本發(fā)明與牛樟芝的培養(yǎng)方法有關(guān)，更詳而言之是指一種提高牛樟芝三萜類成分的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

牛樟芝(Antrodia cinnamomea)是一種生長在樟科植物-牛樟樹心材的寄生真菌，已被中國人廣泛用作為治療食物、藥物中毒、腹瀉、腹痛、高血壓和癌癥，具有開發(fā)成醫(yī)藥或保健食品的高經(jīng)濟價值。牛樟芝子實體特有的三萜類成分甚多，此處不一一贅述，三萜類成分具有抗腫瘤活性、促使癌細胞凋亡等療效，但不會影響人體正常細胞。

已知關(guān)于牛樟芝子實體的培養(yǎng)方法不少，如TWI422680專利、CN102746054公開案，利用一般常用培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基，添加中草藥萃取物，在溫度、濕度、空氣量控制的無菌密閉空間培養(yǎng)135天，獲得固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)牛樟芝。CN202455895公開案，以控制溫濕度與具有光照波長為300～800nm單元的無菌培養(yǎng)箱，促進牛樟芝在椴木培養(yǎng)效率，提高牛樟芝所含不同活性成分的含量。上述專利所揭技術(shù)，皆需有溫、濕度控制的昂貴無菌空調(diào)空間的設(shè)備，需要添加昂貴且大量(16.7％～40％)的中草藥萃取物，固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)牛樟芝的培養(yǎng)時間至少5-6個月，椴木培養(yǎng)時間至少24個月，不僅生產(chǎn)成分太貴，環(huán)境控制消耗能量，也不環(huán)保。

其次，目前業(yè)界栽培牛樟芝的方式大概區(qū)分為四大類，第一種是以牛樟椴木栽培牛樟芝子實體的方式，第二種是以固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)牛樟芝的方式，第三種是以液態(tài)發(fā)酵方法培養(yǎng)牛樟芝菌絲體，第四種是以太空包方式栽培。使用牛樟樹椴木培養(yǎng)牛樟芝，會破壞森林、生態(tài)，造成牛樟樹遭受空前浩劫濫砍。牛樟芝的子實體，不論是椴木栽培或固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)都含有牛樟芝的三萜類成分。液態(tài)發(fā)酵方法培養(yǎng)牛樟芝菌絲體中，則不含牛樟芝特有三萜類成分，雖然培養(yǎng)時間短、可快速量產(chǎn)，不過其菌絲體內(nèi)容物組成分析和子實體成分差異甚大。采用含有營養(yǎng)物質(zhì)的太空包來培養(yǎng)牛樟芝(如栽培香菇子實體的方法)，所得到的牛樟芝外觀雖然與牛樟芝相似，但木質(zhì)纖維太高，因此三萜類化合物的含量低。

換言之，椴木栽培或固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)牛樟芝子實體，都可含有三萜類成分，較其他兩種牛樟芝培養(yǎng)方式佳，不過，固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)方式的成本高、培養(yǎng)時 間長、約需2年，不利于量產(chǎn)與推廣。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的主要目的即在提供一種提高牛樟芝三萜類成分的培養(yǎng)方法，其不使用椴木培養(yǎng)牛樟芝子實體，在一個月內(nèi)，在室溫、光線照射的環(huán)境下培養(yǎng)，可達到快速量產(chǎn)而又富含三萜類化合物成分的功效，成本低，甚為環(huán)保、安全，甚具經(jīng)濟價值。

緣是，為達成前述的目的，本發(fā)明提供一種提高牛樟芝三萜類成分的培養(yǎng)方法，其步驟至少包含有混合培養(yǎng)基的組成成分：將預(yù)定比例的麥芽萃取物(maltextract)、葡萄糖(glucose)、蛋白胨(peptone)、瓊脂(agar)及菇類萃取物等物質(zhì)加入蒸餾水后均勻混合；滅菌：將混合后的培養(yǎng)基溶液置于一高壓滅菌設(shè)備內(nèi)，在預(yù)訂壓力、溫度下加熱殺菌適當時間；形成固態(tài)培養(yǎng)基：將滅菌后的培養(yǎng)基溶液，在無菌環(huán)境下倒入一培養(yǎng)皿至適當高度，并靜置、冷卻培養(yǎng)基溶液，以形成一固態(tài)培養(yǎng)基；菌株接種：將牛樟芝菌種分別接菌至固態(tài)培養(yǎng)基的復(fù)數(shù)位置，各位置并具適當間距；光線刺激培養(yǎng)：在預(yù)定環(huán)境溫度、預(yù)定波長、照射光度的光源照射下，培養(yǎng)適當時間，以獲得高含量的牛樟芝三萜類成分。

進一步地，混合培養(yǎng)基的組成成分的步驟中，將1％-2％w/v濃度的麥芽萃取物、1％-2％w/v濃度的葡萄糖、0.1％-0.2％w/v濃度的蛋白胨、1％-2％w/濃度的瓊脂及0.1％-0.2％w/v濃度的菇類萃取物等物質(zhì)，置入于可滅菌的一玻璃容器中。

進一步地，菇類為金針菇、木耳、銀耳或香菇。

進一步地，滅菌的步驟中，在壓力1kg/cm²、溫度120-121℃下，加熱殺菌25-30分鐘。

進一步地，該高壓滅菌設(shè)備為高壓滅菌釜。

進一步地，形成固態(tài)培養(yǎng)基的步驟中，將滅菌后的培養(yǎng)基溶液倒入一直徑90mm、高度10mm的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基倒入高度約1mm(相當體積6cc)。

進一步地，該無菌環(huán)境指在一無菌操作臺上操作。

進一步地，菌株接種的步驟中，將牛樟芝菌種分別接菌至固態(tài)培養(yǎng)基的上、下、左、右、中的五個位置，每個位置的間距約20mm。

進一步地，牛樟芝菌種的接菌面積為1mm×1mm面積。

進一步地，光線刺激培養(yǎng)的步驟中，培養(yǎng)溫度為25-30℃、培養(yǎng)光源為波長620-625nm、照射光度為400-600Lux，培養(yǎng)時間為30天。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提供一種提高牛樟芝三萜類成分的培養(yǎng)方法，利用皿培式培養(yǎng)法來 培養(yǎng)牛樟芝子實體，不僅可縮短培養(yǎng)時間至4周，更可提升培養(yǎng)的成功率(成功率約為95％～98％)及產(chǎn)量，可增加推廣價值；可提升牛樟芝的培養(yǎng)效率，并可穩(wěn)定牛樟芝子實體的三帖類生成量；本發(fā)明的培養(yǎng)方法配合光線刺激，可有效刺激牛樟芝子實體的生長狀況，并可提高牛樟芝子實體的三萜類成分生成量。

附圖說明

圖1為本發(fā)明一較佳實施例的流程圖。

圖2為本發(fā)明一較佳實施例提供菇類營養(yǎng)前驅(qū)物質(zhì)配方培養(yǎng)基與已知椴木培養(yǎng)所培養(yǎng)的牛樟芝子實體中三萜類成分的HPLC分析圖譜。

圖3為本發(fā)明一較佳實施例與已知椴木培養(yǎng)所培養(yǎng)的牛樟芝子實體中三萜類成分的HPLC分析圖譜。

具體實施方式

以下，茲舉本發(fā)明一較佳實施例，并配合附圖做進一步的詳細說明如后。

首先，請參閱圖1所示，本發(fā)明一較佳實施例的提高牛樟芝三萜類成分的培養(yǎng)方法100，其第一步驟為混合培養(yǎng)基的組成成分110：依比例預(yù)先混合培養(yǎng)基的各組成成分(營養(yǎng)前驅(qū)物質(zhì))，該培養(yǎng)基配方為：1％-2％w/v(本實施例為2％w/v)濃度的麥芽萃取物(malt extract)、1％-2％w/v(本實施例為2％w/v)濃度的葡萄糖(glucose)、0.1％-0.2％w/v(本實施例為0.2％w/v)濃度的蛋白胨(peptone)、1％-2％w/v(本實施例為2％w/v)濃度的瓊脂(agar)、0.1％-0.2％w/v(本實施例為0.2％w/v)濃度的菇類萃取物(如金針菇、木耳、銀耳、香菇等物質(zhì)，本實施例為木耳)，置入于可滅菌的玻璃容器中，再加入蒸餾水均勻混合。

本發(fā)明的第二步驟為滅菌120：將混合后的培養(yǎng)基溶液置于一高壓滅菌設(shè)備內(nèi)，為高壓滅菌釜，在壓力1kg/cm²下、溫度120-121℃(本實施例為121℃)，加熱殺菌25-30分鐘(本實施例為30分鐘)。

本發(fā)明的第三步驟為形成固態(tài)培養(yǎng)基130：將滅菌后的培養(yǎng)基溶液，在無菌環(huán)境(無菌操作臺)倒入一培養(yǎng)皿至適當高度，該培養(yǎng)皿的直徑90mm、高度10mm，培養(yǎng)基倒入高度約1mm(相當體積6cc)，并靜置、冷卻培養(yǎng)基溶液，以形成一固態(tài)培養(yǎng)基。

本發(fā)明的第四步驟為菌株接種140：將牛樟芝菌種以1mm×1mm的接菌面積，分別接菌至固態(tài)培養(yǎng)基的上、下、左、右、中的五個位置，各位置并相隔約20mm。

本發(fā)明的最后步驟為光線刺激培養(yǎng)150：在溫度25-30℃(即室溫)(本實施例為25℃)、光源波長620-625nm(紅光)(本實施例為625nm)、照射光度400-600Lux(本實施例為600Lux)的光源照射下，培養(yǎng)30天，即可獲得高含量 的牛樟芝三萜類成分。

藉此，本發(fā)明提高牛樟芝三萜類成分的培養(yǎng)方法，其通過混合培養(yǎng)基的組成成分、滅菌、形成固態(tài)培養(yǎng)基、菌株接種及光線刺激培養(yǎng)的步驟，可在一個月的培養(yǎng)時間獲得高含量的牛樟芝三萜類成分。

以下，茲就本發(fā)明培養(yǎng)方法所獲得的牛樟芝子實體三萜類成分含量，與已知椴木培養(yǎng)得到的牛樟芝子實體三萜類成分作比較與分析，如下：

經(jīng)由本發(fā)明所提供的菇類營養(yǎng)前驅(qū)物質(zhì)配方培養(yǎng)基培養(yǎng)所得到的牛樟芝子實體與椴木培養(yǎng)得到的牛樟芝子實體，從圖2的牛樟芝子實體中三萜類成分的HPLC分析圖譜顯示，二者三萜類成分是相同的，亦即，本發(fā)明的培養(yǎng)方法可獲得與已知椴木培養(yǎng)的牛樟芝子實體相同含量的三萜類成分。

其次，本發(fā)明的培養(yǎng)方法，其從菇類子實體，如金針菇、木耳、銀耳、香菇熬煮的濃縮液，具有直接誘導(dǎo)牛樟芝子實體形成三萜類成分的功效，因此，給予適當?shù)臓I養(yǎng)前驅(qū)物質(zhì)配方有助于牛樟芝菇體的子實體形成三萜類成分快速生成。使用一般微生物培養(yǎng)添加營養(yǎng)前驅(qū)物質(zhì)配方調(diào)和而成的培養(yǎng)基，使菌種能在接近天然生長狀態(tài)的固態(tài)環(huán)境下成長，并且使用高溫消毒技術(shù)，可確保無其他微生物、保證品質(zhì)無污染。

而已知椴木栽培法是使用枯死的牛樟樹椴木，將牛樟芝菌體植入椴木中，使牛樟芝在椴木中生長，藉此取得牛樟芝子實體，此種培養(yǎng)方式的成本高、培養(yǎng)時間約需2年，不利于量產(chǎn)與推廣，相較之下，本發(fā)明顯然更具經(jīng)濟價值。

再者，進行子實體誘導(dǎo)測試時，本發(fā)明紅光照射與營養(yǎng)前驅(qū)物物質(zhì)引導(dǎo)的刺激有助于三萜類成分在子實體中形成高含量三萜類成分。而菇菌類子實體產(chǎn)生三萜類成分的機制，主要是因應(yīng)營養(yǎng)與環(huán)境狀況，比方營養(yǎng)前驅(qū)物質(zhì)添加與環(huán)境光線刺激，進而促進從子實體中產(chǎn)生三萜類成分，從圖3的牛樟芝子實體中三萜類成分的HPLC分析圖譜可顯示與證明，本發(fā)明較椴木培養(yǎng)得到的牛樟芝子實體，可獲得更高含量三萜類成分。

由上可知，本發(fā)明提高牛樟芝三萜類成分的培養(yǎng)方法，其至少具有下列優(yōu)點及有益效果：

1、利用皿培式培養(yǎng)法來培養(yǎng)牛樟芝子實體，不僅可縮短培養(yǎng)時間至4周，更可提升培養(yǎng)的成功率(成功率約為95％～98％)及產(chǎn)量，可增加推廣價值。

2、本發(fā)明所提供的營養(yǎng)前驅(qū)物質(zhì)配方培養(yǎng)基成份，可提升牛樟芝的培養(yǎng)效率，并可穩(wěn)定牛樟芝子實體的三帖類生成量。

3、本發(fā)明的培養(yǎng)方法配合光線刺激，可有效刺激牛樟芝子實體的生長狀況， 并可提高牛樟芝子實體的三萜類成分生成量。