本發(fā)明涉及一種通過離體培養(yǎng)白樺花藥獲得單倍體再生植株的方法。本發(fā)明屬農業(yè)生物技術領域。

背景技術：
白樺(Betulaplatyphylla)為樺木科樺木屬落葉喬木。自然分布主要在東北地區(qū)的北部：大小興安嶺、完達山等林區(qū)。因其姿態(tài)優(yōu)美，樹皮光滑潔白，作為庭園樹、行道樹及街心綠地栽培，具獨特的觀賞價值。白樺屬強陽性樹種，耐貧寒、生長快、材質優(yōu)良，為重要工業(yè)用材樹種之一?；ㄋ幣囵B(yǎng)能夠獲得純系育種材料，進行單倍體育種，縮短育種年限和提高育種效率，而且在基礎生物科學領域具也有廣泛應用(王延玲等，山東農業(yè)大學學報(自然科學版)，2006，37(1)：149～151)?；ㄋ幣囵B(yǎng)建立的雙單倍體群體DH群體，具有遺傳學上的純合基因組，是AFLP,RAPD,SSR等分子標記和基因圖譜的理想材料，能極大提高基因定位、標圖的準確性。從20世紀60年代，Nitshc通過花藥培養(yǎng)得到煙草的單倍體植株后，花藥培養(yǎng)得到了很大的發(fā)展并于70年代達到了高速發(fā)展階段。自1964年印度的Guha和Maheshwari(GuhaandMaheshwari,Nature,1964,204:497)首次成功地從毛葉曼陀羅離體花藥培養(yǎng)中獲得單倍體植株，并隨后證實是由胚狀體途徑獲得的單倍體花粉植株，從此開創(chuàng)了利用花藥培養(yǎng)誘導單倍體的新途徑。之后，花藥培養(yǎng)誘導單倍體在許多重要作物上獲得成功，如在小麥(倪勝利等，甘肅農業(yè)大學學報，2004，39(2):141～145)、玉米(付迎軍，延邊大學農學學報，2004，26(1)：1～5)、水稻(趙海巖等，遼寧農業(yè)科學，2005(1)：5～7)、茄子(Miyoshi，PlantCellReports，1996，15(6)：391～395)、草莓(Rosati等，HortScience，1975，10(2)；119～120)等農作物上都有成功的報道。到目前為止，白樺花藥培養(yǎng)體系及單倍體植株還未有報道。由于小孢子處于單核靠邊期的白樺花藥很小，約1.5-2.0mm，無菌接種操作較困難。根據(jù)相關研究研究報道(李同華，東北林業(yè)大學碩士論文，2004)，白樺小孢子在每年的8月下旬發(fā)育到小孢子，9月份完發(fā)育到單核靠邊期越冬，第二年再繼續(xù)發(fā)育成熟。本發(fā)明的目的是建立一種培養(yǎng)白樺花藥獲得單倍體的技術體系，為白樺單倍體育種及基礎研究提供原始研究材料。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明主要涉及快速獲得大量小孢子處于單核靠邊期的白樺花藥，花藥植株再生及單倍體植株的鑒定。具體如下：(1)小孢子處于單核靠邊期白樺花藥的大量獲得在8月下旬到9月初，不斷取材，利用醋酸洋紅法于光學顯微鏡下觀察花藥中小孢子的發(fā)育時期。當小孢子發(fā)育到單核靠邊期時,采集雄穗在超凈工作臺內用70％消毒3分鐘。普通豆?jié){機的刀片和杯也事先在超凈工作臺內經(jīng)70％酒精經(jīng)消毒后，將花穗放入豆?jié){機的杯中，擰上刀片，然后拿出超凈工作臺，插入電機粉碎。之后取下杯和刀片在超凈工作臺內打開，取出物分別以40目和60目網(wǎng)篩過篩，除去大于和小于花藥的雜質獲得大量無雜質、無菌花藥。(2)花藥植株再生將上述花藥接種到添加40g/L蔗糖和0-3.0mg/L2,4-D，0.5mg/LKT的MS培養(yǎng)基中誘導愈傷組織。培養(yǎng)四周，在40mg/L蔗糖+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT條件下獲得大量愈傷組織。然后轉入添加0.5-2.0mg/LBA，0.1-0.5mg/LNAA，30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基進行分化。培養(yǎng)四周后，在30mg/L蔗糖+2.0mg/LBA+0.5mg/LKT最多。分化出的不定芽在WPM+0.4mg/LIBA+0.2mg/LNAA培養(yǎng)基中誘導生根培養(yǎng)。(3)單倍體植株的鑒定當根長約為0.5cm～1.0cm時，在上午9:00～12:00取樣，用蒸餾水仔細洗去根上殘存的培養(yǎng)基。用0.2％秋水仙素、飽和對二氯苯對根尖分別進行預處理：1.5h-4.0h。將預處理好的根尖放入到卡諾氏液(冰乙酸1份，無水乙醇3份)中固定2～4h。然后根尖經(jīng)70％的酒精轉入蒸餾水中漂洗5～6遍，洗去表面的酒精，使著色更加充分，在1mol/LHCl中處理2～3min，用蒸餾水漂洗5～6遍后，用刀片把根尖的分生區(qū)切下并移至載玻片上，用刀片將分生區(qū)壓扁，滴上1～2滴卡寶品紅，染色5～10min。然后進行壓片和制片。將制好的裝片在光學顯微鏡60×和100×的油鏡下進行染色體數(shù)目的觀察、計數(shù)和顯微拍照。發(fā)現(xiàn)用飽和對二氯苯溶液對白樺的根尖進行預處理4h，染色體收縮效果最佳，且最分散。共查到有3個株系染色體數(shù)是14條。本發(fā)明中所用的培養(yǎng)基都先調整pH值為5.8，經(jīng)過高溫高壓滅菌(121℃、1.5個大氣壓、15分鐘)后使用的。本發(fā)明的培養(yǎng)環(huán)境是在常規(guī)組織培養(yǎng)室(溫度24～26℃，光照強度1000～1500Lx,光/暗周期16h/8h,濕度60％～70％)中進行的。本發(fā)明的特點：1、快速獲得大量干凈無雜質、無菌白樺花藥，為白樺花藥培養(yǎng)提供了充足的外植體材料，極大提高了接種效率。2、建立了花藥再生培養(yǎng)體系，為白樺單倍體育種及基礎研究奠定基礎。3、建立了白樺組織培養(yǎng)植株根尖染色體雜片技術。附圖說明：圖1普通豆?jié){機的主要組成：刀片、杯和電機圖2經(jīng)豆?jié){機粉碎雄穗后經(jīng)網(wǎng)篩篩選，并接種的白樺花藥圖3花藥愈傷組織的誘導：A、B分別為在MS+40mg/L蔗糖+3.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT、MS+40mg/L蔗糖+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT條件下誘導的愈傷組織；C為B中愈傷組織在同樣條件下繼代培養(yǎng)的愈傷組織圖4花藥愈傷組織在30mg/L蔗糖+2.0mg/LBA+0.5mg/LKT條件下分化的不定芽圖5經(jīng)根尖染色體制片技術觀察到的染色體圖片具體實施方式實例1、小孢子處于單核靠邊期白樺花藥的大量獲得在2014和2015年8月下旬到9月初，采集東北林業(yè)大學校內的白樺雄花穗，取出花藥，用卡諾固定液固定。然后紅醋酸洋紅觀察花藥中小孢子的發(fā)育情況。當小孢子發(fā)育到單核靠邊期時,采集雄穗在超凈工作臺用70％酒精消毒3分鐘后，用滅菌的蒸餾書沖洗5遍，用滅菌濾紙將雄穗上的水吸干凈。普通豆?jié){機的杯子和刀片也事先在超凈工作臺內用70％酒精經(jīng)消毒。將花穗放入豆?jié){機的杯中，擰上刀片，然后拿出超凈工作臺，插入電機粉碎。再在超凈工作臺內分別以40目和60目網(wǎng)篩過篩,除去大于和小于花藥的雜質，獲得大量無雜質、無菌花藥。實例2、花藥植株再生將上述獲得的花藥接種到添加40g/L蔗糖和0-3.0mg/L2,4-D，0.5mg/LKT的MS培養(yǎng)基中誘導愈傷組織。培養(yǎng)4周后，調查發(fā)現(xiàn)在40mg/L蔗糖+3.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT條件下獲得的愈傷組織最多，但有大量不定根產(chǎn)生，不能繼代培養(yǎng)；在40mg/L蔗糖+2.0mg/L2,4-D+0.5mg/LKT條件下獲得的愈傷組織誘導率為31.5％，雖然不是最多，但生長松散，且在同樣條件下繼代仍然生長良好(見表1)。然后轉入添加0.5-2.0mg/LBA，0.1-0.5mg/LNAA，30g/L蔗糖的MS培養(yǎng)基進行分化。培養(yǎng)6周后，在30mg/L蔗糖+2.0mg/LBA+0.5mg/LKT最多(見表2)。分化出的不定芽在WPM+0.4mg/LIBA+0.2mg/LNAA培養(yǎng)基中誘導生根培養(yǎng)。表1白樺花藥接種4周后誘導的愈傷組織注：“-”表示愈傷組織生長不好；“+”表示愈傷組織生長較好。表2愈傷組織培養(yǎng)6周后的再分化實例3、單倍體植株的鑒定當根長約為0.5cm～1.0cm時，在上午9:00～12:00取樣，每個植株取5個以上的根尖，浸泡于蒸餾水中，仔細洗去根上殘存的培養(yǎng)基，然后用對根用0.2％秋水仙素、飽和對二氯苯對根尖進行預處理1.5-4.0h。之后用于蒸餾水漂洗5～6遍，放在1mol/LHCl中處理2～3min進行解離。解離后的根尖用蒸餾水漂洗5～6遍后，用刀片把根尖的分生區(qū)切下并移至載玻片上，用刀片將分生區(qū)壓扁，滴上1～2滴卡寶品紅，染色5～10min后，將材料輕輕蓋上蓋玻片，防止空氣進入，用濾紙吸干多余的染液，并用鉛筆的橡皮頭輕輕敲擊蓋玻片，使細胞均勻分散。將制好的裝片分別在光學顯微鏡60×和100×的油鏡下進行染色體數(shù)目觀察、計數(shù)，并對理想的分裂相拍照。比較發(fā)現(xiàn)：用飽和對二氯苯預處理根尖4h時，染色體收縮較好，且較分散(見表3、4)。最終共獲得3個染色體數(shù)為14條的單倍體株系。表3白樺根尖用2％秋水仙素處理表4白樺根尖用飽和對二氯苯預處理