植物系統(tǒng)性侵染病害藥物的篩選方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種藥物篩選的方法，具體涉及一種植物系統(tǒng)性侵染病害藥物的篩選 方法。屬于植物保護生物測定技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物系統(tǒng)性侵染病害是指侵染植物的整個生命系統(tǒng)和維管束組織的病害，這類病 害在植物中廣泛存在，病原物存活于寄主植株體內(nèi)，該類病害局部侵染系統(tǒng)傳播，遍及全 株。引起該類病害的病原主要有細菌、病毒和類病毒。其中種類最多的主要是病毒性病害， 細菌性病害大多是尚不能體外人工培養(yǎng)的，危害最重的當屬由韌皮部桿菌侵染引起的柑橘 黃龍病和馬鈴薯斑馬紋病及由植原體侵染引起的棗瘋病和叢枝病等。不論是細菌還是病毒 或類病毒侵染引起的系統(tǒng)性病害目前均缺乏可供使用的防治藥物。造成藥物研發(fā)緩慢的最 主要限制因素是病原物未暴露在植株體外且不可人工培養(yǎng)，常規(guī)藥物采用噴施法無法穿透 植物細胞抵達病灶殺死或抑制病原物增殖，嚴重制約了相關(guān)病害的防治。
[0003] 為了縮短藥物篩選周期，對木本植物進行藥效的生物測定通常先選用草本寄主進 行實驗，以提高篩選效率。如篩選防治韌皮部桿菌和植原體的藥物通常選用長春花進行初 步篩選，一些病毒性病害常選用草本寄主茄科植物或豆科植物進行篩選。目前，系統(tǒng)性侵染 病害給藥的方法通常采用離體組織浸泡藥物后進行扦插或嫁接，存活后觀察發(fā)病情況并檢 測病原物含量，離體浸藥的弊端是不能實現(xiàn)活體系統(tǒng)給藥，扦插評測藥效的周期較長，扦插 苗長勢沒有實生苗好，存活率較低，且不利于以后田間藥物的施用，用藥前后的對比也不夠 直觀。
[0004] 系統(tǒng)性病害施藥困難，目前尚不能實現(xiàn)針對植株的系統(tǒng)性施藥，現(xiàn)階段急需一種 簡單高效的給藥方法，使藥物實現(xiàn)系統(tǒng)擴散，這樣既可以快速完成生物測定，又可以直觀看 出施用效果，從而正確評價藥物抑制病原物的效果，對系統(tǒng)性病害藥物篩選和應用具有重 要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種植物系統(tǒng)性侵染病害藥物 的篩選方法，其通過葉柄或枝條給藥從而進行藥物篩選。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[0007] 植物系統(tǒng)性侵染病害藥物的篩選方法，步驟如下：
[0008] (1)草本寄主的培育和傳病:播種草本寄主植物，待其幼苗高度生長至20~30cm， 接種病害，注意觀察直至病害癥狀開始表現(xiàn)，得到感病植株；
[0009] (2)微型輸液器準備:將注射器去除針頭和活塞后作為微型輸液器的注射針筒，安 裝針頭的接口部分朝下，將注射針筒豎直放置在比感病植株高的位置，注射針筒的針頭接 口處緊套一硅膠管，作為微型輸液器的輸液管；之后選一片成熟的葉片，切去葉片留下葉 柄，并將葉柄插入硅膠管的另一端，密封硅膠管與葉柄的連接處；
[0010] (3)藥物施用:將所選藥物溶液加入注射針筒中，用封口膜密封注射針筒頂端開口 處，并在封口膜上扎若干個孔，以防感病植株吸收藥物溶液時產(chǎn)生真空影響藥物施用效果， 用一個帶針頭的注射器在靠近葉柄切口處扎孔抽除輸液管內(nèi)的空氣，使得藥物溶液流至葉 柄切口處，拔掉針頭，立即用密封膠封堵扎出的針孔，藥物溶液持續(xù)處理3~5天后移除；
[0011] (4)抗病藥物篩選:2~3個月后觀察癥狀，通過實時熒光定量PCR檢測植株體內(nèi)病 原物的含量，進而分析所用藥物的效果。
[0012] 步驟(1)中，接種病害的方法為菟絲子傳毒，植物汁液摩擦或傳病昆蟲介體接種。
[0013] 接種病害方法的選擇原則是:細菌性系統(tǒng)侵染病害采用菟絲子傳毒，取一段20~ 30cm長的菟絲子纏繞在幼嫩的感病植株枝條上，待其定植后，牽出一段菟絲子纏繞至健康 長春花，定植后病原細菌即可傳播至健康植株，或者通過嫁接小枝段使健康長春花感病，快 速獲得足夠的病株以供藥物生物測定;病毒性或類病毒病害通過感病葉片汁液用金剛砂摩 擦健康草本寄主葉片進行接種；已發(fā)現(xiàn)傳播介體昆蟲的系統(tǒng)性侵染病害采用傳病昆蟲介體 進行接種。
[0014] 步驟(1)中，接種病害后應當每周觀察1次。
[0015] 步驟(2)中，注射針筒的具體安裝方法是:在感病植株主干旁1~2cm處插上一根竹 簽，將注射針筒用橡皮筋豎直固定在竹簽頂端，所述注射針筒的最高處比感病植株高至少 3cm〇
[0016] 所述注射器為一次性注射器，根據(jù)藥物溶液的用量選擇注射器大小。
[0017] 步驟⑵中，硅膠管為透明的，其內(nèi)徑為2~5mm。
[0018] 步驟(2)中，葉柄至少保留3cm，葉柄插入硅膠管至少1 · 5cm。
[0019] 步驟(2)中，硅膠管與葉柄的連接處用中性固化硅酮密封膠(可選用犀利、百得和 道康寧等品牌的密封膠)密封，密封后靜置5分鐘。
[0020] 步驟(3)中，所述密封膠為中性固化硅酮密封膠(可選用犀利、百得和道康寧等品 牌的密封膠）。
[0021] 本發(fā)明的有益效果：
[0022] (1)本發(fā)明采用微型輸液的方式給感病寄主施藥，藥物可以系統(tǒng)擴散至全株，解決 了目前系統(tǒng)侵染病害藥物篩選時施藥困難的問題；
[0023] (2)本發(fā)明藥物篩選對象主要針對草本寄主，一定程度上解決了木本植物實驗周 期長，藥物篩選的進程緩慢的問題；
[0024] (3)本發(fā)明可用于抗生素、殺菌劑、干擾RNA、多肽類藥物和激素類藥物等的生物測 定，操作簡單易行，篩選方法快速，可以直觀準確的評價藥物的防控效果。
【附圖說明】
[0025] 圖1是本發(fā)明用于藥物篩選的微型輸液器示意圖。
[0026] 圖2是實施例1中不同藥物處理后韌皮部桿菌相對含量變化。
【具體實施方式】
[0027] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進行進一步的闡述，應該說明的是，下述說明僅 是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進行限定。
[0028]實施例1柑橘黃龍病抗生素藥物篩選
[0029] (1)網(wǎng)室中已萌發(fā)嫩芽的感病紐荷爾臍橙，待芽長至5cm時，取一段30cm長的草地 菟絲子將一段纏繞至臍橙嫩芽上，套上透明塑料袋保濕，避免陽光直射，約2周菟絲子開始 定植產(chǎn)生吸器；
[0030] (2)與此同時，將長春花(Catharanthus roseus(L. )G.Don)種子用自來水浸泡過 夜后，清洗3次，播種于育苗盆，待苗子長至2片真葉時移栽至盆中，株高20cm時去除頂芽使 其分枝生長，待新芽長至15cm時再去除頂芽。側(cè)芽萌發(fā)長至5cm時將生長至感病臍橙上的菟 絲子一端纏繞至長春花芽上，定植后2周移除菟絲子，每周觀察1次，直至病害癥狀開始表 現(xiàn)，感病的長春花可以通過嫁接頂芽或枝段侵染健康植株，快速大量獲得感病長春花植株；
[0031] (3)在感病長春花植株主干旁2cm的位置插一根長竹簽，將一個去除針頭部分和活 塞部分的5mL注射器用橡皮筋垂直固定在竹簽頂端，注射器底端高過植株3cm，安裝針頭的 接口部分朝下，小接口用內(nèi)徑2_的透明硅膠管連接，然后選一片成熟的葉片切去葉片留葉 柄，葉柄部分至少留3cm，將切好的葉柄插入輸液管另一端，至少1.5cm深，開口處用中性固 化硅酮密封膠密封，靜置5min;
[0032] (4)將空白對照(水），50、100yg/mL的羧芐青霉素水溶液、50、lOOyg/mL的四環(huán)素水 溶液和50、100yg/mL的硫酸鏈霉素水溶液分別加到做好標記的微型輸液器的5mL注射器中， 用封口膜密封注射器開口處，在膜上扎幾個孔，立即用一個帶針頭的注射器在靠近葉柄切 口處扎口抽除輸液管的空氣，使藥物流至葉柄切口處，拔掉針頭，立即用密封膠封堵針孔， 藥物持續(xù)處理3天后移除；
[0033] (5)3個月后取0.2g葉片中脈提取DNA，用Nanodrop測OD值將DNA稀釋至相同濃度， 用韌皮部桿菌亞洲種特異性引物卜印11^8(5'-06〇：061'1'1'(：06打61'-3'）和^?11^8(5'-AGCCTCTTTAAGCCCTAAATCAG-3'）（參考文獻：Teixeira D C, Saillard C，Couture C， Martins E C1WulffN AjEveillard-Jagoueix S,Yamamoto P T1Ayres A J1Bove J M.Distributionand quantification of Candidatus Liberibacter americanus,agent ofhuanglongbing disease of citrusinSao Paulo State,Brazil，in leaves of an affected sweet orange tree as determined by PCR[J].Molecular and Cellular Probes，2008，22(3): 139-150 ·)，以及內(nèi)參基因 18SF(5 ' -AATTGTTGGTCTTCAACGAGGAA-3 '）和 18SR(5'-AAAGGGCAGGGACGTAGTCAA-3'）（參考文獻：Brunner A,Yakovlev I ,Strauss S.Validating internal controls for quantitative plant gene expression studies [J] ·BMC plant biology，2004，4( I): 14·)通過實時熒光定量PCR檢測植株體內(nèi)病原物的含 量，檢測體系均為25yL，SYBiTPremix Ex Taq? II 12·5μL，10μΜ上下游引物各加0.8yL， DNA模板IyL，反應程序在Bio-rad實時熒光定量PCR儀上進行，95 °C預變性30s;然后95 °C變 性5s，63°C延伸30s并采集熒光，共40個循環(huán)。通過使用Bio-rad熒光定量PCR軟件IQ5計算相 對含量比較分析所用藥物的效果，試驗結(jié)果見圖2。
[0034]實施例2大豆花葉病毒SiRNA的施用
[0035] (1)網(wǎng)室中播種野生型大豆(Glycine max[L. ]Merr.cv.Bragg)，每盆播種2顆，出 芽后留取一株健壯苗，2周后用取兩片感染大豆花葉病毒（SMV)的葉片，用pH 7.0的 0.01 moI/L磷酸緩沖液(每克葉片加 IOmL磷酸緩沖液)加少量600目金剛砂研磨均勻作為接 種液，用棉簽蘸取接種液在成熟健康植株葉片上沿中脈摩擦接種，然后用自來水沖洗干凈， 3周后觀察發(fā)病情況；
[0036] (2)在感病大植株主干旁2cm的位置插一根長竹簽，將一個去除針頭部分和活塞 部分的5mL注射器用橡皮筋垂直固定在竹簽頂端，注射器底端至少高過植株3cm，安裝針頭 的接口部分朝下，針頭接口用內(nèi)徑2mm的透明硅膠管連接，然后選一片成熟的葉片切去葉片 留葉柄，葉柄部分至少留3cm，將切好的葉柄插入輸液管另一端，至少1.5cm深，開口處用中 性固化硅酮密封膠密封，靜置5min;
[0037] (3)將大豆花葉病毒外殼蛋白片段616bp的siRNA水溶液(參考文獻：章潔瓊，李紅 艷，胡小南，等.農(nóng)桿菌介導的RNAi CP基因在大豆中的轉(zhuǎn)化[J].作物學報，2013,39(9): 1594-1601.)分別加到微型輸液器的IOmL注射器中，用封口膜密封注射器開口處，在膜上扎 幾個孔，立即用一個帶針頭的注射器在靠近葉柄切口處扎孔抽除輸液管的空氣，使藥物流 至葉柄切口處，拔掉針頭，立即用密封膠封堵針孔，藥物持續(xù)處理2周后，觀察大豆新長出葉 片癥狀的表現(xiàn)。

[0039]上述雖然結(jié)合附圖對本發(fā)明的【具體實施方式】進行了描述，但并非對本發(fā)明保護范 圍的限制，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做 出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍以內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 植物系統(tǒng)性侵染病害藥物的篩選方法，其特征在于，步驟如下： (1) 草本寄主的培育和傳病:播種草本寄主植物，待其幼苗高度生長至20~30cm，接種 病害，注意觀察直至病害癥狀開始表現(xiàn)，得到感病植株； (2) 微型輸液器準備:將注射器去除針頭和活塞后作為微型輸液器的注射針筒，安裝針 頭的接口部分朝下，將注射針筒豎直放置在比感病植株高的位置，注射針筒的針頭接口處 緊套一硅膠管，作為微型輸液器的輸液管;之后選一片成熟的葉片，切去葉片留下葉柄，并 將葉柄插入硅膠管的另一端，密封硅膠管與葉柄的連接處； (3) 藥物施用：將所選藥物溶液加入注射針筒中，用封口膜密封注射針筒頂端開口處， 并在封口膜上扎若干個孔，以防感病植株吸收藥物溶液時產(chǎn)生真空影響藥物施用效果，用 一個帶針頭的注射器在靠近葉柄切口處扎孔抽除輸液管內(nèi)的空氣，使得藥物溶液流至葉柄 切口處，拔掉針頭，立即用密封膠封堵扎出的針孔，藥物溶液持續(xù)處理3~5天后移除； (4) 抗病藥物篩選:2~3個月后觀察癥狀，通過實時熒光定量PCR檢測植株體內(nèi)病原物 的含量，進而分析所用藥物的效果。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(1)中，接種病害的方法為菟絲子 傳毒，植物汁液摩擦或傳病昆蟲介體接種。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的篩選方法，其特征在于，接種病害方法的選擇原則是:細菌性 系統(tǒng)侵染病害米用英絲子傳毒，取一段20~30 cm長的英絲子纏繞在幼嫩的感病植株枝條 上，待其定植后，牽出一段菟絲子纏繞至健康長春花，定植后病原細菌即可傳播至健康植 株，或者通過嫁接小枝段使健康長春花感病，快速獲得足夠的病株以供藥物生物測定;病毒 性或類病毒病害通過感病葉片汁液用金剛砂摩擦健康草本寄主葉片進行接種;已發(fā)現(xiàn)傳播 介體昆蟲的系統(tǒng)性侵染病害采用傳病昆蟲介體進行接種。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(1)中，接種病害后應當每周觀察 1次。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，注射針筒的具體安裝方法 是:在感病植株主干旁1~2cm處插上一根竹簽，將注射針筒用橡皮筋豎直固定在竹簽頂端， 所述注射針筒的最高處比感病植株高至少3cm。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述注射器為一次性注射器，根據(jù)藥 物溶液的用量選擇注射器大小。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，硅膠管為透明的，其內(nèi)徑 為2~5mm〇8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，葉柄至少保留3cm，葉柄插 入硅膠管至少1 · 5cm〇9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(2)中，硅膠管與葉柄的連接處用 中性固化硅酮密封膠密封，密封后靜置5分鐘。10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟(3)中，所述密封膠為中性固化 娃酮密封膠。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種植物系統(tǒng)性侵染病害藥物的篩選方法，該方法可針對植株進行系統(tǒng)性施藥，解決系統(tǒng)性病害施藥困難的問題。本發(fā)明包括植株的培育、傳病、藥物施用和篩選。本發(fā)明以系統(tǒng)感染細菌性病害或病毒性病害的草本寄主為試材，給藥方法簡便易行，可使藥物實現(xiàn)系統(tǒng)擴散，能直觀反映和正確評價藥物抑制病原物的效果，對系統(tǒng)性病害藥物篩選和應用具有重要意義。
【IPC分類】A01H1/04
【公開號】CN105706916
【申請?zhí)枴緾N201610122538
【發(fā)明人】蘇華楠, 易龍, 鐘八蓮, 盧占軍, 黃愛軍
【申請人】贛南師范學院