本發(fā)明屬于植物組織工程
技術(shù)領(lǐng)域：
。本發(fā)明涉及一種植物生物技術(shù)克隆工程，特別是針對像鐵皮石斛這種藥用價值很高卻生長緩慢、產(chǎn)量極低、對環(huán)境條件要求十分苛刻的瀕危物種，以及對土地破壞比較嚴重，例如甘草等植物。
背景技術(shù)：
：隨著城市化進程的迅速發(fā)展和人口的不斷增長，生態(tài)環(huán)境的不斷退化，使許多名貴中藥材資源枯竭和瀕滅。特別是針對像鐵皮石斛這種藥用價值很高卻生長緩慢、產(chǎn)量極低、對環(huán)境條件要求十分苛刻的瀕危物種，其社會效益很大。另一方面，由污染導(dǎo)致的食品安全問題已非常嚴重，農(nóng)藥殘留和重金屬超標(biāo)是中草藥植物的一大問題，也亟需解決。鐵皮石斛，顧名思義，是專指生于巖石上的石斛。至于附生于樹木上的石斛屬植物，古代本草亦有記載，稱之為木斛。《本草經(jīng)集注》曰：“生櫟樹上者名木斛，其莖形長大而色淺?！袷及惨喑瞿觉?，至虛長，不入丸散”。《本草圖經(jīng)》曰：“惟生石上者勝。亦有生櫟木上者，名木斛，不堪用?！蹦壳皬V泛培養(yǎng)于木屑之上的木斛，藥性甚微，而且大面積占用土地。雖然從上個世紀80年代開始，人們試圖用種子繁殖，人工栽培等手段或通過組織培養(yǎng)，誘導(dǎo)種子原莖球來擴增植株，再進行人工引種栽培等方法，擴大鐵皮石斛的生產(chǎn)。該方法目前已經(jīng)比較成熟，但由于種植者對醫(yī)書中描述的鐵皮石斛種植方式的了解不夠，絕大部分種植者都種植木斛，其藥用價值大打折扣，而且利用有性繁殖產(chǎn)生種子，經(jīng)發(fā)芽擴增的方法很容易造成變種，對石斛物種的純度造成很大的威脅。本發(fā)明根據(jù)高等植物細胞的兩個全能性：植物細胞具有分化成完整植株的全能性和植物細胞能合成原生植株藥用有效成份的全能性。針對鐵皮石斛這一具體物種，發(fā)明了一整套從鐵皮石斛原生植株成株莖段休眠芽上直接誘導(dǎo)出胚狀體，利用組織工程技術(shù)對鐵皮石斛進行擴增，通過調(diào)整培養(yǎng)基成分將胚狀體進行懸浮培養(yǎng)，進而將該方法與人工光源相結(jié)合，利用控制溫度、酸堿度、氧含量、以及生長調(diào)節(jié)劑比例等將生產(chǎn)規(guī)模擴大到噸級以上的規(guī)模。利用本發(fā)明的鐵皮石斛胚狀體規(guī)模培養(yǎng)方法，其生長速率達到8-9.5毫克/克·天；相當(dāng)于自然生長速度的1000倍以上。利用規(guī)?；囵B(yǎng)基礎(chǔ)罐(500升)每25-50天產(chǎn)量可達20公斤干品，擴增產(chǎn)能每罐得率均在3.5％以上，得干率lo％以上。通過實施本發(fā)明的技術(shù)方法，使鐵皮石斛的生物培養(yǎng)規(guī)模從土地種植的低水平向工廠化生產(chǎn)規(guī)模轉(zhuǎn)化。同時，由于生產(chǎn)流程得到了良好的控制，使農(nóng)殘重金屬幾乎檢測不到，大大提高了產(chǎn)品長期服用的安全性。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明為一種體外規(guī)?；瘧腋∨囵B(yǎng)擴增石斛胚狀體方法，其培養(yǎng)過程是：石斛帶休眠芽莖段，插入到適宜固體培養(yǎng)基上，在合適的培養(yǎng)溫度和光照強度下，待起始胚狀體長出后，將胚狀體剝離，置于相同的上述培養(yǎng)基上擴增，擴增后轉(zhuǎn)入到上述培養(yǎng)基去掉瓊脂粉的液體培養(yǎng)基中，置于搖床上90-120轉(zhuǎn)/分振蕩懸浮培養(yǎng)，每瓶按適當(dāng)接種率接種，根據(jù)生長情況繼代；經(jīng)數(shù)次繼代適應(yīng)懸浮培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入大規(guī)模生物反應(yīng)器中進行連續(xù)擴增，通過調(diào)節(jié)生物反應(yīng)器中的指標(biāo)、更換培養(yǎng)基成分、改變生長調(diào)節(jié)劑比例、以及分批在線收集等手段，最終達到每25-50天收獲一次或連續(xù)、半連續(xù)培養(yǎng)，多糖含量達到15％以上，比生物生長速率達8-9.5毫克/克·天，并保持20l至噸級單元生產(chǎn)規(guī)模、常年穩(wěn)定的擴增體系。具體的操作為：石斛帶休眠芽莖段，插入到適宜固體培養(yǎng)基上，在合適的培養(yǎng)溫度和光照強度下，待起始胚狀體長出后，將胚狀體剝離，置于相同的上述培養(yǎng)基上擴增，擴增后轉(zhuǎn)入到上述培養(yǎng)基去掉瓊脂粉的液體培養(yǎng)基中，置于搖床上90-120轉(zhuǎn)/分振蕩懸浮培養(yǎng)，獲得胚狀體種子；將胚狀體種子按一定接種比例接種到生物反應(yīng)器中，通過調(diào)節(jié)氧含量在30-50％之間，ph為5-7，固定光源光照12-20h，光照強度2000-8000lx，培養(yǎng)分階段進行，每一階段為10-15天，不同階段的光質(zhì)交替變換，所述的光質(zhì)為紅藍光，所述的交替變換為紅藍光比例由第一階段的2-3:4-5調(diào)整為第二階段的3-4:4-6，再由第二階段的3-4:4-6調(diào)整為第三階段的2-3:4-5，并以此模式循環(huán)；每階段更換新鮮液體培養(yǎng)基一次。每15-25天收獲石斛胚狀體培養(yǎng)物的30-50％，并補充相應(yīng)比例的新鮮液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)持續(xù)進行；所述液體培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基中添加植物生長調(diào)節(jié)劑，植物生長調(diào)節(jié)劑為生長素、細胞分裂素的組合或生長素、細胞分裂素與aba的組合，總濃度為在0.05-5mg/l調(diào)整。所述基本培養(yǎng)基為ms、1/2ms、1/4ms、b5、n6、nln、white或sh培養(yǎng)基。所述的液體培養(yǎng)基與更換的新鮮液體培養(yǎng)基中的植物生長調(diào)節(jié)劑相同，均為iaa/naa/iba0.05-3mg/l:6-ba/kt/zt0.05-3mg/l，總濃度為0.05-5mg/l。優(yōu)選的，更換的新鮮液體培養(yǎng)基中植物生長調(diào)節(jié)劑為iaa/naa/iba0.05-3mg/l:kt0.05-3mg/l:aba0.05-50ug/l，總濃度為0.05-5mg/l。附圖說明附圖1，附圖簡要以流程形式歸納了
發(fā)明內(nèi)容所涵蓋的技術(shù)要點，懸浮培養(yǎng)鐵皮石斛胚狀體生產(chǎn)方法流程圖。具體實施方式采集鐵皮石斛莖段，滅菌后以幼嫩莖接種到固體培養(yǎng)基上段誘導(dǎo)外植體，待胚狀體誘導(dǎo)形成后，轉(zhuǎn)移到以ms培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，加入5-10克椰汁，調(diào)節(jié)ph值至5.8的液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度(25±5)℃，光強為2000-8000lx，光照時間12-20h/天。待胚狀體適應(yīng)懸浮培養(yǎng)后，將胚狀體按10-30％接種至大規(guī)模生物反應(yīng)器中，培養(yǎng)周期為25-60天，或者連續(xù)培養(yǎng)。紅藍光比例前一段周期是2-3:4-5，后一段紅藍光比例為3-4:4-6，每階段交替變換，每一階段培養(yǎng)時間為10-15天，光強范圍為2000-8000lx。大規(guī)模生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基中加入了一定比例混合的生長素、細胞分裂素或者生長素、細胞分裂素以及脫落酸，生長素可以是iaa，iba，naa，細胞分裂素可以是6-ba，kt，zt，脫落酸為aba。生長素濃度為0.05-5mg/l，細胞分裂素濃度為0.05-5mg/l，aba濃度為0.01-2mg/l。培養(yǎng)基在10-25天時換液一次，換液前后生長素與細胞分裂素組合均為：iaa/naa/iba0.05-3mg/l:6-ba/kt/zt0.05-3mg/l。更優(yōu)選的方案是，換液前生長素與細胞分裂素組合均為：iaa/naa/iba0.05-3mg/l:6-ba/kt/zt0.05-3mg/l，換液后生長素與細胞分裂素、脫落酸組合為：iaa/naa/iba0.05-3mg/l:kt0.05-3mg/l:aba0.05-50ug/l。培養(yǎng)周期結(jié)束后，培養(yǎng)物可一次性收獲，或按20％-80％收獲率保存種源作連續(xù)培養(yǎng)。結(jié)合實施案例，對本發(fā)明作以闡述，但不是限制本發(fā)明的局限性。實施例1.鐵皮石斛胚狀體的規(guī)?；囵B(yǎng)方法(見附圖1)1.鐵皮石斛外植體采集、滅菌：以幼嫩莖段為外植體，經(jīng)過外植體消毒處理，接種到胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，經(jīng)過一段時間的誘導(dǎo)，外植體膨大并產(chǎn)生胚狀體，將誘導(dǎo)形成的胚狀體轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)?；九囵B(yǎng)基：ms培養(yǎng)基，碳源、蔬/果汁(香蕉汁、馬鈴薯汁、番茄汁、蘋果汁等)、瓊脂粉、ph5.8的固體培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件：溫度(25±5)℃，光強為2000lx，光照時間12-20h/天。2.起始胚狀體的誘導(dǎo)培養(yǎng)基：上述固體培養(yǎng)基接種好外植體三角瓶放在25℃±5，光照強度為2000lx，光照時間10-18h/天，經(jīng)數(shù)天連續(xù)培養(yǎng)后，起始胚狀體在莖段休眠芽上長出。等到適量大小時，將外植體剝離，轉(zhuǎn)入到固體培養(yǎng)基上，每個三角瓶中放置幾個胚狀體球，進一步促進胚狀體球的增殖。3.胚狀體懸浮培養(yǎng)基及篩選程序：a.懸浮培養(yǎng)基：上述固體培養(yǎng)基改變成液體培養(yǎng)基，同上述一樣條件滅菌；b.胚狀體懸浮培養(yǎng)：在上述固體培養(yǎng)基中長成足夠量的胚狀體后，將胚狀體按一定接種率，接種到三角瓶，90-120轉(zhuǎn)/分震蕩，25℃±5，光強為2000lx，光照時間10-18h/天，視生長情況進行繼代。c.符合懸浮培養(yǎng)胚狀體的篩選：經(jīng)過3-4次繼代后，仔細挑選增殖快的胚狀體，使每個三角瓶中的培養(yǎng)物形態(tài)一致，色澤相似，培養(yǎng)液清澈的培養(yǎng)體系。d.生長速率測試計算公式：(收獲量-接種量)÷培養(yǎng)重量÷收獲時培養(yǎng)天數(shù)＝生長速率本發(fā)明在實施過程經(jīng)檢測，其生長速率達到9-9.5毫克/克·天。e.大規(guī)模培養(yǎng)方法培養(yǎng)基中激素總濃度為0.05-5mg/l。培養(yǎng)周期：持續(xù)培養(yǎng)。將胚狀體種子按10-30％接種比例接種到50l不銹鋼生物反應(yīng)器中，通過調(diào)節(jié)氧含量在30-50％之間，酸堿度在5-7之間，固定光源光照10-20h，光照強度2000-8000lx，紅藍光比例每15天更替一次，由2:5更替為3:5，再更替為2:5，以此模式循環(huán)；生長素與細胞分裂素比例控制在3:1即可，每15天更換培養(yǎng)基一次。實施例2.鐵皮石斛胚狀體的規(guī)?；囵B(yǎng)方法除步驟e外，其余步驟與實施例1相同。e.大規(guī)模培養(yǎng)方法培養(yǎng)基中激素總濃度為0.05-5mg/l。培養(yǎng)周期：50天。將胚狀體種子按10-30％接種比例接種到50l不銹鋼生物反應(yīng)器中，通過調(diào)節(jié)氧含量在30-50％之間，酸堿度在5-7之間，固定光源光照10-20h，光照強度2000-8000lx，紅藍光比例每15天更替一次，由2:5更替為3:5，再更替為2:5，以此模式循環(huán)；生長素與細胞分裂素比例比例控制在3:1即可，每15天更換培養(yǎng)基一次。每培養(yǎng)25天收獲30％，并補充30％新鮮培養(yǎng)液，培養(yǎng)周期結(jié)束后全部收獲。不同激素組合如表所示,從獲得的胚狀體內(nèi)物質(zhì)含量結(jié)果看出，只要生長素與細胞分裂素比例控制在3：1，培養(yǎng)獲得的胚狀體內(nèi)多糖含量基本一致，即胚狀體內(nèi)物質(zhì)含量與激素種類無關(guān)，而與培養(yǎng)方式以及生長素與細胞分裂素的比例有關(guān)。實施例3.鐵皮石斛胚狀體的多糖測定一、實驗方法l、試劑配制(l)乙醇溶液，20ml水中加入無水乙醇80ml。(2)苯酚溶液：稱取精制苯酚5.0克，加入水中溶解并稀釋至looml，混勻，備用(溶液置4℃冰箱可保存一個月)。(3)濃硫酸備用。(4)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液：精密稱取在105℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品1.00809，加水溶解并定容至looml，混勻，置4℃冰箱保存。此溶液每ml含10.080mg葡萄糖。(5)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲備液2.ooml，置于looml容量瓶中，加水至刻度，混勻，置于4℃冰箱中保存。2、實驗方法(l)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液o，0.2，0.4，0.6，0.8，l.o，(相當(dāng)于葡萄糖0，0.04032，0.08064，0.12096，0.16128，0.2016mg)分別置于25ml比色管中準(zhǔn)確補充水至2.oml，加入苯酚溶液2.oml，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻，小心加入濃硫酸loml，于旋轉(zhuǎn)混勻器上小心混勻，置沸水浴中煮沸15min，冷卻后用分光度計在490nm波長處以試劑空白溶液為參比，lcm比色皿測定吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸曲線方程圖得相關(guān)系數(shù)。樣品測定a.樣品提取鐵皮石斛胚狀體在60℃烘箱中烘干，粉碎，稱取約o.lg備用。石斛粉經(jīng)95％乙醇提取后，按20倍體積水加溫90℃，1小時。趁熱過濾，收取濾液，減壓濃縮，加4倍體積無水乙醇混勻，4000rpm，15min離心，沉淀用80％乙醇洗2遍，最終沉淀物溶于50ml水即為石斛粗多糖溶液。b.多糖測定精密取多糖溶液2.oml置于25ml比色管中，加入苯酚溶液2.oml，在旋轉(zhuǎn)混勻器上混勻后，小心加入濃硫酸lo.oml后混勻，置于水浴中煮沸l(wèi)omin,冷卻至室溫用分光度計在490nm波長處，以試劑空白為參比，lcm比色皿測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品(按倍比稀釋至合適濃度)吸光度值，做葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，計算樣品中粗多糖含量。c.計算方法根據(jù)樣品的od值從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的葡萄糖含量，乘以稀釋倍數(shù)，換算成總多糖含量，再除以烘干樣品的干重，即為每克干重樣品中含粗多糖的含量，單位為mg/g。多糖含量＝od值×稀釋倍數(shù)×樣品總體積/樣品干重二、鐵皮石斛多糖測定結(jié)果實驗對不同培養(yǎng)天數(shù)的鐵皮石斛細胞團及其培養(yǎng)上清中的多糖含量進行了定量測定.結(jié)果表明：所測材料中的多糖含量穩(wěn)定，其中20至25天的細胞中多糖含量為160-180mg/g干重：占總量的2.5-3.3％。實施例4與恒定培養(yǎng)方法相比胚狀體內(nèi)物質(zhì)含量及生產(chǎn)規(guī)模比較經(jīng)過50天的培養(yǎng)，將上述培養(yǎng)得到的胚狀體與恒定培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的胚狀體進行檢測，數(shù)據(jù)見下表。指標(biāo)恒定培養(yǎng)階段培養(yǎng)收獲率200克/l280克/l出芽率35％55％精氨酸含量1.68克/l2.01克/l與恒定培養(yǎng)方法相比，本申請經(jīng)過120天的培養(yǎng)，可以達到噸級生產(chǎn)規(guī)模，而恒定培養(yǎng)方法僅能達到20l級生產(chǎn)規(guī)模。當(dāng)前第1頁12