本發(fā)明關(guān)于一種培養(yǎng)牛樟芝子實(shí)體的方法，尤指一種無菌培養(yǎng)牛樟芝子實(shí)體的方法。

背景技術(shù)：

牛樟芝(antrodiacinnamomea)屬于非褶菌目、多孔菌科、薄孔菌屬、樟芝種，乃多年生蕈菌類。樟芝為一種木材腐朽真菌，只生長(zhǎng)在臺(tái)灣本土的老齡牛樟樹上。菇體表面孔狀，初生時(shí)鮮紅色，漸長(zhǎng)變?yōu)槿榘咨⒌t褐色、淡褐色或淡黃褐色，子實(shí)體于牛樟樹干的中空內(nèi)部長(zhǎng)出，亦有自倒伏牛樟樹枯木底部長(zhǎng)出者，有強(qiáng)烈的牛樟香味。

牛樟芝一直以來被視為珍貴的真菌類藥材，在許多研究中發(fā)現(xiàn)，三帖類化合物(triterpenoids)是牛樟芝最重要的成分之一，并且牛樟芝的三帖類化合物含量遠(yuǎn)超過靈芝。此外，牛樟芝中所含有的其他化合物，例如多糖體、超氧歧化酶、腺苷、β-d-葡聚糖等生理活性成分，皆對(duì)于人體生理機(jī)能可發(fā)揮均衡保健的功效。三萜類的主要功能有抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、抑制組織胺的釋放，防止過敏、促進(jìn)肝功能、促進(jìn)血小板凝集、以及降血脂等作用。三萜類的含量及種類愈多，則愈有醫(yī)療價(jià)值。從實(shí)驗(yàn)證實(shí)：三萜類化合物能抑制肝癌細(xì)胞的增殖。高血壓患者往往因?yàn)檠獕焊?，?dǎo)致腦血管破裂而中風(fēng)，三萜類化合物能有效的抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ace)的活性，進(jìn)而降低血壓。另外三萜類也具有抗發(fā)炎的功用。

由于牛樟樹已列入國家保育類植物，不準(zhǔn)砍伐，牛樟芝采集不易，且品質(zhì)不一。另外由于環(huán)境污染日漸嚴(yán)重，天然野生樟芝可能多少含有重金屬污染。因此近年來多以人工栽培方法來培養(yǎng)牛樟芝。根據(jù)twi422680揭示，習(xí)知的人工栽培方法包括椴木栽培法、固態(tài)栽培法以及液態(tài)發(fā)酵法。

然而，椴木栽培法無法在無菌的環(huán)境中進(jìn)行，因此容易受到其他 微生物的污染，且椴木來源不易控管，也有受到污染的可能。椴木栽培法的牛樟芝在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果中顯示具有腎上腺毒性，也會(huì)造成老鼠肝臟與卵巢的重量增加。

固態(tài)培養(yǎng)法主要是利用含有營養(yǎng)物質(zhì)的太空包來培養(yǎng)牛樟芝(即既有栽培香菇的方法)，所得到的牛樟芝其外觀雖然與野生及/或椴木栽培的牛樟芝相似，但其三帖類化合物的含量低，并且其他主要成分與野生及/或椴木栽培的牛樟芝子實(shí)體并不相同。

再者，一般藉由液態(tài)發(fā)酵法培養(yǎng)牛樟芝雖然可在短時(shí)間內(nèi)收成牛樟芝液體發(fā)酵產(chǎn)品，但其主要產(chǎn)物為多糖類，并不含有三帖類化合物，并且其他主要成分與野生及/或椴木栽培的牛樟芝子實(shí)體相去甚遠(yuǎn)。

有鑒于此，必須提供一種新穎的牛樟芝子實(shí)體培養(yǎng)方法，在無菌的環(huán)境下可有效的培養(yǎng)出牛樟芝子實(shí)體，并且其主要成分如三帖類化合物與野生及/或椴木栽培的牛樟芝相似，以有效達(dá)到人體保健的效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種培養(yǎng)牛樟芝子實(shí)體的方法，包括：將牛樟芝菌種接菌至經(jīng)滅菌的瓊脂培養(yǎng)基，以繼代培養(yǎng)產(chǎn)生次級(jí)菌絲體，并于該繼代培養(yǎng)過程中篩選出無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體，以及，以該經(jīng)篩選出無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體進(jìn)行該繼代培養(yǎng)，以產(chǎn)生子實(shí)體。

前述瓊脂培養(yǎng)基包含：ym瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)；食用油，且以該瓊脂培養(yǎng)基總重計(jì)，該食用油的含量為大于0％至1％；以及酵母提取物，且以該瓊脂培養(yǎng)基總重計(jì)，該酵母提取物的含量為大于3％至5％。前述瓊脂培養(yǎng)基中的其余組份為水。

本發(fā)明還提供一種培養(yǎng)牛樟芝子實(shí)體的方法，是在該瓊脂培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，以產(chǎn)生無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體及子實(shí)體以后，又自該瓊脂培養(yǎng)基篩選出該無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體及/或子實(shí)體，并接種該無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體及/或子實(shí)體至容器內(nèi)的經(jīng)滅菌的固態(tài)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)出次級(jí)菌絲體及子實(shí)體。

前述固態(tài)培養(yǎng)基包含至少一種谷物的固態(tài)部分；以及含有糖類化合物、酵母提取物、及食用油的液態(tài)部分，其中，以該液態(tài)部分總重 計(jì)，該糖類化合物的含量為3％至5％，該酵母提取物的含量為3％至5％，及該食用油的含量為大于0％至1％，且該液態(tài)部分在該容器內(nèi)的高度為自該固態(tài)部分的半高處至與該固態(tài)部分頂面等高處。前述固態(tài)培養(yǎng)基中的其余組份為水。

本發(fā)明還提供一種培養(yǎng)牛樟芝子實(shí)體的方法，是在該瓊脂培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，以產(chǎn)生無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體以后，自該瓊脂培養(yǎng)基取出該無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體，并接種該無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體至容器內(nèi)的經(jīng)滅菌的液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)出子實(shí)體，其中，該液態(tài)培養(yǎng)基包含：糖類化合物；酵母提取物；以及食用油，其中，以該液態(tài)培養(yǎng)基總重計(jì)，該糖類化合物的含量為3％至5％，該酵母提取物的含量為3％至5％，及該食用油的含量為大于0％至1％。

本發(fā)明還提供一種培養(yǎng)牛樟芝子實(shí)體的方法，包括將該固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)出的無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體接種至容器內(nèi)的經(jīng)滅菌的液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)出子實(shí)體，其中，該液態(tài)培養(yǎng)基包含：糖類化合物；酵母提取物；以及食用油，其中，以該液態(tài)培養(yǎng)基總重計(jì)，該糖類化合物的含量為3％至5％，該酵母提取物的含量為3％至5％，及該食用油的含量為大于0％至1％。

本發(fā)明無菌培養(yǎng)牛樟芝子實(shí)體的方法是在無菌環(huán)境中將牛樟芝菌種接種于瓊脂培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)，產(chǎn)生無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體后，藉此可由該無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體直接培養(yǎng)得到無毒和無污染的牛樟芝子實(shí)體，且該牛樟芝子實(shí)體具有與野生及/或椴木栽培的牛樟芝相同的指標(biāo)性成分。

附圖說明

圖1為繼代培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體的照片；

圖2為固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體的照片；

圖3為固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體的照片；

圖4為液態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體的照片；

圖5為市售牛樟芝子實(shí)體標(biāo)準(zhǔn)品(含11種標(biāo)準(zhǔn)品)的hplc圖譜；

圖6為野生(及/或椴木培養(yǎng))5.5年齡牛樟芝子實(shí)體的hplc圖譜；

圖7為本案實(shí)施例2固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體的hplc圖譜；

圖8為本案實(shí)施例3固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體的hplc圖譜；

圖9為本案實(shí)施例4液態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體的hplc圖譜。

具體實(shí)施方式

以下通過特定的具體實(shí)施例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，該領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭示的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及功效。本發(fā)明亦可藉由其它不同的實(shí)施方式加以施行或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)亦可基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在不悖離本發(fā)明所揭示的精神下賦予不同的修飾與變更。

本文所述“基質(zhì)”指在整體重量含量中占50％以上者。

一般，當(dāng)菌種于適當(dāng)?shù)沫h(huán)境時(shí)可萌發(fā)出菌絲，此菌絲細(xì)胞含單細(xì)胞核，即為初級(jí)菌絲體。本文所述“次級(jí)菌絲體”指，當(dāng)兩個(gè)可親和的單核菌絲相遇時(shí)，接觸的菌絲壁會(huì)融解，雙方的一個(gè)細(xì)胞核會(huì)相互移動(dòng)到對(duì)方的細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行有絲分裂，形成雙核的菌絲，并以共軛分裂的方式成長(zhǎng)，即稱為次級(jí)菌絲體。

本發(fā)明提供的培養(yǎng)牛樟芝子實(shí)體的方法，可于繼代培養(yǎng)時(shí)獲得牛樟芝子實(shí)體，或者在繼代培養(yǎng)后，接續(xù)進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)或液態(tài)培養(yǎng)，皆可獲得牛樟芝子實(shí)體。

在繼代培養(yǎng)的部分，包括：將牛樟芝菌種接菌至經(jīng)滅菌的瓊脂培養(yǎng)基，進(jìn)行繼代培養(yǎng)以產(chǎn)生次級(jí)菌絲體，并于該繼代培養(yǎng)過程中篩選出無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體，以及，以該經(jīng)篩選出無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體進(jìn)行該繼代培養(yǎng)，以產(chǎn)生子實(shí)體。

瓊脂培養(yǎng)基的準(zhǔn)備，是以ym瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)為基底，混合食用油及酵母提取物，使該瓊脂培養(yǎng)基中所含的食用油以該瓊脂培養(yǎng)基總重計(jì)的含量為大于0％至1％；而該酵母提取物以該瓊脂培養(yǎng)基總重計(jì)的含量為大于3％至5％。此外，前述酵母提取物可選擇一般市售的產(chǎn)品，并無特別限制。

接著將瓊脂培養(yǎng)基的溶液置入可滅菌容器中，進(jìn)行一般常用的滅菌程序，如使用一般實(shí)驗(yàn)室微生物培養(yǎng)常見的滅菌釜，藉由于密閉高壓下，產(chǎn)生高溫飽和的蒸汽進(jìn)行濕熱滅菌，滅菌后，將該瓊脂培養(yǎng)基的溶液倒入至少一個(gè)培養(yǎng)皿中，靜置及待冷卻后，形成固態(tài)的瓊脂培 養(yǎng)基。之后，將牛樟芝菌種接菌至該瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)于特定環(huán)境下繼代培養(yǎng)，可生長(zhǎng)出牛樟芝的次級(jí)菌絲體，接著生長(zhǎng)出顆粒狀牛樟芝子實(shí)體，該牛樟芝子實(shí)體所含的三萜類成份，非常接近于野生及/或椴木培養(yǎng)的牛樟芝的三萜類成份。

于繼代培養(yǎng)過程中，該無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體是在培養(yǎng)出至少第1繼代后(包含第1繼代)篩選的，并繼續(xù)進(jìn)行該繼代培養(yǎng)以產(chǎn)生牛樟芝子實(shí)體。

于繼代培養(yǎng)的過程中，例如在第1繼代時(shí)，即可篩選出無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體，繼續(xù)進(jìn)行該繼代培養(yǎng)以產(chǎn)生牛樟芝子實(shí)體。

此外，本發(fā)明培養(yǎng)牛樟芝子實(shí)體的方法中，該食用油為任何可食用的油脂，如植物油、動(dòng)物油或食用精油，優(yōu)選牛樟芝精油。優(yōu)選地，以該瓊脂培養(yǎng)基總重計(jì)，該食用油的含量為0.5％。

于一具體實(shí)施例中，是在該瓊脂培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，以產(chǎn)生無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體及子實(shí)體以后，自該瓊脂培養(yǎng)基篩選出該無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體及/或子實(shí)體，并接種該無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體及/或子實(shí)體至容器內(nèi)經(jīng)滅菌的固態(tài)培養(yǎng)基，培養(yǎng)出無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體及子實(shí)體。此外，可自該瓊脂培養(yǎng)基取出不同繼代的無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體及/或子實(shí)體進(jìn)行雜交培養(yǎng)。

前述固態(tài)培養(yǎng)基包含至少一種谷物的固態(tài)部分；以及含有糖類化合物、酵母提取物、及食用油的液態(tài)部分。于一具體實(shí)施例中，該固態(tài)部分包含復(fù)數(shù)種谷物，例如二種谷物，且以該固態(tài)部分總重計(jì)，各該谷物的含量為40至60％。在非限制性的實(shí)例中，谷物選自如黑糯米的米或可選自燕麥米。

于一具體實(shí)施例中，該固態(tài)部分包含40至60％黑糯米及40至60％燕麥米，優(yōu)選50％黑糯米及50％燕麥米。

該糖類化合物的選擇上并沒有特別限制，可選自單糖或雙糖，于一具體實(shí)施例中，該糖類化合物為選自葡萄糖、甘露糖及海藻糖所組成組的至少一者。

該固態(tài)培養(yǎng)基中，以該液態(tài)部分總重計(jì)，該糖類化合物的含量為3％至5％，該酵母提取物的含量為3％至5％，及該食用油的含量為大于0％至1％，且該液態(tài)部分在該容器內(nèi)的高度為自該固態(tài)部分的半高處至 與該固態(tài)部分頂面等高處。于一具體實(shí)施例中，該液態(tài)部分包含20％酵母提取物、20％葡萄糖、20％甘露糖、20％海藻糖及0.5％牛樟芝精油。

在進(jìn)行固態(tài)培養(yǎng)前，先將該固態(tài)培養(yǎng)基置入可滅菌容器中，進(jìn)行一般常用的滅菌程序，接著，自該瓊脂培養(yǎng)基篩選出無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體及/或子實(shí)體，并接種該無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體及/或子實(shí)體至容器內(nèi)該經(jīng)滅菌的固態(tài)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)出子實(shí)體。通常，自該瓊脂培養(yǎng)基篩選出的無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體，經(jīng)固態(tài)培養(yǎng)20天至1個(gè)月，可繼續(xù)生成次級(jí)菌絲體，進(jìn)行變種及毒性的篩選，僅篩選出無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體再繼續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月到3個(gè)月，可生成牛樟芝子實(shí)體。若自該瓊脂培養(yǎng)基篩選出無變種及無毒性的子實(shí)體，經(jīng)培養(yǎng)3個(gè)月至6個(gè)月，可生成牛樟芝子實(shí)體。

于另一具體實(shí)施例中，是在該瓊脂培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，以產(chǎn)生無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體后，自該瓊脂培養(yǎng)基取出該無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體，并接種該無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體至容器內(nèi)經(jīng)滅菌的液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)出子實(shí)體，其中，該液態(tài)培養(yǎng)基包含：糖類化合物；酵母提取物；以及食用油，其中，以該液態(tài)培養(yǎng)基總重計(jì)，該糖類化合物的含量為3％至5％，該酵母提取物的含量為3％至5％，及該食用油的含量為大于0％至1％。

于又一具體實(shí)施例中，包括將該固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)出的無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體接種至容器內(nèi)經(jīng)滅菌的液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)出子實(shí)體，其中，該液態(tài)培養(yǎng)基包含：糖類化合物；酵母提取物；以及食用油，其中，以該液態(tài)培養(yǎng)基總重計(jì)，該糖類化合物的含量為3％至5％，該酵母提取物的含量為3％至5％，及該食用油的含量為大于0％至1％。

于該容器內(nèi)的液態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)出子實(shí)體的步驟包括：在培養(yǎng)至停止期前，攪拌該液態(tài)培養(yǎng)基；以及停止攪拌該液態(tài)培養(yǎng)基，提升該液態(tài)培養(yǎng)基濃度，使該無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體浮至該液態(tài)培養(yǎng)基的液面，以靜置培養(yǎng)出子實(shí)體。

該停止期指一般皆知的菌絲體的生長(zhǎng)隨時(shí)間變化呈現(xiàn)菌絲體數(shù)目無凈增加的期間，根據(jù)本發(fā)明的方法，可于培養(yǎng)過程檢測(cè)以判斷是否達(dá)到停止期。于部分具體實(shí)施例中，該停止期為培養(yǎng)后的第20天至1個(gè)月。

另外，可使用各種方法提升該液態(tài)培養(yǎng)基濃度，于一具體實(shí)施例中，通過提升該酵母提取物及糖類的濃度，使該無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體浮至該液態(tài)培養(yǎng)基的液面，以靜置培養(yǎng)出子實(shí)體。此外，于非限制性實(shí)施例中，提升該液態(tài)培養(yǎng)基濃度5倍，并可經(jīng)3個(gè)月至6個(gè)月的培養(yǎng)，生成牛樟芝子實(shí)體。

另外，于一具體實(shí)施例中，該液態(tài)培養(yǎng)基包含4％的酵母提取物、4％的糖類及0.5％的食用油，優(yōu)選為4％的酵母提取物、4％的葡萄糖及0.5％的牛樟芝精油。由于牛樟芝精油含量較低，提升該液態(tài)培養(yǎng)基濃度時(shí)，亦可僅提高酵母提取物及糖類的濃度，例如使酵母提取物和葡萄糖的濃度提升為20％的酵母提取物和20％的葡萄糖。

根據(jù)本發(fā)明的方法，該特定環(huán)境指于60至70％的相對(duì)濕度環(huán)境進(jìn)行該繼代培養(yǎng)。

于一具體實(shí)施例中，該特定環(huán)境指于60至70％的相對(duì)濕度環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)，且每天至少10至14小時(shí)的時(shí)間控制培養(yǎng)的溫度在24至27℃；每天至少10至14小時(shí)的時(shí)間控制培養(yǎng)的溫度在19至23℃。

于另一具體實(shí)施例中，該特定環(huán)境指于60至70％的相對(duì)濕度環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)，且每天至少10至14小時(shí)的時(shí)間控制培養(yǎng)的溫度在24至27℃，優(yōu)選令該溫度對(duì)應(yīng)在日照，例如白天的時(shí)間；每天至少10至14小時(shí)的時(shí)間控制培養(yǎng)的溫度在19至23℃，并令該溫度對(duì)應(yīng)在非日照，例如晚上的時(shí)間。

于一具體實(shí)施例中，不以地理位置不同所造成的差異為限制，當(dāng)白天的時(shí)間為6點(diǎn)至18點(diǎn)，則對(duì)應(yīng)該時(shí)段，每天至少10至14小時(shí)的時(shí)間控制培養(yǎng)的溫度在24至27℃，并施以天然或人工日照，尤其至少90％的控溫時(shí)間對(duì)應(yīng)在白天的時(shí)間。

于一具體實(shí)施例中，不以地理位置不同所造成的差異為限制，當(dāng)晚上的時(shí)間為18點(diǎn)至6點(diǎn)，則對(duì)應(yīng)該時(shí)段，每天至少10至14小時(shí)的時(shí)間控制培養(yǎng)的溫度在19至23℃，且不施以日照，尤其至少90％的控溫時(shí)間對(duì)應(yīng)在晚上的時(shí)間。

此外，本發(fā)明的培養(yǎng)牛樟芝子實(shí)體的方法中，可于任何步驟中針對(duì)牛樟芝次級(jí)菌絲體及/或牛樟芝子實(shí)體進(jìn)行無變種及無毒性的篩選。

實(shí)施例1-繼代培養(yǎng)

以ym瓊脂培養(yǎng)基質(zhì)(ymagar，購自acumedia)作為基底，混合食用油及酵母提取物(購自豐味通)，使瓊脂培養(yǎng)基包含0.5％牛樟芝精油及4％酵母提取物(其余組份為水)，將混合后的瓊脂培養(yǎng)基的溶液置入可滅菌容器中，將可滅菌容器及其內(nèi)含的瓊脂培養(yǎng)基的溶液以滅菌釜進(jìn)行滅菌程序，將滅菌后的瓊脂培養(yǎng)基的溶液倒入多個(gè)培養(yǎng)皿中，靜置該瓊脂培養(yǎng)基的溶液，待冷卻后便形成固態(tài)瓊脂培養(yǎng)基。

將牛樟芝菌種接菌至該固態(tài)瓊脂培養(yǎng)基，接著將含有該牛樟芝菌種的固態(tài)瓊脂培養(yǎng)基放置于特定環(huán)境下培養(yǎng)，以生成牛樟芝次級(jí)菌絲體，該特定環(huán)境為白天(6點(diǎn)至18點(diǎn))時(shí)保持溫度24至27℃，晚上(18點(diǎn)至6點(diǎn))時(shí)保持溫度19至23℃，且相對(duì)濕度范圍為60至70％。

在該繼代的過程中，在第1繼代就進(jìn)行變種及毒性的篩選，僅挑出無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體繼續(xù)進(jìn)行繼代，其中，繼代1代需要20天至1個(gè)月。最后由該無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體長(zhǎng)出子實(shí)體，并于采收時(shí)，再次進(jìn)行變種及毒性的篩選。圖1為繼代培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體的照片。

實(shí)施例2-固態(tài)培養(yǎng)

預(yù)先準(zhǔn)備固態(tài)培養(yǎng)基至可滅菌容器中，該固態(tài)培養(yǎng)基包括固態(tài)部分及液態(tài)部分，該固態(tài)部分包含50％黑糯米及50％燕麥米，該液態(tài)部分包含20％酵母提取物、20％葡萄糖、20％甘露糖、20％海藻糖及0.5％牛樟芝精油，其中，該液態(tài)部分在該容器內(nèi)的高度為達(dá)該固態(tài)部分頂面等高處。將可滅菌容器及其內(nèi)含的固態(tài)培養(yǎng)基以滅菌釜進(jìn)行滅菌程序，自實(shí)施例1取出無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體于該固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)，該固態(tài)培養(yǎng)基放置于如實(shí)施例1的環(huán)境下培養(yǎng)20天至1個(gè)月，以生成牛樟芝次級(jí)菌絲體，僅篩選出無變種及無毒性的牛樟芝次級(jí)菌絲體再繼續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月到3個(gè)月，以生成牛樟芝子實(shí)體。最后長(zhǎng)出子實(shí)體要采收時(shí)，再次進(jìn)行變種及毒性的篩選。圖2為固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體的照片。

實(shí)施例3-固態(tài)培養(yǎng)

使用與實(shí)施例2相同的固態(tài)培養(yǎng)基及滅菌步驟，自實(shí)施例1篩選出無變種及無毒性的子實(shí)體于該固態(tài)培養(yǎng)基培養(yǎng)，該固態(tài)培養(yǎng)基放置于如實(shí)施例1的環(huán)境下培養(yǎng)3個(gè)月至6個(gè)月，以生成牛樟芝子實(shí)體。最后長(zhǎng)出子實(shí)體要采收時(shí)再次進(jìn)行變種及毒性的篩選。圖3為固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體的照片。

實(shí)施例4-液態(tài)培養(yǎng)

預(yù)先準(zhǔn)備液態(tài)培養(yǎng)基，該液態(tài)培養(yǎng)基包含4％酵母提取物、4％葡萄糖及0.5％牛樟芝精油，將該液態(tài)培養(yǎng)基置入可滅菌容器中，將可滅菌容器及其內(nèi)含的液態(tài)培養(yǎng)基以滅菌釜進(jìn)行滅菌程序，自實(shí)施例1取出無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體于該液態(tài)培養(yǎng)基攪拌培養(yǎng)，該液態(tài)培養(yǎng)基放置于如實(shí)施例1的環(huán)境下培養(yǎng)至停(靜)止期時(shí)(20天至1個(gè)月)停止攪拌，接著將該液態(tài)培養(yǎng)基濃度提高5倍(即提高酵母提取物的濃度至20％，提高葡萄糖的濃度至20％，且不增加牛樟芝精油脂濃度)，此時(shí)該無變種及無毒性的次級(jí)菌絲體因液體濃度增加而浮至液面，再繼續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月至6個(gè)月，以生成牛樟芝子實(shí)體。最后長(zhǎng)出子實(shí)體要采收時(shí)，再次進(jìn)行變種及毒性的篩選。圖4為液態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體的照片。

測(cè)試?yán)?-三萜類化合物的種類與含量測(cè)試

為了證實(shí)經(jīng)由本發(fā)明培養(yǎng)方法所得到的牛樟芝子實(shí)體確實(shí)具有功能性成分的三帖類化合物，藉由hplc圖譜比對(duì)市售牛樟芝子實(shí)體標(biāo)準(zhǔn)品(a)及野生及/或椴木培養(yǎng)5.5年齡牛樟芝子實(shí)體(b)、本案實(shí)施例2固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體(c)、本案實(shí)施例3固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體(d)與本案實(shí)施例4液態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體(e)。

受試樣本三萜類化合物的萃取

分別稱取50毫克的(a)至(e)，加入5毫升去離子水，至于80℃水浴槽中萃取兩次(每次3小時(shí))。接著進(jìn)行離心并去除上清液(含水溶性物質(zhì))，將下層固體物進(jìn)行冷凍干燥并稱重。干燥后的物質(zhì)，加入50倍體積的絕對(duì)乙醇(購自sigmano.32221)，進(jìn)行三萜類化合物萃取1.5小時(shí)，再離心收集上清液(含三萜類化合物)，重復(fù)進(jìn)行三次。將收集 的上清液，進(jìn)行冷凍干燥，干燥后以10毫升絕對(duì)乙醇覆溶成水溶液(a)至(e)，使用hplc儀器進(jìn)行三萜類化合物種類分析。

hplc分析方法

吸取2微升(ul)的水溶液(a)至(e)，打入hplc儀器中，以流速200微升/分鐘(ul/min)的速率，通過c18管柱(2.1x100mm，粒徑3微米)，以偵測(cè)波長(zhǎng)244納米進(jìn)行分析比對(duì)。

hplc分析結(jié)果

市售牛樟芝子實(shí)體標(biāo)準(zhǔn)品-水溶液(a)：

市售牛樟芝子實(shí)體標(biāo)準(zhǔn)品包含11種標(biāo)準(zhǔn)品，如圖5所示各標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間為(1)樟芝酸k(antcink)為22.94與23.43分鐘，(2)苯并二惡茂(benzodioxole)為25.82分鐘，(3)樟芝甲酯k(methylantcinatek)為31.47與31.77分鐘，(4)樟芝酸c(antcinc)為35.34與36.27分鐘，(5)樟芝酸h(antcinh，zhankuicacidc)為36.99與37.49分鐘，(6)去氫硫色多孔菌酸(dehydrosulphurenicacid)為41.86分鐘，(7)樟芝酸b(antcinb)為44.82與45.10分鐘，(8)齒孔酸(eburicoicacid)為50.17分鐘，(9)樟芝酸a(antcina)為52.41分鐘，(10)樟芝甲酯b(methylantcinateb)為57.40分鐘，(11)去氫齒孔酸(dehydroeburicoicacid)為73.05分鐘。

野生(及/或椴木培養(yǎng))5.5年齡牛樟芝子實(shí)體-三萜類萃取液(b)：

比對(duì)市售標(biāo)準(zhǔn)品，如圖6所示，野生(及/或椴木培養(yǎng))5.5年齡牛樟芝子實(shí)體的三萜類種類包含9種(1)antcink為24.15與24.65分鐘，(3)methylantcinatek為32.61與32.64分鐘，(4)antcinc為36.67與37.62分鐘，(5)antcinh(zhankuicacidc)為38.29與38.78分鐘，(6)dehydrosulphurenicacid為43.17分鐘，(7)antcinb為46.28分鐘，(8)eburicoicacid為51.20分鐘，(9)antcina為54.03分鐘，(11)dehydroeburicoicacid為74.97分鐘。

比對(duì)出的三萜類化合物的種類含量百分比。計(jì)算方式為，計(jì)算出圖譜中每個(gè)峰(peak)的面積大小，將每個(gè)峰(peak)面積相加后為總含量。將比對(duì)到的三萜化合物面積除以總含量面積，即可得含量百分比。所得的三萜含量約為：(1)13.26％、(3)1.32％、(4)3.98％、(5)11.94％、(6)33.16％、(7)4.14％、(8)1.32％、(9)2.65％以及(11)21.22％。

本案實(shí)施例2固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體-三萜類萃取液(c)：

比對(duì)市售標(biāo)準(zhǔn)品，如圖7所示，本案實(shí)施例2固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體的三萜類種類包含7種(1)antcink為25.28與25.95分鐘，(4)antcinc為36.83與38.01分鐘，(5)antcinh(zhankuicacidc)為38.69與38.94分鐘，(6)dehydrosulphurenicacid為43.35分鐘，(7)antcinb為46.53分鐘，(9)antcina為54.18分鐘，(11)dehydroeburicoicacid為75.05分鐘。

比對(duì)出的三萜類化合物的種類含量百分比，計(jì)算方式如前述。所得的三萜含量約為：(1)27.62％，(4)24.86％，(5)15.19％，(6)6.90％，(7)5.52％，(9)1.65％以及(11)2.76％。本案實(shí)施例3固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體-三萜類萃取液(d)：

比對(duì)市售標(biāo)準(zhǔn)品，如圖8所示，本案實(shí)施例3固態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體的三萜類種類包含7種(1)antcink為24.533與25.179分鐘，(2)benzodioxole4.97％為26.88分鐘，(5)antcinh(zhankuicacidc)為39.57與40.06分鐘，(6)dehydrosulphurenicacid為43.95分鐘，(7)antcinb為47.21分鐘，(8)eburicoicacid為51.58分鐘，(10)methylantcinateb為61.87分鐘(11)dehydroeburicoicacid為75.42分鐘。

比對(duì)出的三萜類化合物的種類含量百分比，計(jì)算方式如前述。所得的三萜含量約為：(1)antcink3.98％，(2)benzodioxole4.97％，(5)antcinh(zhankuicacidc)4.97％，(6)dehydrosulphurenicacid9.95％，(7)antcinb7.96％，(8)eburicoicacid5.97％，(10)methylantcinateb1.99％以及(11)dehydroeburicoicacid8.95％。本案實(shí)施例4液態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體-三萜類萃取液(e)：

比對(duì)市售標(biāo)準(zhǔn)品，如圖9所示，本案實(shí)施例4液態(tài)培養(yǎng)所得的牛樟芝子實(shí)體的三萜類種類包含8種(1)antcink為23.15與23.65分鐘，(3)methylantcinatek為34.51與34.78分鐘，(4)antcinc為37.58與37.72分鐘，(5)antcinh(zhankuicacidc)為39.14與39.52分鐘，(6)dehydrosulphurenicacid為44.09分鐘，(7)antcinb為47.32分鐘，(9)antcina為55.16分鐘，(11)dehydroeburicoicacid為75.85分鐘。

比對(duì)出的三萜類化合物的種類含量百分比，計(jì)算方式如前述。所得的三萜含量約為：(1)22.76％，(3)5.20％，(4)20.81％，(5)11.38％，(6)16.26％，(7)1.62％，(9)1.30％以及(11)6.50％。

藉由本發(fā)明所提供的培養(yǎng)方法，可有效控制牛樟芝子實(shí)體在無菌的環(huán)境下生長(zhǎng)，并藉由模擬野生及/或椴木培養(yǎng)的牛樟芝的生長(zhǎng)環(huán)境，使本發(fā)明的牛樟芝子實(shí)體的內(nèi)含最重要的三萜類成份能非常接近于野生及/或椴木培養(yǎng)的牛樟芝，以達(dá)到與野生及/或椴木培養(yǎng)的牛樟芝同樣的功效，具相當(dāng)?shù)谋＝⌒Ч?/p>

上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何該領(lǐng)域技術(shù)人員均可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對(duì)上述實(shí)施例進(jìn)行修飾與改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有此項(xiàng)專業(yè)知識(shí)者，在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)原理下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由權(quán)利要求書范圍所涵蓋。