本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人工誘導(dǎo)鐵皮石斛在組培瓶內(nèi)開花的方法。

背景技術(shù)：
鐵皮石斛（Dendrobiumofficinale）又稱黑節(jié)草，為蘭科植物石斛屬多年生草本植物。鐵皮石斛是石斛中的極品，是著名的觀賞兼藥用蘭花，鐵皮石斛花朵也是市場上奇貨可居的具有保健作用的名貴花茶原材料。然而在自然環(huán)境下，由于其對生境條件要求苛刻，鐵皮石斛難開花、開花周期長、花量少，成為鐵皮石斛花茶和花卉產(chǎn)業(yè)開發(fā)的瓶頸難題。因此，人工誘導(dǎo)鐵皮石斛植株峰量開花對鐵皮石斛花茶和花卉產(chǎn)業(yè)有著重要的商業(yè)價(jià)值，同時(shí)對研究鐵皮石斛開花機(jī)理也有重要的意義。而現(xiàn)有的應(yīng)用生物技術(shù)對誘導(dǎo)鐵皮石斛開花的技術(shù)體系，雖可獲得一定的開花誘導(dǎo)率，但有毒物質(zhì)殘留、成本高等問題大大限制了其市場推廣價(jià)值。如中國專利CN102577963B公開的一種誘導(dǎo)鐵皮石斛開花的方法，包括以下步驟：采用鐵皮石斛莖段離體培養(yǎng)的原球莖為試驗(yàn)材料，進(jìn)行壯苗培養(yǎng)50~80d，再經(jīng)過誘導(dǎo)開花階段I—誘導(dǎo)開花階段II—誘導(dǎo)開花階段I的交替培養(yǎng)誘導(dǎo)后，進(jìn)入開花培養(yǎng)階段。在誘導(dǎo)開花階段I中，培養(yǎng)基I為：1/2MS基本培養(yǎng)基+PP3330.50~1.50mg/L+ABA0.5~1.0mg/L，使用了PP333作為植物生長調(diào)節(jié)劑。又如中國專利CN103210842B公開的一種鐵皮石斛試管開花及結(jié)實(shí)的方法，采用鐵皮石斛莖段或鐵皮石斛蒴果（鐵皮石斛蒴果為合生心皮的復(fù)雌蕊發(fā)育成的果實(shí)，子房1室或多室，每室有多粒鐵皮石斛種子）作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，再經(jīng)原球莖增殖培養(yǎng)、原球莖生根培養(yǎng)、生根苗誘導(dǎo)開花培養(yǎng)及授粉過程及結(jié)實(shí)培養(yǎng)后，形成試管花及試管果實(shí)。在生根苗誘導(dǎo)開花培養(yǎng)時(shí)，將生根苗接種于下列誘導(dǎo)開花培養(yǎng)基中：MS+白糖30~60g/L+瓊脂粉5.5~11g/L+土豆30~50g/L+BA0.2~0.6mg/L+NAA0.1~0.9mg/L+PPP3330.3~0.8mg/L+Spm1.0~6.0mmol/L+ZT1.5~6mg/L，其中也使用到了PP333。PP333又叫多效唑，是一種植物生長調(diào)節(jié)劑，具有延緩植物生長，抑制莖桿伸長，縮短節(jié)間、促進(jìn)植物分蘗、增加植物抗逆性能，提高產(chǎn)量等效果。但多效唑在植物中代謝慢，易產(chǎn)生殘留超標(biāo)的問題，且它對人體和環(huán)境的危害，目前已經(jīng)被證實(shí)。因而食用多效唑誘導(dǎo)的花茶，易讓人們產(chǎn)生安全性的焦慮。有鑒于此，現(xiàn)有技術(shù)需要提供一種新的人工誘導(dǎo)鐵皮石斛在開花的方法，使鐵皮石斛的開花率提高，但又不產(chǎn)生藥物殘留的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明意在提供一種鐵皮石斛在組培瓶內(nèi)開花的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)的鐵皮石斛開花率低、有害化合物殘留的問題。本發(fā)明中一種人工誘導(dǎo)鐵皮石斛在組培瓶內(nèi)開花的方法，包括以下步驟：步驟1）：外植體的滅菌消毒：用無菌水將鐵皮石斛蒴果表面的臟物沖洗干凈，將鐵皮石斛蒴果置于75%乙醇中浸15s，再放入0.1%的升汞溶液中浸15min后，用無菌水沖洗4～5次，每次沖洗5min，備用；步驟2）：無菌萌發(fā)及幼苗生長：用無菌濾紙擦干蒴果表面水后，切開蒴果，將種子取出接種于萌發(fā)培養(yǎng)基中，萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2MS固體培養(yǎng)基添加0.2～1.0mg/L萘乙酸、6.5～8.5g/L瓊脂、15～30g/L蔗糖；接種后搖動(dòng)，使種子均勻散布于培養(yǎng)基中，封口，將接種后的組培瓶移入培養(yǎng)室，培養(yǎng)溫度22～28℃，光強(qiáng)1200～2000lx、相對濕度65～80%、每天光照11～16h，5～8d后種子開始萌發(fā)，30~45d后長成2～3cm的幼苗；步驟3）：生根壯苗培養(yǎng)：將步驟2）中的幼苗轉(zhuǎn)接至生根壯苗培養(yǎng)基中；壯苗培養(yǎng)基為1/2MS固體培養(yǎng)基添加3.5～4.5mg/L萘乙酸、0～10%土豆、6.5～8.5g/L瓊脂、15～30g/L蔗糖；在溫度22～28℃，光強(qiáng)1200～2000lx、相對濕度65～80%、光照14～16h/d，60～80d后長成成苗；步驟4）：誘導(dǎo)開花：將步驟3）中的成苗轉(zhuǎn)接至開花培養(yǎng)基中，開花培養(yǎng)基為1/2MS固體培養(yǎng)基添加0.8～2.0mg/L萘乙酸、5～10%椰汁、0～10%土豆、0～10%香蕉、6.5～8.5g/L瓊脂、15～30g/L蔗糖；在溫度25～30℃，光強(qiáng)1500～2500lx、相對濕度65～80%、光照14～16h/d；誘導(dǎo)35～50d后得到開花苗；步驟5）：采花、繼代培養(yǎng)：把步驟4）中的開花苗取出，夾住花托，將花柄剪下，剩余的植株部分重新接入新的開花培養(yǎng)基中進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)分蘗開花；同樣在溫度25～30℃，光強(qiáng)1500～2500lx、相對濕度65～80%、光照14～16h/d。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明誘導(dǎo)鐵皮石斛開花率高，能緩解當(dāng)前社會(huì)對鐵皮石斛花茶、鐵皮石斛花卉或者鮮花和帶花植株的迫切需求，并提供了一種新的安全無害的技術(shù)方法，本發(fā)明在營養(yǎng)條件、溫度、光照和水汽等可控環(huán)境下培養(yǎng)出無毒、無害的鮮花，不使用對人體或環(huán)境有害的化學(xué)成分，并在人工條件下，125~175d可采收鐵皮石斛花，與在自然條件下生長相比周期更短、產(chǎn)量更高、更經(jīng)濟(jì)、更能滿足人們的迫切需求，對緩解鐵皮石斛花的市場供需矛盾有積極意義。作為優(yōu)選的，所述步驟1）、步驟2）、步驟3）、步驟4）和步驟5）均在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。鐵皮石斛在生長周期內(nèi)，對環(huán)境的敏感度較高，易被外部環(huán)境所感染，出現(xiàn)不可控的因素，進(jìn)而使誘導(dǎo)成功率降低，因此必須在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。作為優(yōu)選的，所述鐵皮石斛蒴果為成熟未開裂前采收的鐵皮石斛蒴果。優(yōu)點(diǎn)在于：（1）有利于鐵皮石斛蒴果的密封保存及運(yùn)輸，（2）減少鐵皮石斛種子受污染的幾率，（3）在進(jìn)行鐵皮石斛蒴果消毒滅菌時(shí)防止石斛種子接觸酒精、升汞等對種子有毒性的液體，提高種子的發(fā)芽率。作為優(yōu)選的，作為本發(fā)明的一個(gè)應(yīng)用，將步驟5)中已開花的植株煉苗后移栽，制作成觀賞性花卉或盆景。附圖說明圖1為本發(fā)明人工誘導(dǎo)鐵皮石斛在組培瓶內(nèi)的開花情況示意圖；圖2為本發(fā)明誘導(dǎo)出的正在開花的植株形態(tài)圖。具體實(shí)施方式下面通過具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明：實(shí)施例1：人工誘導(dǎo)鐵皮石斛在組培瓶內(nèi)開花的方法，按照以下步驟進(jìn)行：步驟1）：外植體的滅菌消毒：a、選擇外植體：本實(shí)施例是從鐵皮石斛種植基地購買的成熟未裂開的蒴果，選用其中顆粒飽滿，表面無受損、未裂開的蒴果的種子為外植體；b、外植體的滅菌消毒：在消毒后的超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，用無菌水將鐵皮石斛蒴果表面的臟物沖洗干凈，將鐵皮石斛蒴果置于75%乙醇中浸15s，再用0.1%的升汞溶液中浸15min后，用無菌水沖洗4～5次，每次沖洗5min，備用。步驟2）：無菌萌發(fā)及幼苗生長：用無菌濾紙擦干蒴果表面水后，在無菌環(huán)境下，用解剖刀切開蒴果，用鑷子將種子取出接種于已分裝好的萌發(fā)培養(yǎng)基中，接種后稍加搖動(dòng)，使種子均勻散布于培養(yǎng)基中，封口，將接種后的組培瓶移入培養(yǎng)室，培養(yǎng)溫度22～28℃，光強(qiáng)1200～2000lx、相對濕度65～80%、每天光照11～16h，5～8天后種子開始萌發(fā)，45天后長成2～3cm的幼苗。步驟3）：無菌苗生根壯苗培養(yǎng)：在消毒后的超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，將幼苗繼代至壯苗培養(yǎng)基中；壯苗培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基添加3.5～4.5mg/L萘乙酸、8～10%土豆、15～30g/L蔗糖、6.5～8.5g/L瓊脂；培養(yǎng)條件：溫度22℃～28℃，光強(qiáng)1200～2000lx、相對濕度65～80%、每天光照14～16h，60～80d后長成成苗。步驟4）：誘導(dǎo)開花：將步驟3）中的成苗轉(zhuǎn)接至開花培養(yǎng)基中，每瓶接種12株小苗；其中開花培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基添加1.0mg/L萘乙酸、8%椰汁、8%土豆、30g/L蔗糖、7.0g/L瓊脂；培養(yǎng)條件：溫度25℃，光強(qiáng)2000lx、相對濕度70%、每天光照16h。誘導(dǎo)后48天左右植株即可開花，開花率65~87%，單花鮮重為0.11~0.28g/朵。步驟5）：a、采花：在超凈工作臺(tái)上采集鐵皮石斛鮮花，操作時(shí)，把步驟4）中的開花苗取出，夾住花托，用剪刀將花柄剪下，剩余的植株部分重新接入新的開花培養(yǎng)基中進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)；或直接將無菌開花苗進(jìn)行煉苗、移栽，制作觀賞性花卉或盆景。b、繼代培養(yǎng)：采花后植株在新的開花培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，其中開花培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基添加1.0mg/L萘乙酸、8%椰汁、8%土豆、30g/L蔗糖、7.0g/L瓊脂；培養(yǎng)條件：溫度25℃，光強(qiáng)2000lx、相對濕度70%、每天光照16h。40天左右植株即可開花，開花率67~88%，單花鮮重為0.10~0.29g/朵，可如此繼代3次，每瓶共可采集鮮花32~45朵，鮮重7.46~10.25g。實(shí)施例2與實(shí)施例1的區(qū)別在于步驟4）和步驟5）的不同：步驟4）：誘導(dǎo)開花：將步驟3）中的成苗轉(zhuǎn)接至開花培養(yǎng)基中，每瓶接種12株小苗；其中開花培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基添加1.0mg/L萘乙酸、8%椰汁、30g/L蔗糖、7.0g/L瓊脂；培養(yǎng)條件：溫度25℃，光強(qiáng)2000lx、相對濕度70%、每天光照16h。誘導(dǎo)后48天左右植株即可開花，開花率63~84%，單花鮮重為0.10~0.26g/朵。步驟5）：a、采花：在超凈工作臺(tái)上采集鐵皮石斛鮮花，操作時(shí)，把步驟4）中的開花苗取出，夾住花托，用剪刀將花柄剪下，剩余的植株部分重新接入新的開花培養(yǎng)基中進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)；或直接將無菌開花苗進(jìn)行煉苗、移栽，制作觀賞性花卉或盆景。b、繼代培養(yǎng)：采花后植株在新的開花培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，其中開花培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基添加1.0mg/L萘乙酸、8%椰汁、30g/L蔗糖、7.0g/L瓊脂；培養(yǎng)條件：溫度25℃，光強(qiáng)2000lx、相對濕度70%、每天光照16h。43天左右植株即可開花，開花率64%~85%，單花鮮重為0.10g/朵~0.27g/朵，可如此繼代3次，每瓶共可采集鮮花32~42朵，鮮重7.35~10.12g。實(shí)施例3與實(shí)施例1的區(qū)別在于步驟4）和步驟5）的不同：步驟4）：誘導(dǎo)開花：將步驟3）中的成苗轉(zhuǎn)接至開花培養(yǎng)基中，每瓶接種12株小苗；其中開花培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基添加1.0mg/L萘乙酸、8%椰汁、8%香蕉、30g/L蔗糖、7.0g/L瓊脂；培養(yǎng)條件：溫度25℃，光強(qiáng)2000lx、相對濕度70%、每天光照16h。誘導(dǎo)后51天左右植株即可開花，開花率65~87%，單花鮮重為0.10~0.28g/朵。步驟5）：a、采花：在超凈工作臺(tái)上采集鐵皮石斛鮮花，操作時(shí)，把步驟4）中的開花苗取出，夾住花托，用剪刀將花柄剪下，剩余的植株部分重新接入新的開花培養(yǎng)基中進(jìn)行繼續(xù)培養(yǎng)；或直接將無菌開花苗進(jìn)行煉苗、移栽，制作觀賞性花卉或盆景。b、繼代培養(yǎng)：采花后植株在新的開花培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，其中開花培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基添加1.0mg/L萘乙酸、8%椰汁、8%香蕉、30g/L蔗糖、7.0g/L瓊脂；培養(yǎng)條件：溫度25℃，光強(qiáng)2000lx、相對濕度70%、每天光照16h。42天左右植株即可開花，開花率66~87%，單花鮮重為0.10~0.28g/朵，可如此繼代3次，每瓶共可采集鮮花32~43朵，鮮重7.39~10.22g。圖1為鐵皮石斛在組培瓶內(nèi)的開花情況，由圖可看出，鐵皮石斛開花情況良好。圖2為步驟4）誘導(dǎo)的鐵皮石斛植株開花情況，由圖可看出，鐵皮石斛在此期間誘導(dǎo)情況好，生活力強(qiáng)。以上所述的僅是本發(fā)明的實(shí)施例，方案中公知的具體結(jié)構(gòu)及特性等常識(shí)在此未作過多描述。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明結(jié)構(gòu)的前提下，還可以作出若干變形和改進(jìn)，這些也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護(hù)范圍，這些都不會(huì)影響本發(fā)明實(shí)施的效果和專利的實(shí)用性。本申請要求的保護(hù)范圍應(yīng)當(dāng)以其權(quán)利要求的內(nèi)容為準(zhǔn)，說明書中的具體實(shí)施方式等記載可以用于解釋權(quán)利要求的內(nèi)容。