本發(fā)明涉及農(nóng)用微生物菌劑技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種微生物殺蟲劑的制備方法。
背景技術(shù)：
植物病蟲害是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的大敵，據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織 (ＦＡＯ)統(tǒng)計每年因植物遭受病害造成的減產(chǎn)平均損失為總產(chǎn)量的15%～20%。長期以來，用于防治或撲滅農(nóng)田害蟲制劑一般均為化學(xué)農(nóng)藥，如六六六、敵敵畏等。長期頻繁使用化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致害蟲抗藥性的出現(xiàn)，使化學(xué)農(nóng)藥的效力逐漸降低。目前，主要解決方式是加大用藥量，直接導(dǎo)致農(nóng)業(yè)成本提高；害蟲抗藥性加強(qiáng)，防治難度加大；天敵被殺死，生態(tài)平衡遭到破壞；毒害物質(zhì)在農(nóng)副產(chǎn)品中殘留、積累，危害廣大人民的身體健康。因此，尋找廣譜、高效、低毒的生物農(nóng)藥已成為科研人員及農(nóng)藥使用人員的共識。
微生物殺蟲劑是利用微生物活體或其代謝產(chǎn)物來防治害蟲的。它具有特異性強(qiáng)，防治效果好，對人畜安全，不破壞生態(tài)平衡，害蟲不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。目前的微生物殺蟲劑主要包括三類：1、細(xì)菌類殺蟲劑：細(xì)菌殺蟲劑是應(yīng)用最早的微生物殺蟲劑，根據(jù)對昆蟲致病性的不同，分為轉(zhuǎn)性病原體、堿性病原體和潛勢病原體。目前被開發(fā)成產(chǎn)品投入實際使用的主要有4種：蘇云金芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、日本金龜子芽孢桿菌和緩病芽孢桿菌，其中蘇云金芽孢桿菌是當(dāng)今研究最多、應(yīng)用最廣的微生物殺蟲劑。其功效產(chǎn)物為伴胞晶體蛋白和蘇云金素。2、真菌類殺蟲劑：真菌類殺蟲劑種類繁多，目前記載的約有800多種，其中大部分是兼性或轉(zhuǎn)性病原體，研究應(yīng)用較多的有白僵菌、綠僵菌、擬青霉菌、輪枝菌等。但其生長和繁殖在很大程度上受外界條件的限制，在實際應(yīng)用中收到環(huán)境限制。3、病毒類殺蟲劑：昆蟲病毒的感染途徑主要有食入感染和皮膚感染，目前該類制劑正處于研發(fā)階段，工業(yè)化生產(chǎn)還不成熟。
綜上，現(xiàn)有的微生物殺蟲劑在實際應(yīng)用過程中應(yīng)用范圍較為單一，菌種間的拮抗作用強(qiáng)，殺蟲譜較窄；在工業(yè)化應(yīng)用和環(huán)境適應(yīng)性、抗逆性等方面現(xiàn)有產(chǎn)品也存在諸多不足，限制了微生物制劑在農(nóng)作物殺蟲上的廣泛應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是通過菌種選育和發(fā)酵工藝優(yōu)化，設(shè)計出一種工業(yè)化微生物殺蟲劑的生產(chǎn)方法，即利用兩種蘇云金芽孢桿菌作為生產(chǎn)菌株，應(yīng)用本發(fā)明所設(shè)計的工藝方案和優(yōu)化的培養(yǎng)基配方，增強(qiáng)產(chǎn)品的殺蟲性能，并擴(kuò)展其實際應(yīng)用范圍。
為實現(xiàn)上述的發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種微生物殺蟲劑的制備方法，具體步驟為：
步驟1：蘇云金芽孢桿菌斜面培養(yǎng)，所述蘇云金芽孢桿菌斜面培養(yǎng)溫度為32℃～39℃，時間為43h～52h，所述蘇云金芽孢桿菌斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為：氯化鈉0.2%～0.8%，葡萄糖0.2%～0.8%，蛋白胨0.3%～0.7%，瓊脂粉1%～3%，其余為水，將pH值調(diào)整至7.0～8.5，滅菌后倒斜面，接種培養(yǎng)。
步驟2：蘇云金芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)，所述蘇云金芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)溫度為32℃～39℃，時間為22h～30h，轉(zhuǎn)速為180rpm～220rpm，所述蘇云金芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為：葡萄糖0.5%～2%，玉米蛋白粉0.5%～2%，蛋白胨0.2%～0.8%，淀粉0.2%～0.8%，將pH值調(diào)整至7.0～8.5，滅菌后接種培養(yǎng)。
步驟3：蘇云金芽孢桿菌種子培養(yǎng)，所述蘇云金芽孢桿菌種子培養(yǎng)培養(yǎng)溫度為32℃～39℃，時間為24h～26h，起始攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，接種量為2%～3%，通氣比V空氣/min：V發(fā)酵液體積為0.8:1，根據(jù)溶氧情況逐步提高攪拌轉(zhuǎn)數(shù)和通氣比，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)最高至600rpm，通氣比V空氣/min：V發(fā)酵液體積最高至1.5:1，待pH值開始回升且尾碳升至最高開始下降時移種，所述蘇云金芽孢桿菌種子培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為：葡萄糖0.5%～1%，玉米蛋白粉1%，棉籽餅粉0.5%～1%，玉米淀粉0.5%～1%，聚醚消泡劑0.01%，其余為水，滅菌前將pH值調(diào)整到7.0～7.5，裝料系數(shù)為0.6，滅菌后通氣保壓，降溫至32℃～39℃時，接種培養(yǎng)。
步驟4：蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，所述蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為32℃～39℃，時間為24h～28h，接種量為10%～20%之間，啟始攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm，當(dāng)溶解氧低于20%時增加攪拌轉(zhuǎn)數(shù)和通氣量，維持溶氧在20%以上，當(dāng)發(fā)酵液中菌體數(shù)量≥5*109cfu/ml后，降低發(fā)酵液溶氧至5%～10%之間，添加滅菌后的氯化鈷、氯化錳等微量元素，添加量為氯化錳0.001%～0.002%，氯化鈷0.0015%～0.003%，促進(jìn)芽孢和伴胞晶體的形成，增加發(fā)酵液中的有效成分，待發(fā)酵結(jié)束時將發(fā)酵罐液體排出，進(jìn)行成品灌裝，所述蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為：葡萄糖0.2%～1.5%，棉籽餅粉0.5%～3%，玉米漿0.2%～2%，玉米淀粉1%～3%，聚醚消泡劑：0.005%～0.02%，其余為水，滅菌前將pH值調(diào)整到7.0～7.5，裝料系數(shù)為0.6，滅菌后通氣保壓，降溫至32℃～39℃時，接種培養(yǎng)。
本發(fā)明的有益效果為：
1、本發(fā)明的微生物殺蟲劑具有芽孢數(shù)量高和伴胞晶體含量高的特點(diǎn)，其菌體數(shù)量遠(yuǎn)高于現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)，用于植物蟲害防控，隨著害蟲對植物的進(jìn)食進(jìn)入蟲體腸道，通過營養(yǎng)菌體、菌體芽孢及其分泌的內(nèi)毒素（伴孢晶體）、營養(yǎng)期殺蟲蛋白、腸毒素、幾丁質(zhì)酶等的交互作用，使害蟲進(jìn)食后患敗血癥死亡；對瓜果、蔬菜、果樹、大田類作物的菜青蟲、小菜蛾、甜蛾、斜紋夜蛾、甘藍(lán)夜蛾、煙青蟲、玉米螟、稻縱卷葉螟、二化螟、小地老虎等都有毒殺作用。
2、兩種菌種的混合發(fā)酵降低了設(shè)備投入和人工成本，便于產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施方式
以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。
一種微生物殺蟲劑的制備方法，具體步驟為：
步驟1：蘇云金芽孢桿菌斜面培養(yǎng)，所述蘇云金芽孢桿菌斜面培養(yǎng)溫度為32℃～39℃，時間為43h～52h，所述蘇云金芽孢桿菌斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為：氯化鈉0.2%～0.8%，葡萄糖0.2%～0.8%，蛋白胨0.3%～0.7%，瓊脂粉1%～3%，其余為水，將pH值調(diào)整至7.0～8.5，滅菌后倒斜面，接種培養(yǎng)。
步驟2：蘇云金芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)，所述蘇云金芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)溫度為32℃～39℃，時間為22h～30h，轉(zhuǎn)速為180rpm～220rpm，所述蘇云金芽孢桿菌搖瓶培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為：葡萄糖0.5%～2%，玉米蛋白粉0.5%～2%，蛋白胨0.2%～0.8%，淀粉0.2%～0.8%，將pH值調(diào)整至7.0～8.5，滅菌后接種培養(yǎng)。
步驟3：蘇云金芽孢桿菌種子培養(yǎng)，所述蘇云金芽孢桿菌種子培養(yǎng)培養(yǎng)溫度為32℃～39℃，時間為24h～26h，起始攪拌轉(zhuǎn)速為400rpm，接種量為2%～3%，通氣比V空氣/min：V發(fā)酵液體積為0.8:1，根據(jù)溶氧情況逐步提高攪拌轉(zhuǎn)數(shù)和通氣比，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)最高至600rpm，通氣比V空氣/min：V發(fā)酵液體積最高至1.5:1，待pH值開始回升且尾碳升至最高開始下降時移種，所述蘇云金芽孢桿菌種子培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為：葡萄糖0.5%～1%，玉米蛋白粉1%，棉籽餅粉0.5%～1%，玉米淀粉0.5%～1%，聚醚消泡劑0.01%，其余為水，滅菌前將pH值調(diào)整到7.0～7.5，裝料系數(shù)為0.6，滅菌后通氣保壓，降溫至32℃～39℃時，接種培養(yǎng)。
步驟4：蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)，所述蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為32℃～39℃，時間為24h～28h，接種量為10%～20%之間，啟始攪拌轉(zhuǎn)速為300rpm，當(dāng)溶解氧低于20%時增加攪拌轉(zhuǎn)數(shù)和通氣量，維持溶氧在20%以上，當(dāng)發(fā)酵液中菌體數(shù)量≥5*109cfu/ml后，降低發(fā)酵液溶氧至5%～10%之間，添加滅菌后的氯化鈷、氯化錳等微量元素，添加量為氯化錳0.001%～0.002%，氯化鈷0.0015%～0.003%，促進(jìn)芽孢和伴胞晶體的形成，增加發(fā)酵液中的有效成分，待發(fā)酵結(jié)束時將發(fā)酵罐液體排出，進(jìn)行成品灌裝，所述蘇云金芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為：葡萄糖0.2%～1.5%，棉籽餅粉0.5%～3%，玉米漿0.2%～2%，玉米淀粉1%～3%，聚醚消泡劑：0.005%～0.02%，其余為水，滅菌前將pH值調(diào)整到7.0～7.5，裝料系數(shù)為0.6，滅菌后通氣保壓，降溫至32℃～39℃時，接種培養(yǎng)。
以上對本發(fā)明的實施進(jìn)行了說明，但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實施例，不能被認(rèn)為用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進(jìn)，均應(yīng)歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內(nèi)。