，以及轉(zhuǎn)座子(例如sleepingbeauty、p-元件、tol-2、frogprince、piggybac)。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)核酸指代rna和dna兩者，包括例如cdna、基因組dna、合成(例如化學(xué)合成)dna，以及天然存在的和經(jīng)化學(xué)修飾的核酸，例如合成的堿基或替代主鏈。核酸分子可以是雙鏈或單鏈的(例如有義或反義單鏈)。術(shù)語(yǔ)轉(zhuǎn)基因在本文中廣泛使用，指代其遺傳材料已經(jīng)使用遺傳工程技術(shù)改變的經(jīng)遺傳修飾的生物體或遺傳工程化生物體。因此，敲除偶蹄動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因的，無(wú)論外源性基因或核酸是否在動(dòng)物或其后代中表達(dá)與否。

經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物

可以使用talens和其它遺傳工程化技術(shù)修飾動(dòng)物，包括重組酶融合蛋白，或已知的多種載體。通過(guò)這些工具制成的遺傳修飾可以包括對(duì)基因的破壞。術(shù)語(yǔ)對(duì)基因的破壞指代阻止功能性基因產(chǎn)物的形成。僅當(dāng)基因產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)它的正常(野生型)功能時(shí)，其為功能性的。對(duì)基因的破壞阻止由所述基因編碼的功能性因子的表達(dá)，并包括對(duì)向基因編碼的序列和/或?qū)τ谒龌蛟趧?dòng)物中的表達(dá)必要的啟動(dòng)子和/或操縱子中一個(gè)或多個(gè)堿基的插入、缺失，或取代?？梢酝ㄟ^(guò)，例如從動(dòng)物的基因組中去除至少一部分所述基因，改變所述基因以防止由該基因編碼的功能性因子的表達(dá)，干擾rna，或通過(guò)外源性基因的顯性陰性因子的表達(dá)來(lái)破壞所述破壞的基因。遺傳修飾動(dòng)物的材料和方法進(jìn)一步詳細(xì)描述于2012年2月24日提交的美國(guó)系列號(hào)13/404,662，2012年5月9日提交的13/467,588和2009年11月10日提交的12/622,886，其各自通過(guò)提述并入本文用于所有目的；在沖突的情況下，以本說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。術(shù)語(yǔ)反式作用指代不同的分子作用于靶基因的過(guò)程(即分子間)。反式作用元件通常是含有基因的dna序列。這一基因編碼用于調(diào)節(jié)所述靶基因的蛋白(或microrna或其它可擴(kuò)散分子)。所述反式作用基因可以與靶基因在同一條染色體上，但活性通過(guò)其編碼的中間蛋白或rna。反式作用基因的實(shí)施方案為例如編碼靶向性核酸內(nèi)切核酸酶的基因。使用顯性陰性(dominantnegative)對(duì)基因的失活通常涉及反式作用元件。術(shù)語(yǔ)順式調(diào)節(jié)或順式作用意指在不編碼蛋白或rna的情況下的作用；在基因失活的語(yǔ)境中，該術(shù)語(yǔ)通常表示基因的編碼部分的失活，或?qū)τ诠δ苄曰虻谋磉_(dá)必要的啟動(dòng)子和/或操縱子的失活。

本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)可以用于使基因失活以制造敲除動(dòng)物和/或?qū)⒑怂針?gòu)建體導(dǎo)入動(dòng)物中，來(lái)產(chǎn)生建立者動(dòng)物(founderanimals)和制造動(dòng)物品系，其中所述敲除或核酸構(gòu)建體整合到基因組中。這些技術(shù)包括但不限于原核(pronuclear)顯微注射(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4,873,191)，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的對(duì)生殖細(xì)胞系的基因轉(zhuǎn)移(vanderputten等，proc.natl.acad.sci.usa,82:6148-1652,1985)，對(duì)胚胎干細(xì)胞的基因靶向(thompson等，cell,56:313-321，1989)，胚胎的電穿孔(lo,mol.cell.biol.,3:1803-1814,1983)，精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(lavitrano等,proc.natl.acad.sci.usa99,14230-14235,2002；lavitrano等,reprod.fert.develop.18,19-23,2006)，以及體細(xì)胞(例如卵丘細(xì)胞或乳腺細(xì)胞)，或成體、胎兒或胚胎干細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)化，接著進(jìn)行核移植(wilmut等,nature,385:810-813,1997；和wakayama等，nature,394:369-374,1998)。原核顯微注射、精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，以及體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移是特別有用的技術(shù)。基因組修飾的動(dòng)物是其中它的所有細(xì)胞都具有所述遺傳修飾的動(dòng)物，包括生殖系細(xì)胞。當(dāng)使用產(chǎn)生在其遺傳修飾上嵌合的動(dòng)物的方法時(shí)，可以使所述動(dòng)物同系交配(inbred)并可以選擇基因組修飾的后代。例如，如果在胚泡階段修飾其細(xì)胞，可以使用克隆來(lái)制造嵌合體動(dòng)物，或當(dāng)修飾單細(xì)胞時(shí)可以發(fā)生基因組修飾。

通常來(lái)說(shuō)，在原核顯微注射中，將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入受精卵中；1個(gè)或2細(xì)胞受精卵用作含有來(lái)自精子頭部的遺傳材料的原核，并且卵在原生質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)。原核分期的受精卵可以在體外或體內(nèi)獲得(即從供體動(dòng)物的輸卵管中手術(shù)回收)?？梢匀缦庐a(chǎn)生體外受精卵。例如，可以在屠宰場(chǎng)采集豬的卵巢，并在運(yùn)輸期間保持在22-28℃?？梢詻_洗并分離卵巢用于卵泡穿刺，可以使用18號(hào)針在真空下將范圍從4-8mm的卵泡抽吸到50ml錐形離心管中?？梢允褂蒙虡I(yè)tl-fiepes(minitube,verona,wi)通過(guò)預(yù)濾器潤(rùn)洗卵泡液和抽吸的卵母細(xì)胞。可以選擇被緊密的卵丘質(zhì)包圍的卵母細(xì)胞并放置到tcm-199卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)基(minitube,verona,wi)中，其使用0.1mg/ml半胱氨酸,10ng/ml表皮生長(zhǎng)因子,10％豬濾泡液,50μμ2-巰基乙醇,0.5mg/mlcamp,各10iu/ml孕馬血清促性腺激素(pmsg)和人絨毛膜促性腺激素(hcg)補(bǔ)充，在潮濕的空氣中在38.7℃和5％co2持續(xù)約22個(gè)小時(shí)。接著，可以將所述卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到不含有camp,pmsg或hcg的新鮮的tcm-199成熟培養(yǎng)基中，并孵育另外22個(gè)小時(shí)?？梢酝ㄟ^(guò)在0.1％的透明質(zhì)酸酶中渦旋振蕩1分鐘將成熟的卵母細(xì)胞從它們的卵丘細(xì)胞剝離。

對(duì)于豬，成熟的卵母細(xì)胞可以在500μlminitubeporcproivfmediumsystem(minitube,verona,wi)中在minitube5孔受精皿中受精。在體外受精(ivf)的準(zhǔn)備中，可以將新鮮收集的或冷凍的公豬精液清洗，并在porcproivf培養(yǎng)基中重懸至4x105個(gè)精子。精子濃度可以使用計(jì)算機(jī)輔助精液測(cè)試(spermvision,minitube,verona,wi)分析。最后，體外授精可以在10μl體積中以終濃度為約40個(gè)能動(dòng)精子/卵母細(xì)胞進(jìn)行，這取決于公豬。將所有受精的卵母細(xì)胞在5.0％co2氣氛中在38.7℃孵育6小時(shí)。授精后六小時(shí)，推定的合子可以在ncsu-23中清洗兩次并移到0.5ml的相同培養(yǎng)基中。該系統(tǒng)通?？梢栽诖蠖鄶?shù)公豬間以10-30％的多精授精率(polyspermicinseminationrate)產(chǎn)生20-30％的胚泡。

可以將線(xiàn)性化的核酸構(gòu)建體注射到原核之一中。接著，可以將注射的卵轉(zhuǎn)移到受體雌性(例如到受體雌性的輸卵管中)并允許在所述受體雌性中發(fā)育以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。具體的，體外受精的胚胎可以在15,000xg離心5分鐘來(lái)沉淀脂質(zhì)，允許所述原核的可視化?？梢允褂胑ppendorffemtojet注射器注射所述胚胎并可以培養(yǎng)直到胚泡形成?？梢杂涗浥咛シ至训乃俾屎团吲菪纬梢约百|(zhì)量。

可以通過(guò)手術(shù)將胚胎轉(zhuǎn)移到異步(asynchronous)受體的子宮中。典型地，可以使用5.5英寸導(dǎo)管將100-200(例如，150-200)個(gè)胚胎沉積到輸卵管的壺腹部-峽部連接。手術(shù)后，可以進(jìn)行妊娠的實(shí)時(shí)超聲檢查。

在體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移中，可以將包括如上文所述的核酸構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因偶蹄動(dòng)物細(xì)胞(例如，轉(zhuǎn)基因豬細(xì)胞或牛細(xì)胞)例如胚胎卵裂球、胎兒成纖維細(xì)胞，成體耳成纖維細(xì)胞，或顆粒細(xì)胞導(dǎo)入無(wú)核的卵母細(xì)胞中來(lái)建立組合細(xì)胞?？梢匀缦聦⒙涯讣?xì)胞去核，即在極體附近的部分帶切開(kāi)(partialzonadissection)，然后在切開(kāi)區(qū)處壓出細(xì)胞質(zhì)。通常，使用具有鋒利的有斜面的尖端的注射移液管來(lái)將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞注射到阻滯于減數(shù)分裂2的去核卵母細(xì)胞中。在一些慣例中，阻滯于減數(shù)分裂2的卵母細(xì)胞稱(chēng)作“卵”。在生成豬或牛胚胎(例如通過(guò)融合并活化卵母細(xì)胞進(jìn)行)后，在活化后約20至24小時(shí)，將胚胎轉(zhuǎn)移至接受體雌性的輸卵管。參見(jiàn)例如cibelli等，science280,1256-1258,1998,以及美國(guó)專(zhuān)利第6,548,741號(hào)。對(duì)于豬，可以在轉(zhuǎn)移胚胎后約20-21天對(duì)接受體雌性檢查妊娠。

可以使用標(biāo)準(zhǔn)的育種技術(shù)來(lái)創(chuàng)建對(duì)于來(lái)自初始雜合建立者動(dòng)物的外源核酸方面純合的動(dòng)物。然而，可以不需要純合性。可以將本文中描述的轉(zhuǎn)基因豬與感興趣的其它豬育種。

在一些實(shí)施方式中，可以在分開(kāi)的轉(zhuǎn)座子上提供感興趣的核酸和可選擇標(biāo)志物并且以不相等的量對(duì)胚胎或細(xì)胞提供，其中含有可選擇標(biāo)志物的轉(zhuǎn)座子的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)(5-10倍過(guò)量)含有感興趣核酸的轉(zhuǎn)座子。可以基于可選擇標(biāo)志物的存在和表達(dá)分離表達(dá)感興趣核酸的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞或動(dòng)物。由于轉(zhuǎn)座子會(huì)以精確的且不相聯(lián)的方式(獨(dú)立轉(zhuǎn)座事件)整合入基因組中，感興趣的核酸和可選擇標(biāo)志物不是遺傳連鎖的，并且可以容易地經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)育種通過(guò)遺傳分離分開(kāi)。如此，可以生成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，其不受在后續(xù)世代中保留可選擇標(biāo)志物(即一個(gè)從公共安全性觀點(diǎn)看有些顧慮的問(wèn)題)約束。

一旦生成了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)評(píng)估外源核酸的表達(dá)?？梢酝ㄟ^(guò)southern印跡分析實(shí)現(xiàn)初始篩選以測(cè)定構(gòu)建體整合發(fā)生與否。關(guān)于southern分析的描述，參見(jiàn)sambrook等，1989,molecularcloning,alaboratorymanualsecondedition,coldspringharborpress,plainview；ny的9.37-9.52部分。也可以在初始篩選中使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)技術(shù)。pcr指擴(kuò)增靶核酸的規(guī)程或技術(shù)。一般地，采用來(lái)自感興趣區(qū)域末端或超出的序列信息來(lái)設(shè)計(jì)與要擴(kuò)增的模板的相反鏈在序列上相同或相似的寡核苷酸引物?？梢允褂胮cr從dna及rna擴(kuò)增特定序列，包括來(lái)自總基因組dna或總細(xì)胞rna的序列。引物的長(zhǎng)度通常是14至40個(gè)核苷酸，但是長(zhǎng)度范圍可以是10個(gè)核苷酸至幾百個(gè)核苷酸。pcr記載于例如pcrprimer：alaboratorymanual,ed.dieffenbachanddveksler,coldspringharborlaboratorypress,1995。也可以通過(guò)連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、鏈置換擴(kuò)增、自身維持的序列復(fù)制、或基于核酸序列的擴(kuò)增來(lái)擴(kuò)增核酸。參見(jiàn)例如lewisgeneticengineeringnews,12:1,1992；guatelli等，proc.natl.acad.sci.usa,87:1874,1990；和weissscience,254:1292,1991。在胚泡期，可逐個(gè)處理胚胎用于通過(guò)pcr、southern雜交和splinkerettepcr的分析(參見(jiàn)例如dupuy等，procnatlacadsciusa99:4495,2002)。

可以使用技術(shù)評(píng)估轉(zhuǎn)基因豬的組織中編碼多肽的核酸序列表達(dá)，所述技術(shù)包括例如對(duì)自動(dòng)物獲得的組織樣品的northern印跡分析、原位雜交分析、western分析、免疫測(cè)定法諸如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法、和逆轉(zhuǎn)錄酶pcr(rt-pcr)。

干擾rnas

各種干擾rna(rnai)是已知的。雙鏈rna(dsrna)誘導(dǎo)同源基因轉(zhuǎn)錄體的序列特異性降解。rna誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(risc)將dsrna代謝為小的21-23核苷酸的小干擾rnas(sirnas)。risc包含雙鏈rna酶(dsrn酶，如dicer)和ssrna酶(如，argonaut2或ago2)。risc利用反義鏈作為引導(dǎo)以找到切割靶物。sirna和microrna(mirnas)兩者都是已知的。在遺傳修飾的動(dòng)物中使基因失活的方法包括誘導(dǎo)針對(duì)靶基因和/或靶核酸的rna干擾，從而降低靶基因和/或靶核酸的表達(dá)。

例如，外源核酸序列可誘導(dǎo)針對(duì)編碼多肽的核酸序列的rna干擾。例如，與靶dna同源的雙鏈小干擾rna(sirna)或小發(fā)夾rna(shrna)可以用于降低該dna的表達(dá)?？梢陨捎糜趕irna的構(gòu)建體，例如fire等，nature,391:806,1998；romano和masinomolmicrobiol,6:3343,1992；cogoni等，emboj,15:3153,1996；cogoni和masinonature,399:166,1999；misquitta和patersonproc.natl.acad,sci.usa,96:1451,1999；以及kennerdell和carthewcell,95:1017,1998所描述的。可以通過(guò)mclntyre和fanningbmcbiotechnology,6:1,2006所描述的那樣產(chǎn)生shrna構(gòu)建體。一般來(lái)說(shuō)，shrna轉(zhuǎn)錄為含有互補(bǔ)區(qū)的單鏈rna分子，其可以退火并形成短的發(fā)夾。

找到單個(gè)的、個(gè)別的有功能的針對(duì)特定基因的sirna或mirna的概率是高的。例如，sirna的具體序列的預(yù)測(cè)率為約50％，但是多個(gè)干擾rna可以以它們之一將有效的良好信心制備。

實(shí)施方案包括體外細(xì)胞，體內(nèi)細(xì)胞，和經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物例如家畜動(dòng)物，其表達(dá)針對(duì)基因例如發(fā)育階段選擇性的基因的rnai。例如，所述rnai可以選自下組：sirna、shrna、dsrna、risc和mirna。

實(shí)施方案包括修飾為表達(dá)抑制一個(gè)或多個(gè)腫瘤抑制基因的rnai的動(dòng)物。

可誘導(dǎo)系統(tǒng)

可誘導(dǎo)系統(tǒng)可用于控制基因的表達(dá)。已知各種允許在時(shí)空上控制基因表達(dá)的可誘導(dǎo)系統(tǒng)。數(shù)個(gè)已被證明在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)是有功能的。術(shù)語(yǔ)可誘導(dǎo)系統(tǒng)包括傳統(tǒng)的啟動(dòng)子和可誘導(dǎo)基因表達(dá)元件。

實(shí)施方案包括修飾為可誘導(dǎo)控制一個(gè)或多個(gè)腫瘤抑制基因的動(dòng)物。所述控制可以是正向或負(fù)向的，以打開(kāi)或關(guān)閉。

誘導(dǎo)型系統(tǒng)的例子是四環(huán)素(tet)-開(kāi)啟啟動(dòng)子系統(tǒng)，其可以用于調(diào)節(jié)核酸的轉(zhuǎn)錄。在此系統(tǒng)中，突變的tet阻抑物(tetr)與單純皰疹病毒vp16反式激活物蛋白的激活域融合以創(chuàng)建四環(huán)素控制的轉(zhuǎn)錄激活物(tta)，其受到tet或多西環(huán)素(doxycycline，dox)調(diào)節(jié)。在缺乏抗生素的情況中，轉(zhuǎn)錄是最小程度的，而在存在tet或dox的情況中，轉(zhuǎn)錄得到誘導(dǎo)。備選的誘導(dǎo)型系統(tǒng)包括蛻皮激素或雷怕霉素(rapamycin)系統(tǒng)。蛻皮激素是一種昆蟲(chóng)蛻皮激素，其生成受到蛻皮激素受體和超氣門(mén)蛋白(ultraspiracle)基因(usp)產(chǎn)物的異二聚體控制。通過(guò)用蛻皮激素或蛻皮激素類(lèi)似物諸如muristeronea處理誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)動(dòng)物施用以觸發(fā)誘導(dǎo)型系統(tǒng)的藥劑稱(chēng)為誘導(dǎo)劑。

四環(huán)素誘導(dǎo)型系統(tǒng)和cre/loxp重組酶系統(tǒng)(組成型的或誘導(dǎo)的)是更為常用的誘導(dǎo)系統(tǒng)。四環(huán)素誘導(dǎo)型系統(tǒng)包括四環(huán)素控制的反式激活子(tta)/反向tta(rtta)。在體內(nèi)使用這些系統(tǒng)的方法包括產(chǎn)生兩個(gè)遺傳修飾的動(dòng)物品系。一個(gè)動(dòng)物品系在選擇的啟動(dòng)子的控制下表達(dá)激活子(tta、rtta或cre重組酶)。另一組轉(zhuǎn)基因動(dòng)物表達(dá)接納體(acceptor)，其中感興趣的基因(或要修飾的基因)的表達(dá)在tta/rtta反式激活子的靶基因的控制下(或側(cè)翼為loxp序列)。將兩個(gè)品系的小鼠相交配提供了基因表達(dá)的控制。

四環(huán)素依賴(lài)的調(diào)控系統(tǒng)(tet系統(tǒng))依賴(lài)兩個(gè)組分，即四環(huán)素控制的反式激活子(tta或rtta)和以四環(huán)素依賴(lài)方式控制下游cdna表達(dá)的tta/rtta依賴(lài)的啟動(dòng)子。在缺乏四環(huán)素或其衍生物(如多西環(huán)素)的情況下，tta結(jié)合到teto序列上，允許tta依賴(lài)的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄激活。然而，當(dāng)存在多西環(huán)素時(shí)，tta不能與其靶物相互作用且不發(fā)生轉(zhuǎn)錄。使用tta的系統(tǒng)被稱(chēng)為tet-off，因?yàn)樗沫h(huán)素或多西環(huán)素允許轉(zhuǎn)錄下調(diào)。四環(huán)素或其衍生物的施用允許暫時(shí)控制體內(nèi)轉(zhuǎn)基因表達(dá)。rtta是tta的變體，其在缺乏多西環(huán)素時(shí)是無(wú)功能的，但需要配體存在用于反式激活。因此這種系統(tǒng)被稱(chēng)為tet-on。已在體內(nèi)將tet系統(tǒng)用于如編碼報(bào)告基因、原癌基因，或參與信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)的蛋白的數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)基因的可誘導(dǎo)表達(dá)。

cre/lox系統(tǒng)使用cre重組酶，其通過(guò)在兩個(gè)遠(yuǎn)端(distant)的cre識(shí)別序列，即loxp位點(diǎn)間發(fā)生交換而催化位點(diǎn)特異性重組。導(dǎo)入到兩個(gè)loxp序列間的dna序列(稱(chēng)為敲入(floxed)dna)被cre介導(dǎo)的重組所切除。使用空間控制(帶有組織或細(xì)胞特異性啟動(dòng)子)或時(shí)間控制(帶有可誘導(dǎo)系統(tǒng))在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中控制cre的表達(dá)導(dǎo)致對(duì)兩loxp位點(diǎn)間dna切除的控制。一種應(yīng)用是條件性基因失活(條件性敲除)。另一種方法用于蛋白過(guò)表達(dá)，其中將敲入的終止子密碼子插入到啟動(dòng)子序列和感興趣的dna之間。遺傳修飾的動(dòng)物不表達(dá)轉(zhuǎn)基因，直到表達(dá)cre，導(dǎo)致切除敲入的終止子密碼子。這一系統(tǒng)已經(jīng)應(yīng)用于b淋巴細(xì)胞中組織特異性腫瘤發(fā)生和受控的抗原受體的表達(dá)。還開(kāi)發(fā)了可誘導(dǎo)的cre重組酶。僅通過(guò)施用外源配體活化可誘導(dǎo)的cre重組酶。可誘導(dǎo)的cre重組酶是融合蛋白，其含有原來(lái)的cre重組酶和特異的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。cre重組酶的功能活性依賴(lài)于能夠結(jié)合到融合蛋白中該特異性結(jié)構(gòu)域的外部配體。

實(shí)施方案包括體外細(xì)胞、體內(nèi)細(xì)胞和經(jīng)遺傳修飾的動(dòng)物例如家畜動(dòng)物，其包含受控于誘導(dǎo)系統(tǒng)的基因。動(dòng)物的遺傳修飾可以是基因組的或嵌合的。所述可誘導(dǎo)系統(tǒng)例如可以是例如選自下組：tet-on、tet-off、cre-lox和hif1alpha。實(shí)施方案是本文所列出的基因。

顯性陰性(dominantnegatives)

因此，不僅可以通過(guò)去除或rnai抑制還可以通過(guò)創(chuàng)建/表達(dá)蛋白的顯性陰性變體來(lái)破壞基因，所述顯性陰性變體對(duì)該基因產(chǎn)物的正常功能具有抑制效果。顯性陰性(dn)基因的表達(dá)可以導(dǎo)致改變的表型，其通過(guò)以下施加：a)滴定效應(yīng)(titrationeffect)；dn被動(dòng)地與內(nèi)源基因產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)協(xié)同因子或所述內(nèi)源基因的正常靶標(biāo)而不發(fā)揮相同的活性，b)毒丸(poisonpill)(或活動(dòng)扳手(monkeywrench))效應(yīng)，其中所述顯性陰性基因產(chǎn)物主動(dòng)地干擾正常基因功能所需的過(guò)程，c)反饋效應(yīng)，其中dn主動(dòng)地刺激對(duì)所述基因功能的負(fù)調(diào)控因子?？梢灾苽滹@性陰性體以阻礙腫瘤抑制基因。

建立者動(dòng)物、動(dòng)物系、性狀和繁殖

可通過(guò)克隆和其它本文中描述的方法生產(chǎn)建立者動(dòng)物。建立者動(dòng)物可以是遺傳修飾上純合的，如在合子或原代細(xì)胞經(jīng)歷純合修飾的情況中。類(lèi)似地，也可產(chǎn)生雜合的建立者。建立者可以是基因組修飾的，這意味著所有細(xì)胞在它們的基因組中都經(jīng)歷修飾。建立者可以是修飾上嵌合的，如可發(fā)生在當(dāng)將載體導(dǎo)入胚胎的多個(gè)細(xì)胞之一中時(shí)，通常在胚泡期?？蓹z測(cè)嵌合動(dòng)物的后代以鑒定基因組修飾的后代。當(dāng)已經(jīng)創(chuàng)建了可以通過(guò)有性繁殖或通過(guò)輔助生殖技術(shù)繁殖的動(dòng)物池時(shí)建立動(dòng)物系，其中雜合或純合后代一致性表達(dá)修飾。

重組酶

本發(fā)明的實(shí)施方案包括將靶向性核酸酶系統(tǒng)與重組酶(例如reca蛋白，rad51)或其它與dna重組相關(guān)的dna結(jié)合蛋白一同施用。重組酶與核酸片段形成細(xì)絲，并實(shí)際上搜索細(xì)胞dna來(lái)尋找與序列基本同源的dna序列。例如，重組酶可以與充當(dāng)hdr模板的核酸序列組合。接著，重組酶與hdr模板組合以形成細(xì)絲并置入細(xì)胞中。重組酶和/或與重組酶組合的hdr模板可以作為蛋白、mrna，或與編碼重組酶的載體置于細(xì)胞或胚胎中。美國(guó)公開(kāi)文本2011/0059160(美國(guó)系列號(hào)12/869,232)的公開(kāi)內(nèi)容通過(guò)提述特此并入本文中用于所有目的；在沖突的情況下，以本說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)。術(shù)語(yǔ)重組酶指代遺傳重組酶，其在細(xì)胞中酶促催化兩條相對(duì)較長(zhǎng)的dna鏈之間相對(duì)短的dna部分的連接。重組酶包括cre重組酶，hin重組酶、reca、rad51、cre，以及flp。cre重組酶是來(lái)自pi噬菌體的i型拓?fù)洚悩?gòu)酶，其催化loxp位點(diǎn)之間的dna的位點(diǎn)特異性重組。hin重組酶是由198個(gè)氨基酸組成的21kd蛋白，其存在于細(xì)菌沙門(mén)氏菌屬(salmonella)中。hin屬于dna轉(zhuǎn)化酶的絲氨酸重組酶家族，其中它依賴(lài)于活性位點(diǎn)絲氨酸來(lái)啟動(dòng)dna切割和重組。rad51是人類(lèi)基因。由該基因編碼的蛋白是rad51蛋白家族的成員，其輔助dna雙鏈斷裂的修復(fù)。rad51家族成員與細(xì)菌reca和酵母rad51同源。cre重組酶是實(shí)驗(yàn)中用來(lái)刪除側(cè)翼有l(wèi)oxp位點(diǎn)的特定序列的酶。flp指代衍生于面包酵母釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)的2μ質(zhì)粒的flippase重組酶(flp或flp)。

本文中，“reca”或“reca蛋白”指代reca樣重組蛋白家族，其具有基本上全部或大部分相同的功能，特別是：(i)將寡核苷酸或多核苷酸正確定位到其同源靶物上以用于通過(guò)dna聚合酶的后續(xù)延伸的能力；(ii)在拓?fù)鋵W(xué)上制備雙鏈體核酸以合成dna的能力；和(iii)reca/寡核苷酸或reca/多核苷酸復(fù)合物高效尋找并結(jié)合互補(bǔ)序列的能力。表征得最好的reca蛋白來(lái)自于大腸桿菌；除了蛋白的最初等位形式外，已鑒定了許多突變體reca樣蛋白，例如reca803。此外，許多生物體具有reca樣鏈轉(zhuǎn)移蛋白，包括例如酵母、果蠅(drosophila)、哺乳動(dòng)物(包括人)，以及植物。這些蛋白包括例如ree1、rec2、rad51、rad51b、rad51c、rad51d、rad51e、xrcc2以及dmc1。重組蛋白的一個(gè)實(shí)施方案是大腸桿菌的reca蛋白?；蛘撸瑀eca蛋白可以是大腸桿菌的突變體reca-803蛋白，來(lái)自另一種細(xì)菌來(lái)源的rec蛋白，或來(lái)自另一種生物體的同源重組蛋白。

組合物和試劑盒

本發(fā)明還提供組合物和試劑盒，其含有例如編碼位點(diǎn)特異性核酸內(nèi)切核酸酶、crispr、cas9、znfs、talens、rec-gal4融合物的核酸分子，它們的多肽，含有這些核酸分子或多肽的組合物，或工程化的細(xì)胞系。還可以提供對(duì)于指示的等位基因漸滲有效的hdr。此類(lèi)物品可以用作例如研究工具或在治療上使用。

實(shí)施例

實(shí)施例1：鑒定豬和人nf1基因之間的保守區(qū)域以選擇靶位點(diǎn)

nf1患者在整個(gè)腫瘤抑制基因神經(jīng)纖維瘤蛋白(nf1)中顯示多種突變。無(wú)義突變(r1947x)已被鑒定為nf1患者中最常見(jiàn)的改變，占所有nf1突變的1至2個(gè)百分點(diǎn)[1]。r1947發(fā)現(xiàn)于豬的外顯子42中，該外顯子42與人中的外顯子40高度保守，因此我們選擇將人中通常發(fā)現(xiàn)的r1947x突變工程改造到豬基因組中，以創(chuàng)建nf1的大型動(dòng)物模型。圖1是人和豬的nf1基因和蛋白質(zhì)的比對(duì)。

實(shí)施例2：設(shè)計(jì)talen以工程改造豬nf1基因中的雜合r1947x突變

我們選擇在豬中通過(guò)以下來(lái)模擬人nf1r1947x突變：tal效應(yīng)器核酸酶(talen)介導(dǎo)的同源性依賴(lài)性修復(fù)(hdr)，其使用靶向豬基因組中nf1基因的外顯子42(對(duì)應(yīng)于人基因組中的外顯子40)的talen對(duì)，以及hdr構(gòu)建體來(lái)引入終止密碼子、移碼，和新型限制酶位點(diǎn)，允許通過(guò)限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(rflp)分析來(lái)快速分析克隆(圖2和3a)。除了改變talen結(jié)合位點(diǎn)并防止talen重新切割的新型rflp位點(diǎn)之外，將三個(gè)nf1talen與設(shè)計(jì)為誘導(dǎo)r1947x突變的hdr寡聚物一并轉(zhuǎn)染入ossabaw豬原代成纖維細(xì)胞中(圖2和3a)。30℃下溫育3天后，通過(guò)rflp分析來(lái)對(duì)細(xì)胞群分析每個(gè)talen誘導(dǎo)hdr的能力(圖3b)。該分析顯示，所有三個(gè)talen在不同比率時(shí)是有活性的(圖3b)。在用talen和hdr構(gòu)建體處理后，將克隆經(jīng)歷(rflp)分析以鑒定修飾的等位基因以及以獲得雜合nf1敲除克隆(圖3c)。對(duì)每個(gè)通過(guò)rflp得到的雜合克隆測(cè)序以確認(rèn)野生型和hdr等位基因兩者的存在，并且可被用于染色質(zhì)轉(zhuǎn)移克隆技術(shù)以產(chǎn)生nf^r1947/+豬(圖3d)。

實(shí)施例3：talen活性與分離腫瘤抑制基因上雜合的克隆的能力相關(guān)

存在兩個(gè)拷貝的腫瘤抑制基因的喪失的選擇優(yōu)勢(shì)，因此需要新技術(shù)用于分離nf1雜合克隆。由于talenssnf142.2相較于ssnf142.1(54.2％)和ssnf142.3(27.2％)(我們預(yù)測(cè)其可能分別具有過(guò)高或過(guò)低的活性)的中間活性(45.1％)，我們選擇talenssnf142.2用于創(chuàng)建nf1r1947x雜合克隆的努力。當(dāng)用ssnf142.2處理細(xì)胞時(shí)，通過(guò)rflp，41/89(46.1％)的克隆顯示出對(duì)nf1r1947x是雜合的(圖4a)。有趣的是，41.6％的回收的克隆顯示為純合的ko，比預(yù)測(cè)的比率(20.3％,參見(jiàn)等式的圖例)高得多的比率，這表明存在丟失兩個(gè)nf1等位基因的選擇壓力(圖4a)。丟失兩個(gè)拷貝nf1的此選擇壓力來(lái)自這一事實(shí)，即nf1是腫瘤抑制基因，因此具有純合丟失的細(xì)胞可能比nf1的野生型或雜合的細(xì)胞具有生長(zhǎng)和/或存活優(yōu)勢(shì)。topo克隆和測(cè)序分析后，僅1/10(10％)的分離自ssnf142.3talen處理的細(xì)胞的克隆對(duì)hdr等位基因和野生型等位基因二者是雜合的(圖4c)。9/10克隆(90％)對(duì)hdr等位基因是雜合的，并顯示出在野生型等位基因中的小的插入或缺失(插入/缺失(indels))(圖4c)。我們假設(shè)在野生型等位基因中看到的插入/缺失可能是由于過(guò)量的talen活性和兩個(gè)拷貝基因都為非功能性的選擇性?xún)?yōu)勢(shì)兩者，因此我們實(shí)施了ssnf142.3，一個(gè)根據(jù)rflp評(píng)估僅具有27.2％活性的talen(圖3b)。與ssnf142.2相比，通過(guò)rflp，ssnf142.3導(dǎo)致更少的顯示出雜合的克隆數(shù)目(35/91克隆,38.5％)，但是野生型、雜合子和純合子的比率與預(yù)期的非常相似(圖4b)。當(dāng)將這些克隆進(jìn)行topo克隆并且對(duì)每個(gè)等位基因測(cè)序后，發(fā)現(xiàn)僅3/10的克隆(30％)對(duì)于hdr等位基因是雜合的，并且在野生型等位基因中顯示出小的插入/缺失，而7/10(70％)的克隆對(duì)于hdr等位基因和野生型等位基因二者是雜合的(圖4c)。這些實(shí)驗(yàn)顯示出對(duì)于腫瘤抑制基因的純合敲除存在選擇優(yōu)勢(shì)，以及具有高活性的talen將可能通過(guò)hdr或者插入/缺失在兩個(gè)等位基因中顯示出修飾?？梢酝ㄟ^(guò)使用具有較低活性的talen(如nf1展示的那樣)來(lái)克服該挑戰(zhàn)(圖4c)。

實(shí)施例4：野生型夾(clamp)法

另一種解決創(chuàng)建腫瘤抑制基因上雜合敲除的細(xì)胞的技術(shù)挑戰(zhàn)的方法是同時(shí)使用兩個(gè)hdr寡聚物來(lái)分別修飾基因的每個(gè)等位基因，該方法稱(chēng)為“野生型夾”。一個(gè)hdr寡聚物將誘導(dǎo)ko等位基因，并且另一個(gè)將在阻止再切割和后續(xù)的插入/缺失的同時(shí)維持野生型等位基因(表1)?；趤?lái)自實(shí)施例1的結(jié)果，很明顯，高活性的talen具有切割基因的兩個(gè)等位基因的傾向。由于當(dāng)hdr發(fā)生時(shí)talen結(jié)合位點(diǎn)中的變化，設(shè)計(jì)為針對(duì)nf1的hdr寡聚物防止了hdr修飾的等位基因的再切割(圖2a)。應(yīng)當(dāng)指出，還應(yīng)當(dāng)通過(guò)誘導(dǎo)間隔物長(zhǎng)度(spacerlengths)中的變化來(lái)阻止再切割，盡管對(duì)于nf1，沒(méi)有采取該方法。在實(shí)施例1中，ssnf142.2是一個(gè)高活性的talen，其導(dǎo)致以低于預(yù)期的比率的雜合克隆的回收(圖4)。此外，野生型等位基因的再切割導(dǎo)致大比率的含有插入/缺失的克隆(90％)(圖4)。雖然使用具有減弱活性的talen(如ssnf142.3)可以幫助克服該問(wèn)題并導(dǎo)致在野生型等位基因上沒(méi)有插入/缺失的更高產(chǎn)率的雜合克隆(70％)，但是具有減弱活性的talen產(chǎn)生較少的通過(guò)rflp為雜合的克隆來(lái)開(kāi)始，使得腫瘤抑制基因雜合的克隆的回收在技術(shù)上有挑戰(zhàn)(圖4c)。此外，沒(méi)有選擇具有rflp等位基因的雜合子與未修飾的野生型等位基因的方法，因此所有克隆必須進(jìn)行topo克隆并測(cè)序，這是耗時(shí)且費(fèi)力(resource-heavy)的方法。

表1：設(shè)計(jì)用于野生型夾法的hdr寡聚物

為了克服該挑戰(zhàn)，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種新的方法，其中可以通過(guò)如下來(lái)阻止野生型等位基因的再切割：實(shí)施第二個(gè)hdr寡聚物，其將沉默核苷酸變化放置到第二個(gè)等位基因中，阻止了再切割和后續(xù)的插入/缺失，并為更有效篩選克隆以鑒定雜合子創(chuàng)建新的限制酶位點(diǎn)。表1提供了演示該方法的實(shí)例。

野生型夾法利用了talen是高特異性和模塊化(modular)的事實(shí)，所述talen含有一個(gè)結(jié)合靶序列的單個(gè)核苷酸的rvd。通過(guò)經(jīng)由改變hdr中每個(gè)密碼子的搖擺堿基來(lái)制備沉默突變，我們可以阻止talen在hdr發(fā)生后與該基因座的再結(jié)合，阻止hdr野生型等位基因中的插入/缺失。此外，通過(guò)工程化改變特定沉默堿基對(duì)，所得的hdr野生型等位基因現(xiàn)在將含有新的限制酶位點(diǎn)(在這種情況下是bceai)，這將允許我們使用rflp有效地篩選我們的集落。應(yīng)當(dāng)注意，使用豬密碼子選擇數(shù)據(jù)庫(kù)制備了沉默堿基對(duì)變化，以使用每個(gè)氨基酸在相似的水平上使用的密碼子。在應(yīng)用該方法中，我們將簡(jiǎn)單地篩選出具有用hindiii切割的等位基因(代表r1947xhdr等位基因)以及用bcea1切割的等位基因(代表hdr野生型等位基因)的集落。該野生型夾法允許更為有效地分離出腫瘤抑制基因(如nf1)上雜合的集落。

實(shí)施例5：將野生型夾法應(yīng)用到多個(gè)基因

在癌癥中，常常必需誘導(dǎo)多個(gè)突變。在nf1的情況下，兩個(gè)腫瘤抑制基因通常牽涉疾病進(jìn)展，nf1和tp53在相同染色體上極其接近(連鎖)。因此，發(fā)明人設(shè)計(jì)出順式敲除nf1和tp53(兩個(gè)腫瘤抑制基因)的實(shí)驗(yàn)以使動(dòng)物易患見(jiàn)于nf1患者中的惡性腫瘤，這包括惡性周?chē)窠?jīng)鞘瘤(mpnsts)。常見(jiàn)的現(xiàn)象是：這些基因以順式雜合突變，并經(jīng)歷雜合性丟失，導(dǎo)致nf1和tp53兩者無(wú)效的細(xì)胞[4-6]。該遺傳變化驅(qū)動(dòng)多種類(lèi)型的惡性腫瘤的腫瘤發(fā)生，并且在動(dòng)物模型中工程改造該變化對(duì)理解該疾病是至關(guān)重要的[4-6]。由于在靶位點(diǎn)之間創(chuàng)建大缺失的傾向，順式多基因編輯是非常具有挑戰(zhàn)的。我們之前已經(jīng)展示了以10.3％的比率發(fā)生在ssdmd基因座上的大缺失的發(fā)生[7]。這個(gè)實(shí)施例進(jìn)一步被兩個(gè)靶定基因都是腫瘤抑制基因的這一事實(shí)所困惑，因此需要避免腫瘤抑制基因的純合丟失的新方法，和避免通過(guò)在染色體上兩個(gè)相互鄰近位置中的dna切割帶來(lái)的大缺失的策略。

使用如上所述的類(lèi)似方法進(jìn)行開(kāi)發(fā)并測(cè)試針對(duì)豬tp53基因(sstp53e6)的talen和hdr寡聚物，該基因在染色體12上與nf1基因連鎖(圖5)[7]。在tp53的常見(jiàn)突變的外顯子6中引入無(wú)義突變的talen和hdr寡聚物以17％的效率工作[7]。當(dāng)使用多重方法以創(chuàng)建具有nf1和tp53突變兩者的成纖維細(xì)胞系時(shí)，ssnf142.3以25.5％的比率誘導(dǎo)hdr并且sstp53e6以11.8％的比率切割(圖6a)。使用多重方法，其中將ssnf142.3和sstp53e6二者與它們各自的hdr寡聚物轉(zhuǎn)染入ossabaw細(xì)胞中，我們以3.7％(7/190個(gè)克隆)的比率回復(fù)了nf1^-/+；tp53^-/+克隆(圖6b)。因?yàn)閟stp53e6經(jīng)常不能誘導(dǎo)hdr，而仍以高得足以誘導(dǎo)插入/缺失的比率切割；我們進(jìn)行高限定熔解分析以確定在缺少hdr的情況下任何tp53等位基因是否雜合地含有插入/缺失。對(duì)于這兩個(gè)基因上潛在雜合的總共17個(gè)克隆，我們鑒定出10個(gè)根據(jù)rflp在nf1上雜合且根據(jù)高限定熔解分析在tp53上雜合的克隆(參見(jiàn)材料和方法)。我們測(cè)序了所有17個(gè)對(duì)于這兩種基因雜合的克隆，并發(fā)現(xiàn)6/17nf1雜合子在野生型等位基因中含有插入/缺失，2/17tp53雜合子在野生型等位基因中含有插入/缺失，并且通過(guò)高限定熔解分析鑒定的7/10tp53雜合子在事實(shí)上為野生型。總共，通過(guò)rflp，17/190(8.9％)的克隆對(duì)nf1是雜合的；通過(guò)rflp，7/190(3.7％)的克隆對(duì)nf1和tp53兩者是雜合的；17/17的克隆含有在nf1或tp53或兩者的野生型等位基因上的插入/缺失。這導(dǎo)致了沒(méi)有克隆對(duì)于nf1和tp53兩者是雜合的。

為了克服分離nf1和tp53兩者上雜合的克隆的挑戰(zhàn)，我們提出以下方法：

通過(guò)在轉(zhuǎn)染反應(yīng)中使用較少的talenmrna或設(shè)計(jì)具有減弱的活性的talen來(lái)減少talen的活性。

1.通過(guò)減少在30℃時(shí)的時(shí)間來(lái)避免再切割。

2.為野生型等位基因設(shè)計(jì)阻止再切割和后續(xù)插入/缺失，并允許通過(guò)rflp有效篩選野生型等位基因的hdr寡聚物(描述于實(shí)施例4)。

一旦鑒定出對(duì)于nf1和tp53兩者雜合的克隆，將通過(guò)輻射雜種定位(radiationhybridmapping)完成順式發(fā)生nf1和tp53突變的克隆鑒定，如前所述的[8]。

材料和方法

talen設(shè)計(jì)

使用在線(xiàn)工具“taleffectornucleotidetargeter2.0”鑒定候選talen靶dna序列和rvd序列，如前所述[9]。在神經(jīng)纖維瘤蛋白(nf1)基因的野豬外顯子42(其對(duì)應(yīng)于nf1基因的智人外顯子40)(其中精氨酸1947(r1947)定位于此)中選擇talen靶dna序列。輸入dna序列是r1947的上游和下游的45堿基對(duì)。選擇r1947x無(wú)義突變來(lái)突變，因?yàn)槠涫窃?型神經(jīng)纖維瘤病(nf1)患者中觀察到的最頻繁的改變[10]。在野豬外顯子6中設(shè)計(jì)了設(shè)計(jì)為靶向tp53基因的talen以誘導(dǎo)y155x突變[11]。表2提供了設(shè)計(jì)的talen的列表：

表2：

供體修復(fù)模板設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)了同源性依賴(lài)性修復(fù)(hdr)寡聚物以在nf1基因中工程化改造r1947x突變。該hdr寡聚物含有與野豬nf1外顯子42同源的82堿基對(duì)序列；導(dǎo)致r→x氨基酸變化的c→t突變，以及新的hindiii限制酶位點(diǎn)(aagctt)，其允許在克隆上實(shí)施靈活的限制性長(zhǎng)度多態(tài)性(rflp)測(cè)定以確定是否同源重組已實(shí)際發(fā)生。設(shè)計(jì)了hdr寡聚物以工程化改造tp53基因中的y155x突變。該hdr寡聚物含有與野豬tp53外顯子6同源的83堿基對(duì)序列，talen結(jié)合位點(diǎn)側(cè)翼的兩個(gè)堿基對(duì)的改變，導(dǎo)致y→x氨基酸變化的c→t突變，以及新的hindiii限制酶位點(diǎn)(aagctt)，其允許在克隆上實(shí)施rflp測(cè)定以確定是否同源重組已實(shí)際發(fā)生。通過(guò)integrateddnatechnologies來(lái)合成這些90mer寡核苷酸模板，100nmol合成，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)脫鹽純化，并且重懸于400umtris-edta中。所設(shè)計(jì)的hdr寡聚物示于以下表3中，其中加粗字體代表自野生型(wt)序列的變化，并且大寫(xiě)字母表示構(gòu)成限制性位點(diǎn)的導(dǎo)入的殘基。

表3：為修復(fù)模板設(shè)計(jì)的hdr寡聚物

talen生產(chǎn)

如前所述[9]生產(chǎn)talen。通過(guò)遵循goldengateassembly方案，使用rciscript-goldytalen(addgeneid38143)作為最終目的載體來(lái)構(gòu)建質(zhì)粒[12]。使用qiaprepspinminiprep試劑盒(qiagen)制備裝配的rciscript載體，通過(guò)saci線(xiàn)性化，并用作使用mmessaget3試劑盒(ambion)進(jìn)行體外talenmrna轉(zhuǎn)錄的模板。

組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

于37℃或30℃(如指示)于5％co2在補(bǔ)充有10％胎牛血清、100i.u./ml青霉素和鏈霉素、2mml-谷氨酰胺、10mmhepes、5ug/ml脫鐵-轉(zhuǎn)鐵蛋白(apo-transferrin)、25ng/ulrhegf，和20ng/ulrhig的dmem中維持豬成纖維細(xì)胞。使用neon轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(lifetechnologies)遞送talen和hdr寡聚物。將在70-100％匯合的低傳代ossabaw、長(zhǎng)白豬成纖維細(xì)胞以1:2分開(kāi)，并且次日在70-80％匯合時(shí)收獲。將約600,000個(gè)細(xì)胞與mrnatalen和hdr寡聚物重懸于“r”緩沖液(lifetechnologies)中，并且在100μl尖端通過(guò)下述參數(shù)電穿孔：輸入電壓；1800v；脈沖寬度；20ms；和脈沖數(shù)目；每次轉(zhuǎn)染中包含0.5-2ug的talenmrna和0.1-0.4nmol針對(duì)感興趣的特定基因的hdr寡聚物。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在30℃下培養(yǎng)2或3天，并且然后分析基因編輯效率并且鋪板得到集落。

克隆衍生(clonederivation)

轉(zhuǎn)染后2或3天，將50至250個(gè)細(xì)胞接種到10cm皿上，并且培養(yǎng)到個(gè)體集落達(dá)到直徑約5mm。添加8ml的tryple和dmem培養(yǎng)基(lifetechnologies)1:4(vol/vol)混合物并且吸出集落，轉(zhuǎn)移至48孔皿和重復(fù)(replica)96孔皿的孔中，并且在相同的條件下培養(yǎng)。收集達(dá)到匯合的集落用于冷凍保存以及用于基因型分型的樣品制備。

冷凍保存

通過(guò)旋轉(zhuǎn)沉降細(xì)胞并重懸于冷凍保存培養(yǎng)基中來(lái)制備用于冷凍保存的樣品，所述培養(yǎng)基由以下組成：90％胎牛血清(atlas)和10％二甲基亞砜(sigma)。最初將樣品冷凍降至-80℃4小時(shí)，然后轉(zhuǎn)移至液氮中用于長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

樣品制備

從6孔皿的孔收集第3天經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞群體，并且在20μl下述1xpcr相容性裂解緩沖液中重懸約10％：10mmtris-clph8.0，2mmedta，0.45％trytonx-100(vol/vol)，0.45％tween-20(vol/vol)，新鮮補(bǔ)充有200μg/ml蛋白酶k。使用下述程序在熱循環(huán)儀中處理裂解物：55℃60分鐘，95℃15分鐘。使用20-30μl裂解緩沖液如上文處理來(lái)自稀釋克隆的集落樣品。

surveyor突變檢測(cè)和rflp分析

使用鉑taqdna聚合酶hifi(lifetechnologies)用1μl細(xì)胞裂解物根據(jù)制造商的推薦進(jìn)行在意圖位點(diǎn)側(cè)翼的pcr。針對(duì)每個(gè)位點(diǎn)的引物列于表4中。用surveyor突變檢測(cè)試劑盒(transgenomic)根據(jù)制造商的推薦使用10ulpcr產(chǎn)物分析群體中的突變頻率，如上文描述。使用表5中指定的限制酶對(duì)10μl上述pcr反應(yīng)進(jìn)行rflp分析。在10％tbe聚丙烯酰胺凝膠上解析surveyor和rflp反應(yīng)，并且通過(guò)溴化乙啶染色顯現(xiàn)。使用imagej進(jìn)行條帶的密度測(cè)定測(cè)量；并且計(jì)算surveyor反應(yīng)的突變率，如前記載[13]。經(jīng)由用rflp片段的總和強(qiáng)度除以親本條帶+rflp片段的總和強(qiáng)度計(jì)算百分比hdr。類(lèi)似地處理集落的rflp分析，只是用1xaccustartiigeltracksupermix(quantabiosciences)擴(kuò)增pcr產(chǎn)物并在2.5％瓊脂糖凝膠上解析。

表4：用于突變檢測(cè)的引物

表5：用于hdr檢測(cè)的限制酶

高限定熔解分析

使用以下進(jìn)行高限定熔解分析：1:10稀釋的2ul細(xì)胞裂解液(如上所述)，2um高限定熔解引物(表6)，1xprecisionmeltsupermix(biorad)。在bioradcfxconnect機(jī)器中使用退火溫度55℃和40循環(huán)的2步驟方案運(yùn)行反應(yīng)。使用biorad’scfxmanager高限定熔解分析來(lái)分析熔解曲線(xiàn)。通過(guò)圖7中顯示的特征曲線(xiàn)來(lái)鑒定雜合克隆。

表6：用于高限定熔解分析的引物

擴(kuò)增子測(cè)序和分析

從轉(zhuǎn)染的群體中分離dna并通過(guò)1xaccustartiigeltracksupermix(quantabiosciences)克隆和擴(kuò)增。在使用minelutepcr純化試劑盒(qiagen)對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行清潔(cleanup)之前，將pcr產(chǎn)物的一部分在2.5％瓊脂糖凝膠上解析以確認(rèn)大小。將樣本提交到明尼蘇達(dá)大學(xué)基因組學(xué)中心，使用標(biāo)準(zhǔn)sanger測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序。對(duì)于其中等位基因是雜合的樣本，將新鮮的pcr產(chǎn)物用topo-ta克隆入pcr4(lifetechnologies)，并且個(gè)體topo克隆被用作第二pcr反應(yīng)的模板，以在使用minelutepcr純化試劑盒(qiagen)對(duì)pcr產(chǎn)物進(jìn)行清潔(cleanup)之前擴(kuò)增感興趣的區(qū)域。

實(shí)施例6：生產(chǎn)顯示ras超活性的nf1雜合豬

對(duì)雄性長(zhǎng)白豬細(xì)胞進(jìn)行3輪體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，所述細(xì)胞對(duì)nf1基因中r1947x突變是雜合的。從3輪克隆和胚胎轉(zhuǎn)移中，建立了一次妊娠，其中出生4頭仔豬--兩頭胎死腹中、一頭在2天齡時(shí)死亡、一頭在93天齡時(shí)死亡，圖8a。令人驚訝地，在長(zhǎng)白豬遺傳背景中沒(méi)有觀察到nf1相關(guān)表型。隨后，對(duì)雄性ossabaw迷你豬細(xì)胞進(jìn)行3輪體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移，所述細(xì)胞對(duì)nf1基因中r1947x突變是雜合的。從3輪克隆和胚胎轉(zhuǎn)移中，建立了兩次妊娠，并且出生共8頭仔豬(3頭來(lái)自一窩，并且5頭來(lái)自另一窩)，圖9a。三頭仔豬在1、5和24天死亡。多個(gè)動(dòng)物顯示出牛奶咖啡斑和潛在的脊柱側(cè)凸體征，圖9a-d。五頭nf1r1947x/+ossabaw迷你豬仍活著。

使用活性ras下拉試劑盒(thermofisher)定量活性ras(ras-gtp)，其中用栓在谷胱甘肽瓊脂糖樹(shù)脂上的gst-raf1ras結(jié)合結(jié)構(gòu)域下拉gtp結(jié)合的ras。血清刺激前，將細(xì)胞經(jīng)血清饑餓12小時(shí)，并且血清刺激后0、5，和15分鐘以及基礎(chǔ)血清刺激(未血清饑餓)時(shí)收集細(xì)胞裂解物。血清饑餓后5min，nf1野生型(wt)和nf1雜合(r1947x/+)細(xì)胞顯示出ras-gtp水平的峰值，圖8b。當(dāng)相對(duì)于總ras(圖8c,頂部)或gapdh(圖8c,底部)標(biāo)準(zhǔn)化ras-gtp時(shí)，nf1r1947x/+(nf1het)細(xì)胞顯示出相較于nf1野生型細(xì)胞增加的ras活性。血清刺激后15分鐘，與nf1野生型細(xì)胞相比，對(duì)于nf1r1947x/+(nf1het)細(xì)胞，ras-gtp保持更高水平。這些結(jié)果顯示，在人中鑒定的并轉(zhuǎn)移至豬的r1947x突變確實(shí)參與神經(jīng)纖維瘤病的病因(etiotolgy)。此外，這表明ras在病理學(xué)中起主要作用。此外，這表明nf1突變對(duì)ras高活性起作用。

nf1雜合豬具有nf1相關(guān)表型：圖9a-c提供了顯示神經(jīng)纖維瘤病表型的出生的nf1r1947x/+ossabaw迷你豬表型的例子。圖9a，nf1r1947x/+ossabaw迷你豬的面部的棕褐色/褐色色素沉著不足(頂部)以及背部的白色色素沉著不足(底部)。圖9b，尸體解剖后，通過(guò)大體觀察(左)和x射線(xiàn)成像(右)，兩頭nf1r1947x/+ossabaw迷你豬顯示出脊柱彎曲的征兆以及潛在的脊柱側(cè)凸的體征。已經(jīng)在許多nf1r1947x/+ossabaw迷你豬中觀察到牛奶咖啡斑。表(左)描述了在單個(gè)動(dòng)物中見(jiàn)到的11個(gè)牛奶咖啡斑，具有如指示的病變照片。nf1患者中牛奶咖啡斑是非常常見(jiàn)的，并且用作診斷人中nf1的標(biāo)準(zhǔn)。圖9d，1-4是對(duì)應(yīng)于9c中1-4的斑點(diǎn)的照片。

實(shí)施例7：鑒定snp以確定nf1和tp53中誘導(dǎo)的突變是順式還是反式

發(fā)明人在由talen介導(dǎo)的同源性依賴(lài)性修復(fù)誘導(dǎo)的nf1r1947x或tp53s119x突變的5,100個(gè)堿基對(duì)中鑒定了潛在snp(表7和8)。一個(gè)或多個(gè)所鑒定的snp將用于鑒定哪個(gè)染色體上發(fā)生nf1r1947x突變，以及哪個(gè)染色體上發(fā)生tp53s119x突變。使用收集自攜帶nf1和tp53基因的染色體12上基因座的輻射雜合圖的數(shù)據(jù)，發(fā)明人將能夠鑒定出在相同染色體上發(fā)生nf1r1947x和tp53s119x突變的克隆。

表7

表8

從1到50連續(xù)列舉的以下段落提供了本公開(kāi)的各個(gè)方面。在一個(gè)實(shí)施方案中，在第一段(1)中，本公開(kāi)提供：

1.豬或細(xì)胞或胚胎，其包含遺傳修飾的nf1基因和/或修飾的tp53基因。

2.段落1的豬或細(xì)胞或胚胎，其中所述修飾的nf1基因包含在人中精氨酸1947的等同的位置處的修飾。

3.段落1和2的豬或細(xì)胞或胚胎，其中修飾所述修飾的nf1基因和/或修飾的tp53基因以含有提前終止密碼子。

4.段落1-3中任一項(xiàng)的豬或細(xì)胞或胚胎，其具有nf1基因的雜合修飾。

5.段落1-4中任一項(xiàng)的豬或細(xì)胞或胚胎，其具有tp53基因的雜合修飾。

6.段落1-5中任一項(xiàng)的豬或細(xì)胞或胚胎，其具有nf1基因和tp53基因兩者的修飾。

7.段落1-6中任一項(xiàng)的豬或細(xì)胞或胚胎，其中所述修飾是順式的。

8.段落1-7中任一項(xiàng)的豬或細(xì)胞或胚胎，其中nf1基因的一個(gè)等位基因是野生型等位基因。

9.段落1-8中任一項(xiàng)的豬或細(xì)胞或胚胎，其中tp53基因的一個(gè)等位基因是野生型等位基因。

10.段落1-9中任一項(xiàng)的豬或細(xì)胞或胚胎，其中除了野生型nf1等位基因具有至少1個(gè)沉默突變之外，nf1基因的1個(gè)等位基因是野生型等位基因?；蛘撸簝H具有1、2、3、4，或5個(gè)沉默突變。

11.段落1-10中任一項(xiàng)的豬或細(xì)胞或胚胎，其中除了野生型tp53等位基因具有至少1個(gè)沉默突變之外，tp53基因的1個(gè)等位基因是野生型等位基因?；蛘撸簝H具有1、2、3、4，或5個(gè)沉默突變。

12.段落1-11中任一項(xiàng)的豬或細(xì)胞或胚胎，其中所述沉默突變?yōu)橄拗泼柑峁┕粑稽c(diǎn)。例如：提供1、2、3、4，或5位點(diǎn)的1、2、3、4、5個(gè)沉默突變，其中所述位點(diǎn)是單個(gè)酶特異性的或?yàn)槎鄠€(gè)限制酶提供位點(diǎn)。

13.段落1-12中任一項(xiàng)的豬或細(xì)胞或胚胎，其具有修飾(沉默或其他)，所述修飾由于修飾而為限制酶提供攻擊位點(diǎn)。例如：提供1、2、3、4，或5位點(diǎn)的1、2、3、4、5個(gè)突變，其中所述位點(diǎn)是單個(gè)酶特異性的或?yàn)槎鄠€(gè)限制酶提供位點(diǎn)。

14.段落1-13中任一項(xiàng)的豬或細(xì)胞或胚胎，其是微型豬(miniaturepig)和/或ossabaw豬和/或長(zhǎng)白豬(landracepig)和/或建立者(founder)和/或f1。

15.段落1-14中的細(xì)胞，其是原代(primary)和/或豬和/或低傳代(低于13代)細(xì)胞。

16.段落1-15中的細(xì)胞，其是受精卵、卵母細(xì)胞、配子、精子，或胚胎/卵裂球的成員。

17.制備段落1-16中任一項(xiàng)的方法，其包含使用靶向內(nèi)切核酸酶和/或同源性依賴(lài)性修復(fù)模板。所述細(xì)胞可以被用于制備動(dòng)物，例如通過(guò)克隆。

18.制備動(dòng)物、細(xì)胞，或胚胎的方法，其包含向細(xì)胞或胚胎中導(dǎo)入：

定向(directed)至靶染色體dna位點(diǎn)的靶向內(nèi)切核酸酶；

與靶染色體dna位點(diǎn)同源的第一hdr模板，所述第一hdr模板包含對(duì)于靶染色體dna位點(diǎn)外源的第一序列，和

與靶染色體dna位點(diǎn)同源的第二hdr模板，所述第二hdr模板包含對(duì)于靶染色體dna位點(diǎn)外源的第二序列。

19.段落18中的方法，其中所述第二序列與靶dna染色體位點(diǎn)相同。

20.段落18和19的方法，其中所述第二序列與靶dna染色體位點(diǎn)具有99％同一性?；蛘撸瑪?shù)值為95至99.99％；技術(shù)人員將立即意識(shí)到，在這個(gè)范圍內(nèi)的所有范圍和數(shù)值都被考慮和支持，例如97、99.8，至少95％。

21.段落18至20的方法，其中所述第二序列與靶dna染色體位點(diǎn)相同，除了：(i)一個(gè)或多個(gè)沉默突變；(ii)堿基數(shù)目在1-5的范圍內(nèi)。例如，沉默突變的數(shù)目可以是1-5。

22.段落18-21中任一項(xiàng)的方法，其中除了在允許由預(yù)先確定的限制酶切割的序列中的變化之外，所述第二序列與靶dna染色體位點(diǎn)相同。進(jìn)一步的方法提供了任何數(shù)目的此類(lèi)改變，例如1-5。

23.段落18-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述外源序列包含：(i)在自然界中發(fā)現(xiàn)的等位基因；(ii)在同一物種中發(fā)現(xiàn)的等位基因；(iii)在同一物種的另一品種中發(fā)現(xiàn)等位基因(不在相同品種中的等位基因)；(iv)來(lái)自不同物種的等位基因(不來(lái)自相同物種的等位基因)；(v)創(chuàng)建基因敲除的序列；(vi)可表達(dá)的選擇標(biāo)志物(例如抗生素，熒光蛋白)；(viii)可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子；(ix)著落墊(landingpad)；或(x)i-ix的任何組合，其可以是適當(dāng)?shù)摹?/p>

24.段落18-23中任一項(xiàng)的方法，其中所述動(dòng)物、細(xì)胞，或動(dòng)物對(duì)于由第一hdr模板產(chǎn)生的遺傳修飾是雜合的。

25.段落18-24中任一項(xiàng)的方法，其應(yīng)用于制備修飾的nf1和/或tp53位點(diǎn)。

26.段落18-24中任一項(xiàng)的方法，其應(yīng)用于制備修飾的腫瘤抑制基因。

27.段落18-26中任一項(xiàng)的方法，還包含調(diào)整第一hdr模板與第二hdr模板的比率。

28.段落18-27中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一模板包含用于第一限制酶的第一位點(diǎn)，以及第二模板包含對(duì)于第二限制酶的第二位點(diǎn)。其中所述第一位點(diǎn)和第二位點(diǎn)相對(duì)于靶位點(diǎn)和/或靶染色體和/或品種和/或物種和/或動(dòng)物是新的。或者：對(duì)于額外的獨(dú)特酶的添加位點(diǎn)，因此存在3個(gè)或更多個(gè)限制酶位點(diǎn)，例如數(shù)目從3至10；例如，4、5、6、7、8、9。

29.段落18-28中任一項(xiàng)的方法，其包含對(duì)多個(gè)細(xì)胞篩選遺傳修飾，所述方法包含鑒定包含所述第一位點(diǎn)和所述第二位點(diǎn)的細(xì)胞?；?-10個(gè)位點(diǎn)。

30.動(dòng)物或細(xì)胞或胚胎，其包含基因組修飾的腫瘤抑制基因，所述基因是雜合修飾的。

31.段落30的動(dòng)物或細(xì)胞或胚胎，其通過(guò)18-30中任一項(xiàng)的方法制備。

32.段落30-31中任一項(xiàng)動(dòng)物或細(xì)胞或胚胎，其中除了野生型nf1等位基因具有至少一個(gè)沉默突變之外，所述修飾基因的一個(gè)等位基因是野生型等位基因。或者：僅具有1、2、3、4，或5個(gè)沉默突變。

33.段落30-32的動(dòng)物或細(xì)胞或胚胎，其中所述沉默突變?yōu)橄拗泼柑峁┝斯粑稽c(diǎn)。例如：提供1、2、3、4，或5個(gè)位點(diǎn)的1、2、3、4、5個(gè)沉默突變，其中所述位點(diǎn)是單個(gè)酶特異性的或?yàn)槎鄠€(gè)限制酶提供位點(diǎn)。

34.段落30-33中任一項(xiàng)動(dòng)物或細(xì)胞或胚胎，其包含在基因上(在修飾完成后的基因的一個(gè)或兩個(gè)等位基因上)的修飾(沉默或其他)，所述修飾由于該修飾而為限制酶提供攻擊位點(diǎn)。例子：提供1、2、3、4，或5個(gè)位點(diǎn)的1、2、3、4、5個(gè)突變，其中所述位點(diǎn)是單個(gè)酶特異性的或?yàn)槎鄠€(gè)限制酶提供位點(diǎn)。

35.段落30-34中任一項(xiàng)動(dòng)物或細(xì)胞或胚胎，其是家畜、牛、豬、微型豬(miniaturepig)和/或ossabaw豬和/或長(zhǎng)白豬(landracepig)和/或建立者和/或f1。

36.段落30-35中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其是原代和/或動(dòng)物和/或低傳代(低于13代)細(xì)胞。

37.段落30-36中任一項(xiàng)的細(xì)胞，其是其是受精卵、卵母細(xì)胞、配子、精子，或胚胎/卵裂球的成員。

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<220>

<223>左talenrvd

<400>8

asnasnasnileasnglyasnasnasnileasnglyasnasnhisasp

151015

hisaspasnileasnileasnilehisaspasnasnasnilehisasp

202530

<210>9

<211>32

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>右talenrvd

<400>9

asnglyasnileasnglyhisaspasnileasnasnhisaspasngly

151015

asnglyasnileasnglyhisaspasnileasnileasnasnasnasn

202530

<210>10

<211>34

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>左talenrvd

<400>10

asnasnasnasnhisaspasnilehisasphisasphisaspasnasn

151015

asnglyasnasnasnglyhisasphisaspasnasnhisaspasnasn

202530

hisasp

<210>11

<211>30

<212>prt

<213>人工

<220>

<223>右talenrvd

<400>11

hisaspasnileasnglyasnasnasnglyasnilehisaspasngly

151015

hisaspasnglyasnasnasnilehisaspasnglyasngly

202530

<210>12

<211>85

<212>dna

<213>野豬

<400>12

tcaaatctagtacgtttttgtaagcacaatgatgatgccaaacgacaaagagttactgcg60

atccttgataagctgataacaatga85

<210>13

<211>90

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>ssnf1hdr寡核苷酸序列

<400>13

tcaaatctagtacgtttttgtaagcacaatgatgatgccaaatgaagcttcaaagagtta60

ctgcgatccttgataagctgataacaatga90

<210>14

<211>85

<212>dna

<213>野豬

<400>14

agctcgccacccccgcctggcacccgtgtccgcgccatggccatctacaagaagtcagag60

tacatgaccgaggtggtgaggcgct85

<210>15

<211>90

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>sstp53hdr寡核苷酸序列

<400>15

agctcgccacccccgcctggcacccgggtccgcgccatggccatctaagcttaaagaagt60

cagagtacatgcccgaggtggtgaggcgct90

<210>16

<211>23

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>pcr引物

<400>16

cctgcccccaccatcttcttatt23

<210>17

<211>24

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>pcr引物

<400>17

gctctcgtacagtgctttgcacaa24

<210>18

<211>24

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>pcr引物

<400>18

ctcccctgccctcaataagctgtt24

<210>19

<211>21

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>pcr引物

<400>19

tgggaatgaggggtttggcag21

<210>20

<211>20

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>pcr引物-正向

<400>20

gtgggtcagctcgccacccc20

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>人工

<220>

<223>pcr引物-反向

<400>21

gtgggtcagctcgccacccc20