本發(fā)明涉及毛葉藤仲懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快繁方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

毛葉藤仲，又名剎搶龍喃（傣語(yǔ)），Chonemorpha valvata Chatt.，夾竹桃科，粗壯木質(zhì)藤本；幼枝被黃色短柔毛，小枝上的皮孔不明顯，葉寬卵形或近圓形，長(zhǎng)15-30厘米，寬10-20厘米，葉背被短柔毛，聚傘花序頂生；花萼5裂至基部，裂片鑷合狀排列，內(nèi)面基部具有齒狀腺體；花冠淡紅色，冠筒內(nèi)面密被柔毛，裂片倒三角形，長(zhǎng)4厘米，頂端寬4厘米；雄蕊著生于冠筒的中部，花絲被微柔毛；花盤環(huán)狀，頂端淺裂，比子房短；子房無(wú)毛，花柱頂端被微毛，蓇葖果雙生，平行；種子扁平，花期春夏季，果期秋冬季。毛葉藤仲產(chǎn)于我國(guó)西南部；生于海拔900-1600米山地密林中或溝谷蔭濕地方，緬甸、泰國(guó)也有，莖可藥用，可治骨折筋傷、風(fēng)濕骨痛和外傷出血等疾病，目前對(duì)毛葉藤仲的采集主要是野外采收，無(wú)相關(guān)種植研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是毛葉藤仲懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的快速繁殖方法，本發(fā)明方法研究了不同培養(yǎng)條件下擬南芥懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，旨在探索維持?jǐn)M南芥懸浮細(xì)胞正常穩(wěn)定生長(zhǎng)的培養(yǎng)技術(shù)，并為擬南芥懸浮細(xì)胞進(jìn)一步的遺傳操作提供良好的受體材料和科學(xué)依據(jù)。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用下列技術(shù)方案：

取毛葉藤仲葉片，流水沖洗干凈，毛刷去除表面污垢，超凈工作臺(tái)上1%溴水處理3min，0.1%升汞處理5min，無(wú)菌水沖洗干凈至無(wú)殘留，消毒處理過的葉片接入NH+6-BA3mg/L+ZT2mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，附加7g/L瓊脂，30g/L蔗糖，暗培養(yǎng)，溫度25℃，誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織接入培養(yǎng)基NH+2，4-D0.1-0.3mg/L+KT0.2-0.3mg/L中進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，附加50g/L蔗糖，光照1500lx，光照時(shí)間8h/d，溫度25℃，每7 d繼代1次，取45 mL前述液體培養(yǎng)基注于300mL三角瓶，正常培養(yǎng)時(shí)接種5mL起始懸浮細(xì)胞液（每瓶總體積50 mL），鋁鉑紙封口，置于光照培養(yǎng)室中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：23℃，24h光照，120 r/min，繼代培養(yǎng)一個(gè)月的懸浮細(xì)胞進(jìn)行生物量的測(cè)定，懸浮細(xì)胞充分混合均勻后取1mL，懸浮細(xì)胞液，注入預(yù)先稱重的2mL eppendorf管（每管約1mg），微型高速離心機(jī)中10000r/min離心15min，真空吸去上清液，室溫下敞口自然風(fēng)干24h，稱重，減去空管重量即為1mL懸浮細(xì)胞液的鮮生物量，重復(fù)3次，懸浮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活性的測(cè)定：取1mL懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液和1mL0.4％TTC溶液，充分混勻后于室溫下暗反應(yīng)2h，此時(shí)活細(xì)胞染成紅色，離心，真空吸去TTC溶液，去離子水洗滌3遍，加入5mL的95乙醇，置于振蕩機(jī)上輕柔振蕩提取TTF 9h，取乙醇提取液，在分光光度計(jì)上485nm處測(cè)定OD值，3個(gè)重復(fù)。

采用本發(fā)明制備的毛葉藤仲細(xì)胞活性高，生物量增長(zhǎng)率高，無(wú)污染，利于大規(guī)模培養(yǎng)。

下面將結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明要求保護(hù)的范圍并不局限于下列實(shí)施方式。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

取毛葉藤仲葉片，流水沖洗干凈，毛刷去除表面污垢，超凈工作臺(tái)上1%溴水處理3min，0.1%升汞處理5min，無(wú)菌水沖洗干凈至無(wú)殘留，消毒處理過的葉片接入NH+6-BA3mg/L+ZT2mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，附加7g/L瓊脂，30g/L蔗糖，暗培養(yǎng)，溫度25℃，誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織接入培養(yǎng)基NH+2,4-D0.1mg/L+KT0.2mg/L中進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，附加50g/L蔗糖，光照1500lx，光照時(shí)間8h/d，溫度25℃，每7 d繼代1次，取45 mL前述液體培養(yǎng)基注于300 mL三角瓶，正常培養(yǎng)時(shí)接種5 mL起始懸浮細(xì)胞液（每瓶總體積50 mL），鋁鉑紙封口，置于光照培養(yǎng)室中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：23℃，24h光照，120 r/min，繼代培養(yǎng)一個(gè)月的懸浮細(xì)胞進(jìn)行生物量的測(cè)定，懸浮細(xì)胞充分混合均勻后取1 mL，懸浮細(xì)胞液，注入預(yù)先稱重的2mL eppendorf管（每管約1mg），微型高速離心機(jī)中10000 r/min離心15min，真空吸去上清液，室溫下敞口自然風(fēng)干24h，稱重，減去空管重量即為1mL懸浮細(xì)胞液的鮮生物量，重復(fù)3次，懸浮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活性的測(cè)定：取1mL懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液和1mL0.4％TTC溶液，充分混勻后于室溫下暗反應(yīng)2h，此時(shí)活細(xì)胞染成紅色，離心，真空吸去TTC溶液，去離子水洗滌3遍，加入5 mL的95 乙醇，置于振蕩機(jī)上輕柔振蕩提取TTF 9 h，取乙醇提取液，在分光光度計(jì)上485 nm處測(cè)定OD值，3個(gè)重復(fù)，懸浮細(xì)胞增殖率高達(dá)80%。

實(shí)施例2

取毛葉藤仲葉片，流水沖洗干凈，毛刷去除表面污垢，超凈工作臺(tái)上1%溴水處理3min，0.1%升汞處理5min，無(wú)菌水沖洗干凈至無(wú)殘留，消毒處理過的葉片接入NH+6-BA3mg/L+ZT2mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，附加7g/L瓊脂，30g/L蔗糖，暗培養(yǎng)，溫度25℃，誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織接入培養(yǎng)基NH+2,4-D0.3mg/L+KT0.3mg/L中進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，附加50g/L蔗糖，光照1500lx，光照時(shí)間8h/d，溫度25℃，每7 d繼代1次，取45 mL前述液體培養(yǎng)基注于300 mL三角瓶，正常培養(yǎng)時(shí)接種5 mI 起始懸浮細(xì)胞液（每瓶總體積50 mL），鋁鉑紙封口，置于光照培養(yǎng)室中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：23℃，24h光照，120 r/min，繼代培養(yǎng)一個(gè)月的懸浮細(xì)胞進(jìn)行生物量的測(cè)定，懸浮細(xì)胞充分混合均勻后取1 mL，懸浮細(xì)胞液，注入預(yù)先稱重的2mL eppendorf管（每管約1mg），微型高速離心機(jī)中10000 r/min離心15min，真空吸去上清液，室溫下敞口自然風(fēng)干24h，稱重，減去空管重量即為1mL懸浮細(xì)胞液的鮮生物量，重復(fù)3次，懸浮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活性的測(cè)定：取1mL懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液和1mL0.4％TTC溶液，充分混勻后于室溫下暗反應(yīng)2h，此時(shí)活細(xì)胞染成紅色，離心，真空吸去TTC溶液，去離子水洗滌3遍，加入5 mL 的95 乙醇，置于振蕩機(jī)上輕柔振蕩提取TTF 9 h，取乙醇提取液，在分光光度計(jì)上485 nm處測(cè)定OD值，3個(gè)重復(fù)，懸浮細(xì)胞增值率達(dá)88%。

實(shí)施例3

取毛葉藤仲葉片，流水沖洗干凈，毛刷去除表面污垢，超凈工作臺(tái)上1%溴水處理3min，0.1%升汞處理5min，無(wú)菌水沖洗干凈至無(wú)殘留，消毒處理過的葉片接入NH+6-BA3mg/L+ZT2mg/L培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，附加7g/L瓊脂，30g/L蔗糖，暗培養(yǎng)，溫度25℃，誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織接入培養(yǎng)基NH+2,4-D0.2mg/L+KT0.2mg/L中進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，附加50g/L蔗糖，光照1500lx，光照時(shí)間8h/d，溫度25℃，每7 d繼代1次，取45 mL前述液體培養(yǎng)基注于300 mL 三角瓶，正常培養(yǎng)時(shí)接種5 mL 起始懸浮細(xì)胞液（每瓶總體積50 mL），鋁鉑紙封口，置于光照培養(yǎng)室中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：23℃，24h光照，120 r/min，繼代培養(yǎng)一個(gè)月的懸浮細(xì)胞進(jìn)行生物量的測(cè)定，懸浮細(xì)胞充分混合均勻后取1 mL，懸浮細(xì)胞液，注入預(yù)先稱重的2mL eppendorf管（每管約1mg），微型高速離心機(jī)中10000 r/min離心15min，真空吸去上清液，室溫下敞口自然風(fēng)干24h，稱重，減去空管重量即為1mL懸浮細(xì)胞液的鮮生物量，重復(fù)3次，懸浮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞活性的測(cè)定：取1mL懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液和1mL0.4％TTC溶液，充分混勻后于室溫下暗反應(yīng)2h，此時(shí)活細(xì)胞染成紅色，離心，真空吸去TTC溶液，去離子水洗滌3遍，加入5 mL的95 乙醇，置于振蕩機(jī)上輕柔振蕩提取TTF 9 h，取乙醇提取液，在分光光度計(jì)上485 nm處測(cè)定OD值，3個(gè)重復(fù)，懸浮細(xì)胞增殖率90%。