一種滁菊株系離體再生的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物生物技術領域，具體涉及一種滁菊株系離體再生的方法。
【背景技術】
[0002]源菊(DendranthemamorifoliumCV.‘chuju’)，是菊科菊屬多年生草本植物，主要產(chǎn)于安徽滁州，因此又被叫做安徽滁菊。以花入藥，屬安徽省四大著名道地藥材，名列全國四大藥菊之首，屬藥、茶兼用佳品，具有極高的藥用、保健價值。
[0003]現(xiàn)代藥理檢測分析表明，滁菊富含黃酮、揮發(fā)油和8種人體必需氨基酸;此外，滁菊中富含鋅和砸等10種微量元素，其中“砸”的含量顯著高于其它菊花品種。由于鋅和砸為人體必不可少的兩種微量元素，參與機體的多種代謝過程，在清除人體自由基，保護心血管，預防動脈粥樣硬化，調(diào)節(jié)血糖及保護肝臟等方面具有重要作用。由于滁菊富含上述有效成分，長期飲用滁菊可以清熱解毒、舒筋活血、護肝明目、增強人體免疫力；同時對高血壓，冠心病，動脈硬化療效顯著。
[0004]研究還發(fā)現(xiàn)滁菊對SRAS病毒、癌癥(尤其是肝癌)等具有良好的預防作用，對糖尿病也具有明顯的治療作用。近年來，隨著滁菊藥用和保健價值的不斷深入研究及國家標準《原產(chǎn)地域產(chǎn)品滁菊》的實施，市場對滁菊的需求量越來越大，使得滁菊的產(chǎn)業(yè)化栽培發(fā)展面臨著前所未有的機遇。但缺乏高效的優(yōu)質(zhì)種苗繁育技術，成為制約其產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的瓶頸。
[0005]在生產(chǎn)上，滁菊的繁殖主要采用分株、壓條和嫁接等傳統(tǒng)的無性繁殖手段。繁殖過程分別存在繁殖數(shù)量有限，管理不便及繁殖過程繁瑣等問題；同時由于多年的田間栽培，使滁菊面臨著品種退化、產(chǎn)量降低、品質(zhì)變劣和病蟲害嚴重等問題。采用常規(guī)育種方法對滁菊進行品種改良，遠不能適用菊農(nóng)對品種產(chǎn)量和品質(zhì)的要求。而采用組培快繁技術，可在短期內(nèi)獲得大量的、遺傳背景一致的優(yōu)良種苗，以滿足規(guī)?；N植對滁菊優(yōu)質(zhì)種苗的需求。另外，在此基礎上對滁菊優(yōu)良品種進行相應的遺傳改良研究也迫在眉睫。
[0006]目前有關滁菊組培再生的研究較少，主要以利用葉片為外植體，通過間接誘導愈傷組織的對滁菊進行快繁或通過莖尖繁殖培養(yǎng)脫毒滁菊，普遍存在繁殖系數(shù)低的問題。因此，針對當前滁菊繁育過程中所存在的諸多問題，急需開發(fā)一種滁菊株系離體再生的方法，以滿足對滁菊優(yōu)良株系的快速繁殖和品種改良的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于運用植物組織培養(yǎng)技術，提供一種滁菊株系離體再生的方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案:一種滁菊株系離體再生的方法，包括以下步驟:
[0008](I)取田滁菊株系的新生未木質(zhì)化的帶腋芽莖段為外植體，對其表面進行消毒處理；
[0009](2)將莖段接種于不定芽誘導培養(yǎng)基中，進行I?2周光照培養(yǎng)，待莖段腋芽萌發(fā)，并在腋芽周邊誘導出不定芽叢；
[0010](3)培養(yǎng)2?3周后，將帶有不定芽叢的莖段轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基中進行不定芽的增殖和伸長培養(yǎng)；
[0011](4)待芽長至2?3cm，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中進行生根；
[0012](5)光照培養(yǎng)3?4周，待幼苗長至3?4cm并帶有2?4片真葉時，進行煉苗并移栽，獲得滁菊再生植株。
[0013]優(yōu)選地，所述步驟(I)的莖段為取材于田間篩選出的滁菊優(yōu)良株系新生的未木質(zhì)化枝條。
[0014]優(yōu)選地，所述步驟(I)的中所述的帶腋芽莖段為外植體經(jīng)初步消毒后，于無菌操作臺內(nèi)進行表面消毒。
[0015]優(yōu)選地，所述初步消毒是指莖段去葉后分裝于500ml燒杯中，于流水下沖洗10?20min，期間添加I?2ml洗滌液沖洗，并不斷搖晃。
[0016]優(yōu)選地，所述莖段表面消毒是指莖段剪切成4?6cm大小，于無菌操作臺中，經(jīng)無菌水沖洗2?3遍;再用75%酒精進行表面消毒10?30s，無菌水沖洗3?5遍;之后再經(jīng)0.1%的HgCl2消毒I?3min，最后用無菌水沖洗6?8遍，消毒期間不停地搖動。
[0017]優(yōu)選地，所述步驟(2)中，用于接種的莖段是指莖段在接種前切去兩端消毒損傷部位，然后切成0.3?0.6cm大小的切段備用，每個切段帶至少帶有一個腋芽。
[0018]優(yōu)選地，所述步驟(2)中，莖段接種方式為豎直放置于不定芽誘導培養(yǎng)基中。
[0019]優(yōu)選地，所述步驟(2)中，所述誘導培養(yǎng)基包括:MS+0.2?2.0mg/L 6_BA+30g/L蔗糖+7.0g/L 瓊脂，pH=5.8。
[0020]優(yōu)選地，所述步驟(3)中，所述增殖培養(yǎng)基包括:MS+0.I?0.75mg/L 6-BA+0.0?
0.5mg/L NAA+30g/L鹿糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8。
[0021 ] 優(yōu)選地，所述步驟(3)中，所述生根培養(yǎng)基包括:1/2MS+0.0?1.0mg/L IBA+20g/L鹿糖+7.0g/L 瓊脂，pH=5.8。
[0022]本發(fā)明所提供的一種滁菊株系離體再生的方法，具體涉及以滁菊野外優(yōu)良株系當年生枝條的未木質(zhì)化莖段為外植體，通過直接誘導叢生芽再生對滁菊優(yōu)良株系進行高效快速繁殖。
[0023]本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點:
[0024]其一，莖段為取材于野外多年生滁菊優(yōu)良株系的新生未木質(zhì)化的枝條，一方面能保持母本植株的種質(zhì)特性;另一方面取材方便、材料豐富;可以實現(xiàn)對野外滁菊優(yōu)良單株的快繁，實現(xiàn)品種培育；
[0025]其二，再生過程中外植體消毒程序簡單，消毒時間短，對外植體的毒害較??；
[0026]其三，叢生芽再生效率高，誘導率最高達到100 % ；
[0027]其四，再生速度快，繁殖系數(shù)高，且能實現(xiàn)對獲得的無菌苗莖段進行進一步的擴大繁殖，為優(yōu)良滁菊株系的快速繁殖和遺傳改良提供了重要的技術支持。
[0028]因此，本發(fā)明所提供的滁菊株系離體再生的方法，不僅為滁菊優(yōu)良株系的快速繁殖和規(guī)?；a(chǎn)提供了技術支撐，同時也為后期滁菊的品種改良奠定了基礎。
【附圖說明】
[0029]圖1滁菊莖段腋芽的萌發(fā)
[0030]圖2莖段腋芽處不定芽叢的誘導
[0031]圖3不定芽芽的增殖和伸長
[0032]圖4不定芽生根
[0033]圖5滁菊再生植株的煉苗、馴化
【具體實施方式】
[0034]下面結合實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0035]實施例1
[0036]—種滁菊株系離體再生的方法，具體操作如下:
[0037]1、從大田選取生長良好的多年生滁菊優(yōu)良株系，剪取新生的20d苗齡的未木質(zhì)化的枝條；
[0038]2、去葉后，分裝于500ml燒杯中添加Iml洗滌劑，于流水沖洗1min;然后剪切成4cm大小的莖段，于無菌操作臺中，用無菌水沖洗3遍后用75%酒精消毒20s，無菌水沖洗5遍，之后用0.1%的升汞消毒lmin，最后用無菌水沖洗6遍，消毒期間不停的搖動。消毒后將莖段兩端壞死部位切除，再將莖段切成0.3cm左右的切段備用；
[0039]3、將莖段切段豎直接種于不定芽誘導培養(yǎng)基中進行腋芽的萌發(fā)和不定芽的誘導，經(jīng)過第I周的光照培養(yǎng)后莖段腋芽萌發(fā)，再光照培養(yǎng)I周后腋芽周邊誘導出不定芽叢，腋芽萌發(fā)率為100%，不定芽的誘導率為85.7% ;不定芽誘導培養(yǎng)基為MS+0.2mg/L 6_BA+30g/L鹿糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8 ；
[0040]4、繼續(xù)培養(yǎng)2周后，將不定芽叢轉(zhuǎn)接于不定芽增殖培養(yǎng)基中進行不定芽的增殖和伸長培養(yǎng)，光照培養(yǎng)3周后獲得大量伸長的不定芽叢，平均每個外植體產(chǎn)生5.8個不定芽;不定芽增殖培養(yǎng)基為:MS+0.lmg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8。
[0041]5、將高度為2?3cm的不定芽轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，獲得伴有細長根系的完整再生植株，滁菊無菌苗生根率高達100 %，生根培養(yǎng)基為:l/2MS+20g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂，pH=5.8；
[0042]6、光照培養(yǎng)3?4周，待幼苗長至3?4cm并帶有2?4個真葉時，進行煉苗和移栽，獲得健壯的滁菊再生植株。
[0043]實施例2
[0044]—種滁菊株系離體再生的方法，具體操作如下:
[0045]1、從大田選取生長良好的多年生滁菊優(yōu)良株系，剪取新生的30d苗齡的未木質(zhì)化的枝條；
[0046]2、去葉后，分裝于500ml燒杯中添加2ml洗滌劑，于流水沖洗15min;然后剪切成5cm大小的莖段，于無菌操作臺中，用無菌水沖洗3遍后用75%酒精消毒10s，無菌水沖洗3遍，之后用0.1%的升汞消毒2min，最后用無菌水沖洗7遍，消毒期間不停的搖動。消毒后將莖段兩端壞死部位切除，再將莖段切成0.4cm左右的切段備用；
[0047]3、將莖段切段豎直接種于不定芽誘導培養(yǎng)基中進行腋芽的萌發(fā)和不定芽的誘導，經(jīng)過第I周的光照培養(yǎng)后莖段腋芽萌發(fā)(圖1)，再光照培養(yǎng)I周后腋芽周邊誘導出不定芽叢(圖2)，腋芽萌發(fā)率為100%，不定芽的誘導率為100%;不定芽誘導培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L 6-BA+30g/L鹿糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8 ；
[0048]4、繼續(xù)培養(yǎng)2周后，將不定芽叢轉(zhuǎn)接于不定芽增殖培養(yǎng)基中進行不定芽的增殖和伸長培養(yǎng)，光照培養(yǎng)3周后獲得大量伸長的不定芽叢(圖3)，平均每個外植體產(chǎn)生11.5個不定芽;不定芽增殖培養(yǎng)基為:MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8；
[0049]5、將高度為2?3cm的不定芽轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，獲得完整的再生植株(圖4)，滁菊無菌苗生根率為100%，根系長而健壯，生根培養(yǎng)基為:1/2MS+0.2mg/L IBA+20g/L鹿糖+7.5g/L瓊脂，pH=5.8 ；
[0050]6、光照培養(yǎng)3?4周，待幼苗長至3?4cm并帶有2?4個真葉時，進行煉苗和移栽，獲得健壯的滁菊再生植株(圖5)。
[0051 ] 實施例3
[0052]一種滁菊株系離體再生的方法，具體操作如下:
[0053]1、從大田選取生長良好的多年生滁菊優(yōu)良株系，剪取新生的45d苗齡的未木質(zhì)化的枝條；
[0054]2、去葉后，分裝于500ml燒杯中添加2ml洗滌劑，于流水沖洗20min;然后剪切成6cm大小的莖段，于無菌操作臺中，用無菌水沖洗2遍后用75%酒精消毒30s，無菌水沖洗4遍，之后用0.1%的升汞消毒3min，最后用無菌水沖洗8遍，消毒期間不停的搖動。消毒后將莖段兩端壞死部位切除，再將莖段切成0.6cm左右的切段備用；
[0055]3、將莖段切段豎直接種于不定芽誘導培養(yǎng)基中進行腋芽的萌發(fā)和不定芽的誘導，經(jīng)過第I周的光照培養(yǎng)后莖段腋芽萌發(fā)，再光照培養(yǎng)I周后腋芽周邊誘導出不定芽叢，腋芽萌發(fā)率為100%，不定芽的誘導率為80%;不定芽誘導培養(yǎng)基為MS+2.0mg/L 6_BA+30g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8 ；
[0056]4、繼續(xù)培養(yǎng)2周后，將不定芽叢轉(zhuǎn)接于不定芽增殖培養(yǎng)基中進行不定芽的增殖和伸長培養(yǎng)，光照培養(yǎng)3周后獲得大量伸長的不定芽叢，平均每個外植體產(chǎn)生7.6個不定芽;不定芽增殖培養(yǎng)基為:MS+0.75mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8 ；
[0057]5、將高度為2?3cm的不定芽轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，獲得完整的再生植株，滁菊無菌苗生根率為100%，根多而短粗，生根培養(yǎng)基為:1/2MS+1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+7.5g/L 瓊脂，ρΗ=5.8;
[0058]6、光照培養(yǎng)3?4周，待幼苗長至3?4cm并帶有2?4個真葉時，進行煉苗和移栽，獲得健壯的滁菊再生植株。
[0059]實施例4
[0060]一種滁菊株系離體再生的方法，具體操作如下:
[0061]1、取所獲得的苗齡滁菊優(yōu)良株系組培無菌苗的莖段，切成0.4cm大小，每個莖段至少帶一個腋芽；
[0062]2、將莖段切段豎直接種于不定芽誘導培養(yǎng)基中進行腋芽的萌發(fā)和不定芽的誘導，經(jīng)過2周的光照培養(yǎng)，腋芽萌發(fā)并在腋芽周邊誘導出不定芽叢，不定芽的誘導率為100%;不定芽誘導培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8;
[0063]3、繼續(xù)培養(yǎng)2周后，將不定芽叢轉(zhuǎn)接于不定芽增殖培養(yǎng)基中進行不定芽的增殖和伸長培養(yǎng)，光照培養(yǎng)3周后獲得大量伸長的不定芽，平均每個外植體產(chǎn)8.0個不定芽;不定芽增殖培養(yǎng)基為:MS+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8 ；
[0064]將高度為2?3cm的不定芽轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，獲得完整的再生植株，滁菊無菌苗生根率為100%，根系長而健壯，生根培養(yǎng)基為:l/2MS+0.2mg/L IBA+20g/L蔗糖+7.5g/L 瓊脂，ρΗ=5.8;
[0065]5、將上述滁菊無菌苗的莖段切成0.5cm大小，每個莖段帶有至少一個腋芽，接種于上述不定芽誘導和增殖培養(yǎng)基中進行不定芽的誘導和增殖，平均每個莖段可產(chǎn)生12個左右不定芽;并將增殖后的不定芽接種于上述相同的伸長和生根培養(yǎng)基中進行不定芽的伸長和生根培養(yǎng)；
[0066]6、光照培養(yǎng)3?4周，待幼苗長至3?4cm并帶有2?4個真葉時，進行煉苗和移栽，獲得健壯的滁菊再生植株。
[0067]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權項】
1.一種滁菊株系離體再生的方法，其特征在于:包括以下步驟: (1)取田滁菊株系的新生未木質(zhì)化的帶腋芽莖段為外植體，對其表面進行消毒處理； (2)將莖段接種于不定芽誘導培養(yǎng)基中，進行I?2周光照培養(yǎng)，待莖段腋芽萌發(fā)，并在腋芽周邊誘導出不定芽叢； (3)培養(yǎng)2?3周后，將帶有不定芽叢的莖段轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基中進行不定芽的增殖和伸長培養(yǎng)； (4)待芽長至2?3cm，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中進行生根； (5)光照培養(yǎng)3?4周，待幼苗長至3?4cm并帶有2?4片真葉時，進行煉苗并移栽，獲得滁菊再生植株。2.根據(jù)權利要求1所述的一種滁菊株系離體再生的方法，其特征在于:所述步驟(I)的莖段為取材于田間篩選出的滁菊優(yōu)良株系新生的未木質(zhì)化枝條。3.根據(jù)權利要求1所述的一種滁菊株系離體再生的方法，其特征在于，所述步驟(I)的中所述的帶腋芽莖段為外植體經(jīng)初步消毒后，于無菌操作臺內(nèi)進行表面消毒。4.根據(jù)權利要求3所述的一種滁菊株系離體再生的方法，其特征在于，所述初步消毒是指莖段去葉后分裝于500ml燒杯中，于流水下沖洗10?20min，期間添加I?2ml洗滌液沖洗，并不斷搖晃。5.根據(jù)權利要求3所述的一種滁菊株系離體再生的方法，其特征在于，所述莖段表面消毒是指莖段剪切成4?6cm大小，于無菌操作臺中，經(jīng)無菌水沖洗2?3遍;再用75 %酒精進行表面消毒10?30s,無菌水沖洗3?5遍;之后再經(jīng)0.1%的HgCl2消毒I?3min，最后用無菌水沖洗6?8遍，消毒期間不停地搖動。6.根據(jù)權利要求1所述的一種滁菊株系離體再生的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，用于接種的莖段是指莖段在接種前切去兩端消毒損傷部位，然后切成0.3?0.6cm大小的切段備用，每個切段帶至少帶有一個腋芽。7.根據(jù)權利要求1所述的一種滁菊株系離體再生的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，莖段接種方式為豎直放置于不定芽誘導培養(yǎng)基中。8.根據(jù)權利要求1所述的一種滁菊株系離體再生的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，所述誘導培養(yǎng)基包括:MS+0.2?2.0mg/L 6_BA+30g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8。9.根據(jù)權利要求1所述的一種滁菊株系離體再生的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，所述增殖培養(yǎng)基包括:MS+0.I ?0.75mg/L 6-BA+0.0?0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+7.0g/L瓊月旨，ρΗ=5.8。10.根據(jù)權利要求1所述的一種滁菊株系離體再生的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，所述生根培養(yǎng)基包括:1/2MS+0.0?1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+7.0g/L瓊脂，pH=5.8。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種滁菊株系離體再生的方法，取田間滁菊株系的新生未木質(zhì)化的帶腋芽莖段為外植體，對其表面進行消毒處理；將莖段接種于不定芽誘導培養(yǎng)基中，1～2周光照培養(yǎng)，待莖段腋芽萌發(fā)，并在腋芽周邊誘導出不定芽叢；培養(yǎng)2～3周，將帶有不定芽叢的莖段轉(zhuǎn)接于增殖培養(yǎng)基中進行不定芽的增殖和伸長培養(yǎng)；待芽長至2～3cm，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中進行生根；光照培養(yǎng)3～4周，待幼苗長至3～4cm并帶有2～4片真葉時，進行煉苗并移栽，獲得滁菊再生植株。本發(fā)明具有繁殖速度快，繁殖系數(shù)高，一次擴大培養(yǎng)后，平均每個外植體至少產(chǎn)生數(shù)十個叢生芽，保持滁菊母本植株優(yōu)良特性；為優(yōu)良滁菊株系快速規(guī)?；敝澈瓦z傳改良提供技術支持。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105706933
【申請?zhí)枴緾N201610124391
【發(fā)明人】侯金艷, 吳麗芳, 馬朝東
【申請人】中國科學院合肥物質(zhì)科學研究院