本發(fā)明屬于環(huán)境保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種采用碳納米材料調(diào)控草坪堆肥基質(zhì)放線菌鑒定分析方法。

背景技術(shù)：

碳納米材料是三維結(jié)構(gòu)中至少有一個小于100 nm的材料。碳納米材料具有尺寸小，比表面積大，表面能高，表面原子比例大的特點，在力學(xué)、光學(xué)、熱學(xué)、電學(xué)等方面表現(xiàn)出了優(yōu)異性能。納米顆粒存在很多微界面, 各種界面反應(yīng)可以通過其強(qiáng)化, 在土壤重金屬污染以及污水凈化方面發(fā)揮著顯著的作用。

碳元素在自然界含量非常高，對于有機(jī)物和生命體也非常重要。1985 年，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了由60 個C原子組成的C₆₀。隨后碳納米管和石墨烯等也相繼被發(fā)現(xiàn)。2004年, Geim等人成功制備出了單層石墨烯。之后隨著石墨烯在光、電、熱、磁上的特殊性質(zhì)被陸續(xù)發(fā)現(xiàn), 有關(guān)碳材料的研究又進(jìn)入了一個全新的領(lǐng)域。

隨著科學(xué)技術(shù)、現(xiàn)代工業(yè)的快速發(fā)展以及人口的不斷增加，世界上很多國家都呈現(xiàn)出水體、土壤以及大氣污染日益嚴(yán)重的趨勢。報道指出，中國50%的河流以及80%以上的湖泊已經(jīng)遭受到了污染，地表水的Ⅲ類水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中國的許多湖泊已經(jīng)達(dá)不到了。全國的耕地中有8000萬hm ²以上受到了不同程度的污染, 而其中最突出的問題就是有機(jī)污染物以及重金屬的污染, 這一情況已經(jīng)嚴(yán)重制約了中國可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的實施，甚至威脅到了國人的健康。

傳統(tǒng)的水體修復(fù)技術(shù)比如截污、底泥疏浚等雖然暫時能夠起一些作用，但是都治標(biāo)不治本，而生物修復(fù)限制因素有很多，比如環(huán)境溫度和酸堿性等, 這就使得生物修復(fù)客觀上存在著很大的局限性。作為傳統(tǒng)的污染土壤修復(fù)方法，客土法、淋濾法費時費力，并且對于大面積的修復(fù)起不到很好的作用。與傳統(tǒng)的環(huán)境修復(fù)方法相比較, 將納米材料用于重金屬修復(fù)，因其超強(qiáng)的吸附能力和超大的比表面積，不僅不存在傳統(tǒng)方法的缺點，還表現(xiàn)出極高的修復(fù)效率。另外大氣污染方面形勢也是十分嚴(yán)峻，空氣中超標(biāo)的SO₂、 CO和NO_x等時刻威脅著我們的身體健康。納米材料具有極佳的催化效率，甚至能夠催化極不易發(fā)生的反應(yīng)為解決產(chǎn)生大氣污染問題提供了新的方法和思路。因此，利用納米材料解決水體和土壤以及大氣的污染問題越來越值得人們關(guān)注。而碳納米材料的研究又是其中極有發(fā)展前景的領(lǐng)域。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)碳納米管能夠有效的吸附水體中重金屬離子。Li 等的實驗表明碳納米管能夠吸附水體中的鉛離子，并且與溶液的PH值有很大的相關(guān)性。隨著溶液 pH值的增加，碳納米管對鉛離子的吸附能力也隨之增大。Langmuir和 Freundlich 模型可以解釋這個吸附過程。隨后，Li 等還研究了不同氧化方式處理的碳納米管對鎘離子的吸附效果比較，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過氧化處理后，碳納米管的比表面積顯著增加，表面官能團(tuán)的數(shù)量也有明顯增多。具體來說，碳納米管經(jīng)KMnO₄氧化之后的吸附效果明顯高于 H₂O₂和 HNO₃的氧化效果。另外，Li 等人接下來又進(jìn)行了碳納米管吸附銅離子的實驗、研究了不同形態(tài)的碳納米管對鉛離子的吸附比較、碳納米管對鉛離子的吸附動力學(xué)性質(zhì)以及解吸附的情況，并且討論了碳納米管對鉛離子、銅離子以及鎘離子在相同溶液中的競爭吸附情況。研究發(fā)現(xiàn)，碳納米管對對溶液中以上三種不同離子的吸附順序為Pb²⁺＞Cu²⁺＞Cd²⁺， 其中對鉛離子（Pb²⁺）、銅離子（Cu²⁺）的吸附可以用Langmuir 方程解釋。

李延輝等利用HNO₃氧化處理的碳納米管進(jìn)行了對Pb²⁺的吸附實驗。研究發(fā)現(xiàn)HNO₃氧化處理之后的碳納米管表面積明顯增大，另外-OH、-CO、-COOH等官能團(tuán)被引入到了碳納米管的表面。這能夠明顯增強(qiáng)碳納米管吸附Pb²⁺的作用面積以及作用力，從而提高碳納米管對Pb²⁺的吸附量。結(jié)果表明，吸附量隨著溫度的升高而升高，這說明碳納米管對Pb²⁺的吸附是一個放熱過程。再生試驗表明，吸附效果隨pH值的增加而顯著增加。當(dāng)pH低至2時，碳納米管上吸附的Pb²⁺脫附率到了85%，從而為實現(xiàn)碳納米管吸附材料的循環(huán)利用提供了理論依據(jù)。

除此之外，石墨烯和氧化石墨烯對于有機(jī)物污染以及由石油泄露造成的環(huán)境污染也有很強(qiáng)的修復(fù)作用。石墨烯改性之后對環(huán)境中污染物的吸附效果更佳，并且吸附量增大、性能更加穩(wěn)定。Chen 等人^]制備出的三維多孔氧化石墨烯薄膜在選擇吸附方面表現(xiàn)出了巨大的潛力。它吸附機(jī)油的重量能夠達(dá)到自身重量的37 倍，吸附有機(jī)溶劑的重量則大于自身重量的 26 倍，它的吸附效果相比片狀石墨烯和泡沫石墨烯高很多。除此之外，該多孔氧化石墨烯薄膜的性質(zhì)十分穩(wěn)定，可利用己烷去除表面的吸附物質(zhì)之后循環(huán)利用。較高的吸附量和較長的循環(huán)使用次數(shù)使得該三維多孔氧化石墨烯薄膜去除有機(jī)物以及清理石油污染方面表現(xiàn)出了極大的應(yīng)用前景。

上述分析表明，石墨烯和碳納米管等碳納米材料在環(huán)境領(lǐng)域的應(yīng)用主要在土壤、水體以及大氣污染修復(fù)方面，而作為生物調(diào)控劑進(jìn)行應(yīng)用，尤其碳納米材料在堆肥草坪基質(zhì)中作為微生物調(diào)控劑，研究目前尚無文獻(xiàn)報道。

隨著我國經(jīng)濟(jì)增長和城市化速度的加快，城市生活和生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的垃圾廢物呈現(xiàn)顯著增加的趨勢。與此同時，生活垃圾的配套處理卻還不夠完備，大量垃圾暴露在城市中，對環(huán)境造成了很大的影響。堆肥化處理是城市生活垃圾處理及資源化比較便捷的方式，這不僅能夠消化城市中的生活垃圾，緩解了生活垃圾帶來的城市環(huán)境壓力，同時也生產(chǎn)出了大量堆肥肥料供給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

生活垃圾中含有大量植物生長所必需的營養(yǎng)元素，因此將生活垃圾堆肥化處理并將堆肥用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)是其資源化利用的有效途徑。

研究發(fā)現(xiàn)將適量垃圾堆肥添加到土壤當(dāng)中能夠有效增加作物產(chǎn)量。因土壤理化性質(zhì)以及作物類型不同，其增幅也存在顯著差異。周德智等^]研究了添加垃圾堆肥后，黃棕壤、潮土以及紅壤中種植的小麥產(chǎn)量變化。結(jié)果顯示，添加適量垃圾堆肥后，作物均有增產(chǎn)效果，其中紅壤土效果最好(作物增產(chǎn)46%)。賀立源等^[43]研究發(fā)現(xiàn)，小白菜的產(chǎn)量隨著垃圾堆肥施用量的提高而增加，且與對照相比差異達(dá)到顯著水平。此外，堆肥的施用不僅對作物產(chǎn)量有影響，對作物的品質(zhì)也有顯著的提高效果。方亭等人的研究發(fā)現(xiàn)，將垃圾堆肥添加到棕紅壤土中，土壤作物油菜的籽粒中蛋白質(zhì)的含量顯著升高，大豆籽粒中所含的蛋白質(zhì)明顯增加。

然而，近些年來人們也開始意識到垃圾堆肥中不僅含有營養(yǎng)物質(zhì)，同時還含有一定量的重金屬，如果長期施用會增加土壤中重金屬的含量。因此,將堆肥用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)可能會帶來一系列的食品安全問題?？梢姡荛_食物鏈實現(xiàn)垃圾堆肥的資源化利用意義重大。不僅如此，為防止堆肥利用導(dǎo)致土壤重金屬污染，甚至給生態(tài)環(huán)境帶來威脅，在應(yīng)用的同時必須考慮重金屬修復(fù)的問題。

傳統(tǒng)的草皮生產(chǎn)通常是利用優(yōu)質(zhì)土壤。這會對土壤的物理性質(zhì)產(chǎn)生很大的影響，導(dǎo)致肥力下降。另外草皮生產(chǎn)時2 cm以上的耕層土壤會被帶走，肥沃的耕層土壤進(jìn)入城市生態(tài)系統(tǒng)，而經(jīng)過幾次的草皮生產(chǎn)之后，農(nóng)田土壤將變得越來越貧瘠，以致于最終無法再進(jìn)行農(nóng)業(yè)生產(chǎn), 這是對國土資源極大的浪費。如果草坪建植以生活垃圾堆肥作為基本體系，不僅能夠消化城市垃圾，還能夠減輕草坪生產(chǎn)帶給耕層土壤的破壞作用。

納米技術(shù)近年來發(fā)展十分迅速，在材料、信息、環(huán)境等方面均表現(xiàn)出了廣闊的應(yīng)用前景。雖然已經(jīng)有一些研究理論研究，表明納米材料會對微生物的生長產(chǎn)生不同程度的影響，但應(yīng)用其調(diào)控作用，還尚無相關(guān)技術(shù)報道。

眾所周知，放線菌具有很高的經(jīng)濟(jì)價值，用途也十分廣泛。8000多種從微生物中發(fā)現(xiàn)的活性物質(zhì)中有近70%來自放線菌。但由于培養(yǎng)條件等的限制，目前人們分離得到的放線菌種類只占土壤中放線菌總數(shù)的10%左右。這一數(shù)量與我們未知的相比還有很大差距。一些放線菌還能夠產(chǎn)生蛋白酶等各種具有工業(yè)用途的酶。在纖維素降解、污水處理方面，放線菌也發(fā)揮著重要的作用。利用放線菌產(chǎn)生的抗生素來制備的新型農(nóng)藥, 已經(jīng)成為未來農(nóng)藥生產(chǎn)極有前景的發(fā)展方向。

放線菌可以說是與人類關(guān)系最密切的一類微生物，各種環(huán)境中都有它的身影而且形態(tài)各異。到目前為止人類發(fā)現(xiàn)的所有天然抗生素中，有70%都是鏈放線菌生產(chǎn)的。而其中由鏈霉素產(chǎn)的抗生素就有一半以上。鏈霉菌屬于革蘭氏陽性的放線菌，生活周期復(fù)雜并且能夠產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物。放線菌本身就是最大的一類能夠產(chǎn)生抗生素活性的微生物，而鏈霉菌又是其中抗生素的主要產(chǎn)生菌，物種多樣性豐富，是重要的資源微生物。

絕大多數(shù)鏈霉菌對人類是無害的，并且他們產(chǎn)生的抗生素還能夠特異性的作用于某些病原體，抑制其生長。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多抗生素都是來自于鏈霉素，例如四環(huán)素、氯霉素、鏈霉素等等。這些抗生素的發(fā)現(xiàn)對人類社會的發(fā)展起到了顯而易見的促進(jìn)作用。因此，碳納米材料調(diào)控下草坪堆肥基質(zhì)體系放線菌鑒定分析方法具有重要的應(yīng)用價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

碳納米材料因其特殊的結(jié)構(gòu)具有很大的應(yīng)用范圍，吸附水體和土壤中的重金屬就是其中一項重要的應(yīng)用。本技術(shù)從基質(zhì)微生物角度出發(fā)，以生活垃圾堆肥和土壤混合物為草坪基質(zhì)材料，以向其中混合四種不同碳納米材料作為處理組，通過草坪植物培養(yǎng)，添加不同碳納米材料草坪基質(zhì)基質(zhì)中可培養(yǎng)放線菌類群變化的認(rèn)識，以分子測序技術(shù)鑒定分析基質(zhì)中可培養(yǎng)放線菌的分類地位，為碳納米材料在垃圾堆肥草坪基質(zhì)中放線菌調(diào)控應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

為實現(xiàn)上述目的本發(fā)明公開了如下的技術(shù)內(nèi)容：

一種采用碳納米材料調(diào)控草坪堆肥基質(zhì)放線菌鑒定分析的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行：

（1）實驗材料

實驗用土壤取自天津師范大學(xué)校園0-20 cm表層土壤，基本性質(zhì)為：含水量19.4%，pH 7.27，電導(dǎo)率2250 μS/cm，有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮分別為52.3、3.75、2.15 g/kg。

實驗用生活垃圾堆肥來自天津市小淀垃圾處理廠。pH為7.49，電導(dǎo)率2300 μS/cm，有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮分別為132、6.81、25.1 g/kg。重金屬Cr、Cu、Pb、Zn、Cd含量分別為703、341、217、677、5.01 mg/kg。

供試納米炭黑（CB）購于天津秋實炭黑廠，粒徑為20~70 nm，比表面積為 1200 m²/g，pH 值為7.0，實驗前利用KMnO₄對其改性處理。

石墨烯(G)微片購于南京吉倉納米科技有限公司，結(jié)構(gòu)為黑色薄片狀，微片尺寸0.5-20 um，厚度5-25 nm，比表面積40-60 m²/g，密度約2.25 g/cm³，電導(dǎo)率 8000-10000 S/m，含碳量>99.5%。

氧化石墨烯(GO)購于蘇州恒球納米公司，為黑色或褐黃色粉末，平均厚度3.4-7 nm，片層直徑10-50 μm，比表面積100-300 m²/g，純度>90%。

碳納米管(CNT)購于北京博宇高科技新材料技術(shù)有限公司，直徑20-40 nm，長度10-30 um，-COOH含量1.43%，純度>90wt%，灰粉<8wt%，比表面積>110 m²/g，導(dǎo)電：>102 s/cm。

（2）實驗方法：

取土后立即測量土壤含水量，計算得到土壤干重與濕重的比例。按照比例算得干重1500 g所對應(yīng)的濕土重量。稱得相應(yīng)重量的濕土與30 g垃圾堆肥混合，攪拌均勻，裝入內(nèi)徑15 cm高20 cm的塑料花盆中，共裝15盆。

實驗共設(shè)5個處理，石墨烯（G）、氧化石墨烯(GO)、碳納米管(CNT)、改性納米炭黑(CB)按干土重1%的比例分別加入到混合基質(zhì)中，以不添加碳納米材料的處理為對照（CK），添加碳納米材料后充分混勻，每盆播種高羊茅種子5g。培養(yǎng)期間溫度為 19~27 ℃，相對濕度為 60~72%，每天給土壤補(bǔ)充水分，使土壤濕度保持在土壤持水量的70%。培養(yǎng)130d后，將盆中0-5cm深度土壤取出混勻，過60目篩，冰箱-20℃保存，供微生物分離與計數(shù)分析。

本發(fā)明進(jìn)一步公開加了采用碳納米材料調(diào)控草坪堆肥基質(zhì)放線菌鑒定分析方法在確定放線菌菌落的組成方面的應(yīng)用。本發(fā)明分離出的11株放線菌菌株序列遺傳變異性較低。其中菌株1、3、4、5、6、7、8、10分別與鏈霉菌菌株Streptomycessp. ZZY-2013 strain TRM46798-28、Streptomyces griseoplanus strain Ca314、Streptomycessp. GS10、Streptomyces microflavus strain HBUM174884、Streptomycessp. HYKH4/C1、Streptomycessp. HBUM179165-2、Streptomyces griseoplanus strain Ca314、Streptomyces sp. XAS586的相似度達(dá)到了97%以上，而菌株2、9、11與已知菌株的遺傳相似性分別為 92%、89%和94%，所以可能是潛在新種。

本發(fā)明所述的納米碳是指石墨烯、氧化石墨烯、碳納米管、納米炭黑（CB）。納米炭黑（CB）實驗前利用KMnO₄對其改性處理指的是：稱取納米碳10 g于250 mL錐形瓶中，加入100 mL0.03 mol·L^-1的KMnO₄溶液，靜置10 min后，放于萬用電熱器上沸騰回流1 h。冷卻后，用去離子水反復(fù)沖洗，使溶液不再渾濁且pH穩(wěn)定。轉(zhuǎn)移至燒杯，110℃條件下烘干至恒重。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了采用碳納米材料調(diào)控草坪堆肥基質(zhì)放線菌鑒定分析方法在確定放線菌菌落的組成方面的應(yīng)用。主要指的是：發(fā)現(xiàn)的11株放線菌均為鏈霉菌屬（Streptomyces）。

本發(fā)明更加詳細(xì)的描述如下：

1研制材料與方法

1.1實驗材料

實驗用土壤取自天津師范大學(xué)校園0-20 cm表層土壤，基本性質(zhì)為：含水量19.4%，pH 7.27，電導(dǎo)率2250 μS/cm，有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮分別為52.3、3.75、2.15 g/kg。

實驗用生活垃圾堆肥來自天津市小淀垃圾處理廠。pH為7.49，電導(dǎo)率2300 μS/cm，有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮分別為132、6.81、25.1 g/kg。重金屬Cr、Cu、Pb、Zn、Cd含量分別為703、341、217、677、5.01 mg/kg。

供試納米炭黑（CB）購于天津秋實炭黑廠，粒徑為20~70 nm，比表面積為 1200 m²/g，pH 值為7.0，實驗前利用KMnO₄對其改性處理。

石墨烯(G)微片購于南京吉倉納米科技有限公司，結(jié)構(gòu)為黑色薄片狀，微片尺寸0.5-20 um，厚度5-25 nm，比表面積40-60 m²/g，密度約2.25 g/cm³，電導(dǎo)率 8000-10000 S/m，含碳量>99.5%。

氧化石墨烯(GO)購于蘇州恒球納米公司，為黑色或褐黃色粉末，平均厚度3.4-7 nm，片層直徑10-50 μm，比表面積100-300 m²/g，純度>90%。

碳納米管(CNT)購于北京博宇高科技新材料技術(shù)有限公司，直徑20-40 nm，長度10-30 um，-COOH含量1.43%，純度>90wt%，灰粉<8wt%，比表面積>110 m²/g，導(dǎo)電：>102 s/cm。

技術(shù)設(shè)計

取土后立即測量土壤含水量，計算得到土壤干重與濕重的比例。按照比例算得干重1500 g所對應(yīng)的濕土重量。稱得相應(yīng)重量的濕土與30 g垃圾堆肥混合，攪拌均勻，裝入內(nèi)徑15 cm高20 cm的塑料花盆中，共裝15盆。

實驗共設(shè)5個處理，石墨烯（G）、氧化石墨烯(GO)、碳納米管(CNT)、改性納米炭黑(CB)按干土重1%的比例分別加入到混合基質(zhì)中，以不添加碳納米材料的處理為對照（CK），每個處理三次重復(fù)。添加碳納米材料后充分混勻，每盆播種高羊茅種子5g。培養(yǎng)期間溫度為 19~27 ℃，相對濕度為 60~72%，每天給土壤補(bǔ)充水分，使土壤濕度保持在土壤持水量的70%。培養(yǎng)130d后，將盆中0-5cm深度土壤取出混勻，過60目篩，冰箱-20℃保存，供微生物分離與計數(shù)分析。

.3研制方法

1.3.1放線菌培養(yǎng)基配制方法

培養(yǎng)放線菌用高氏一號培養(yǎng)，具體配方為可溶性淀粉20g、 KNO₃ 1g、K₂HPO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO₄· 7H₂O 0.01g、瓊脂 18g，利用NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH到7.4-7.6。121℃滅菌20分鐘，室溫晾至50-60℃時倒入培養(yǎng)皿備用。

1.3.2 放線菌培養(yǎng)最適濃度的確定

根據(jù)微生物學(xué)實驗指導(dǎo)以及以往培養(yǎng)經(jīng)驗初步確定放線菌培養(yǎng)觀察的最適濃度在10^-3-10^-5之間。取0.5g對照組中的基質(zhì)土壤倒入裝有50ml無菌水的錐形瓶中，封口后置于搖床上，以 150 rpm 振蕩 20 min。振蕩停止后靜置 10 S。吸取l mL土壤浸出液移入試管中并添加9 mL 無菌水，將其稀釋10倍，制成10^-3濃度的土壤浸出液，之后利用此方法分別制成10^-4、10^-5濃度的土壤浸出液。取200ul土壤浸出液均勻涂布到LB培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿倒置放入37度的恒溫培養(yǎng)箱中，避光培養(yǎng)。連續(xù)觀察放線菌生長情況，待其大小適宜數(shù)量穩(wěn)定后進(jìn)行計數(shù)。預(yù)實驗的結(jié)果發(fā)現(xiàn)10^-4這一濃度培養(yǎng)出的放線菌數(shù)量偏少，而10^-3這一濃度培養(yǎng)出的放線菌數(shù)量又偏多，經(jīng)過第二次預(yù)實驗最終確定5*10^-3這個濃度為放線菌培養(yǎng)的最適濃度。培養(yǎng)最適時間為6d。

放線菌平板計數(shù)方法

通過預(yù)實驗已確定出最適濃度為5*10^-3，所以實驗可以直接將草坪堆肥基質(zhì)稀釋5000倍進(jìn)行培養(yǎng)。具體操作過程為：稱取0.5g土壤將其倒入裝有50 mL無菌水的錐形瓶中，封口后置于搖床上，以 150 rpm 振蕩 20 min。振蕩停止后靜置 10 s。吸取1mL 土壤浸出液移入裝有50ml無菌水的錐形瓶中制成5*10^-3濃度的土壤懸濁液，充分混勻后，吸取 200uL并將其注射到固體LB培養(yǎng)基上，涂布均勻，之后將培養(yǎng)皿倒置于 37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6d，選取菌落數(shù)在 30-300范圍內(nèi)的平板進(jìn)行分離計數(shù)，并按照其不同菌落特征歸類、編號。之后進(jìn)行劃線純培養(yǎng)以達(dá)到對分離到的放線菌純化的目的。將培養(yǎng)皿做好標(biāo)簽倒置于37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d，之后轉(zhuǎn)移到 4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

放線菌的分子生物學(xué)鑒定方法

由于放線菌細(xì)胞中的16s rDNA一部分堿基序列十分保守的，不受微生物所處環(huán)境條件的影響，而一部分序列又是可變的，因此，可以通過分析比較放線菌之間16S rDNA的同源性，揭示它們的親緣關(guān)系以及系統(tǒng)發(fā)育地位。

利用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒（上海生工）提取純培養(yǎng)得到的放線菌基因組DNA，其過程按照試劑盒要求進(jìn)行。將所得基因組DNA用于放線菌 16S rDNA的PCR擴(kuò)增。引物為 27f：

5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTCAG-3′ 1492r：

5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′

PCR 反應(yīng)條件與步驟：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，55℃退火45s，72℃延伸45s，30個循環(huán)，72℃延伸10min。擴(kuò)增體系如下（50 μL）：引物1(27F) 2μL；引物2(1492R) 2μL；10x Buffer(Mg²⁺) 5μL；dNTP 1μL；Taq酶 1μL；DNA模板 10μL；ddH2O 29μL。吸取不同擴(kuò)增產(chǎn)物各7μL分別與2μL 6×Glycerol DNA loading buffer混合均勻，吸取7μL混合液進(jìn)行點樣，并進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠浸入EB水溶液中染色10min，在紫外凝膠成像系統(tǒng)中觀察，觀察到明亮目標(biāo)條帶后，將實驗所得PCR產(chǎn)物交由北京華大基因公司純化與測序。

.3.5放線菌16SrDNA序列分析方法

測序結(jié)果經(jīng) NCBI Blast( http: ∥www．ncbi．nlm．nih．gov)比對分析，獲得相似度最高的五個菌株的16SrDNA 序列。運用ClustalX進(jìn)行多重對比、用MEGA 軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用Neighbor-join法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，自展數(shù)(Bootstrap)為1000。根據(jù)序列的同源程度初步確定待鑒定的菌株在分類學(xué)上的地位。將培養(yǎng)得到菌株與NCBI數(shù)據(jù)庫中的模式菌株進(jìn)行比較，如果相似度達(dá)到96%以上，那么可將培養(yǎng)得到的菌株與模式菌株歸為一個屬，也就將培養(yǎng)菌株鑒定到了屬的水平。

2 研制結(jié)果分析

2.1基質(zhì)中可培養(yǎng)放線菌的 16SrDNA 分析

經(jīng)過對草坪堆肥基質(zhì)中放線菌的培養(yǎng)計數(shù)以及種類劃分歸類，挑選出了不同特征的放線菌菌落。圖1是對其進(jìn)行16SrDNA擴(kuò)增之后的電泳圖。

通過對不同放線菌16SrDNA的PCR過程，得到了多條擴(kuò)增片段，將其對應(yīng)的PCR產(chǎn)物送測后得到以下檢測結(jié)果：

本技術(shù)共獲得的11有效序列，將獲得的序列通過Blast 程序與 Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫中已知序列進(jìn)行相似性比對，其類別信息、相似性百分比及 GenBank登錄號見表 1。

表1 基質(zhì)中可培養(yǎng)放線菌的16SrDNA 序列相似性分析

通過序列相似性分析發(fā)現(xiàn)本技術(shù)得到的11株放線菌均為鏈霉菌屬（Streptomyces）。

將本技術(shù)分離出的11形態(tài)不同的放線菌菌株的測序結(jié)果進(jìn)行Blast分析及多重比對，之后利用MEGA5.1以 16SrDNA 同源性為基礎(chǔ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

研制結(jié)論

本技術(shù)分離出的11株放線菌菌株序列遺傳變異性較低。其中菌株1、3、4、5、6、7、8、10分別與鏈霉菌菌株Streptomycessp. ZZY-2013 strain TRM46798-28、Streptomyces griseoplanus strain Ca314、Streptomycessp. GS10、Streptomyces microflavus strain HBUM174884、Streptomycessp. HYKH4/C1、Streptomycessp. HBUM179165-2、Streptomyces griseoplanus strain Ca314、Streptomyces sp. XAS586的相似度達(dá)到了97%以上，而菌株2、9、11與已知菌株的遺傳相似性分別為 92%、89%和94%，所以可能是潛在新種。

附圖說明:

圖1是放線菌16SrDNA 的PCR擴(kuò)增結(jié)果；

圖2是放線菌16SrDNA 的PCR重復(fù)擴(kuò)增結(jié)果。

具體實施方式：

下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所用原料、試劑均有市售。

實施例1

（1）實驗材料

實驗用土壤取自天津師范大學(xué)校園10 cm表層土壤，基本性質(zhì)為：含水量19.4%，pH 7.27，電導(dǎo)率2250 μS/cm，有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮分別為52.3、3.75、2.15 g/kg。

實驗用生活垃圾堆肥來自天津市小淀垃圾處理廠。pH為7.49，電導(dǎo)率2300 μS/cm，有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮分別為132、6.81、25.1 g/kg。重金屬Cr、Cu、Pb、Zn、Cd含量分別為703、341、217、677、5.01 mg/kg。

供試納米炭黑（CB）購于天津秋實炭黑廠，粒徑為20 nm，比表面積為 1200 m²/g，pH 值為7.0，實驗前利用KMnO₄對其改性處理。

石墨烯(G)微片購于南京吉倉納米科技有限公司，結(jié)構(gòu)為黑色薄片狀，微片尺寸0.5 um，厚度5 nm，比表面積40 m²/g，密度約2.25 g/cm³，電導(dǎo)率 8000 S/m，含碳量>99.5%。

氧化石墨烯(GO)購于蘇州恒球納米公司，為黑色或褐黃色粉末，平均厚度3.4-7 nm，片層直徑10μm，比表面積100 m²/g，純度>90%。

碳納米管(CNT)購于北京博宇高科技新材料技術(shù)有限公司，直徑20 nm，長度10um，-COOH含量1.43%，純度>90wt%，灰粉<8wt%，比表面積>110 m²/g，導(dǎo)電：>102 s/cm。

（2）實驗方法：

取土后立即測量土壤含水量，計算得到土壤干重與濕重的比例。按照比例算得干重1500 g所對應(yīng)的濕土重量。稱得相應(yīng)重量的濕土與30 g垃圾堆肥混合，攪拌均勻，裝入內(nèi)徑15 cm高20 cm的塑料花盆中，共裝15盆。

實驗共設(shè)5個處理，石墨烯（G）、氧化石墨烯(GO)、碳納米管(CNT)、改性納米炭黑(CB)按干土重1%的比例分別加入到混合基質(zhì)中，以不添加碳納米材料的處理為對照（CK），添加碳納米材料后充分混勻，每盆播種高羊茅種子5g。培養(yǎng)期間溫度為 19 ℃，相對濕度為 60%，每天給土壤補(bǔ)充水分，使土壤濕度保持在土壤持水量的70%。培養(yǎng)130d后，將盆中1cm深度土壤取出混勻，過60目篩，冰箱-20℃保存，供微生物分離與計數(shù)分析。

實施例2

（1）實驗材料

實驗用土壤取自天津師范大學(xué)校園20 cm表層土壤，基本性質(zhì)為：含水量19.4%，pH 7.27，電導(dǎo)率2250 μS/cm，有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮分別為52.3、3.75、2.15 g/kg。

實驗用生活垃圾堆肥來自天津市小淀垃圾處理廠。pH為7.49，電導(dǎo)率2300 μS/cm，有機(jī)質(zhì)、全磷、全氮分別為132、6.81、25.1 g/kg。重金屬Cr、Cu、Pb、Zn、Cd含量分別為703、341、217、677、5.01 mg/kg。

供試納米炭黑（CB）購于天津秋實炭黑廠，粒徑為70 nm，比表面積為 1200 m²/g，pH 值為7.0，實驗前利用KMnO₄對其改性處理。

石墨烯(G)微片購于南京吉倉納米科技有限公司，結(jié)構(gòu)為黑色薄片狀，微片尺寸20 um，厚度25 nm，比表面積60 m²/g，密度約2.25 g/cm³，電導(dǎo)率 10000 S/m，含碳量>99.5%。

氧化石墨烯(GO)購于蘇州恒球納米公司，為黑色或褐黃色粉末，平均厚度7 nm，片層直徑50 μm，比表面積100-300 m²/g，純度>90%。

碳納米管(CNT)購于北京博宇高科技新材料技術(shù)有限公司，直徑40 nm，長度30 um，-COOH含量1.43%，純度>90wt%，灰粉<8wt%，比表面積>110 m²/g，導(dǎo)電：>102 s/cm。

（2）實驗方法：

取土后立即測量土壤含水量，計算得到土壤干重與濕重的比例。按照比例算得干重1500 g所對應(yīng)的濕土重量。稱得相應(yīng)重量的濕土與30 g垃圾堆肥混合，攪拌均勻，裝入內(nèi)徑15 cm高20 cm的塑料花盆中，共裝15盆。

實驗共設(shè)5個處理，石墨烯（G）、氧化石墨烯(GO)、碳納米管(CNT)、改性納米炭黑(CB)按干土重1%的比例分別加入到混合基質(zhì)中，以不添加碳納米材料的處理為對照（CK），添加碳納米材料后充分混勻，每盆播種高羊茅種子5g。培養(yǎng)期間溫度為 27 ℃，相對濕度為 72%，每天給土壤補(bǔ)充水分，使土壤濕度保持在土壤持水量的70%。培養(yǎng)130d后，將盆中5cm深度土壤取出混勻，過60目篩，冰箱-20℃保存，供微生物分離與計數(shù)分析。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津師范大學(xué)

<120> 采用碳納米材料調(diào)控草坪堆肥基質(zhì)放線菌鑒定分析方法

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttgat cctggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19