本發(fā)明涉及疾病動物模型制備技術領域，具體地，涉及一種前列腺神經(jīng)內分泌癌基因工程動物模型的構建方法及應用。

背景技術：

前列腺癌是男性中常見的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，嚴重影響男性的身體健康，給患者造成心理上的巨大壓力。前列腺癌發(fā)病率與死亡率占男性惡性腫瘤第一位，近年來我國前列腺癌的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。臨床上對于前列腺癌患者的主要的治療方法有手術治療、放射治療、化學療法、內分泌療法等。手術治療是目前治療癌癥的首選方法，但是前列腺癌患者的診斷多在晚期，常錯過手術的最佳時機，并且前列腺根治性手術多損傷較大。放射治療是目前對于前列腺癌的治療十分有效的方法，主要用于無法采用手術治療但尚無遠處轉移的患者。放射治療?？梢允骨傲邢倌[瘤減小。化學療法是作為晚期前列腺癌的輔助治療方法，主要用于手術治療或者放射治療后局部腫瘤已消除的患者?；熕幬锟梢韵凉撛诘?、尚無探測到的微小病灶。但是單獨使用化學療法不能治愈原發(fā)病灶，只有對于采用其他方法治療的患者進行化學療法輔助治療，可以延長病人的生存時間。在臨床上內分泌療法是治療前列腺癌晚期的重要手段。前列腺癌具有典型的激素依賴性，當體內雄激素水平下降時，癌細胞出現(xiàn)死亡，可以使前列腺病變和癥狀明顯得到緩解。

臨床上，絕大部分前列腺癌為起源于外分泌細胞的導管和腺泡腺癌（PCA），5%～10%患者伴有局灶性的神經(jīng)內分泌分化(NED)，而0.5～2％患者則出現(xiàn)廣泛的NED，稱為前列腺神經(jīng)內分泌癌（NEPC），侵襲性更強。盡管目前對于前列腺癌的治療方法有很多種，但是一旦患者腫瘤出現(xiàn)NED，則目前尚無有效的臨床治療手段。NED的發(fā)生與腫瘤的進展、雄激素非依賴轉化和不良預后等有重要關系。臨床上，NEPC對目前治療前列腺癌的主要方法-雄激素阻斷療法無反應，且預后差，患者平均生存時間5～17.5個月。

盡管目前有TRAMP等自發(fā)前列腺癌基因工程小鼠用于前列腺癌治療藥物的開發(fā)，但是模型小鼠前列腺癌病理進程發(fā)展較慢，導致研究周期較長，這嚴重制約了抗前列腺神經(jīng)內分泌癌藥物的開發(fā)研制。所以，尋找新的、對于人類前列腺癌臨床病理發(fā)展過程能夠快速模擬的基因工程小鼠模型，將為臨床前列腺神經(jīng)內分泌癌腫瘤治療提出了新的治療途徑和希望，并具有更加廣闊的應用前景。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術的上述不足，提供一種前列腺神經(jīng)內分泌癌基因工程動物模型的構建方法。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種前列腺神經(jīng)內分泌癌基因工程動物模型在篩選治療前列腺神經(jīng)內分泌癌藥物中的應用。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術方案予以實現(xiàn)的：

一種前列腺神經(jīng)內分泌癌基因工程動物模型的構建方法，包括如下步驟：將敲除PSGL-1基因后的TRAMP小鼠飼養(yǎng)至24周齡以上即得前列腺神經(jīng)內分泌癌基因工程動物模型。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)自發(fā)前列腺癌的TRAMP基因工程小鼠的前列腺腫瘤為腺癌。而在敲除PSGL-1后的TRAMP小鼠(TRAMP;PSGL-1^-/-)飼養(yǎng)至24周齡以上時，前列腺腫瘤出現(xiàn)顯著的神經(jīng)內分泌癌特性。腫瘤組織病理學表現(xiàn)為由燕麥形的小細胞組成，細胞異型性明顯，細胞小，胞漿少，核仁不明顯，幾乎不表達分泌前列腺特異性抗原（PSA），但表達神經(jīng)內分泌細胞標志物，如嗜鉻粒蛋白A（CgA），突觸素（Syn）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE），且電鏡下可見胞漿內含有很多神經(jīng)內分泌顆粒，這些是臨床病理診斷NEPC的依據(jù)，因此，這樣的模型可以作為研究前列腺神經(jīng)內分泌癌發(fā)病機理及篩選靶向藥物和療效評估的動物模型。

優(yōu)選地，所述前列腺神經(jīng)內分泌癌基因工程動物模型的構建方法如下：將雄性PSGL-1^-/-小鼠和雌性TRAMP小鼠雜交得F1代，F(xiàn)1代分籠鑒定；將F1代中的TRAMP陽性; PSGL-1^+/-雌性小鼠與雄性PSGL-1^-/-小鼠雜交得F2代，F(xiàn)2代分籠鑒定；將F2代中的TRAMP陽性; PSGL-1^-/-雌性小鼠與PSGL-1^-/-雄性小鼠雜交獲得F3代，F(xiàn)3代分籠鑒定獲得TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠；TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠飼養(yǎng)至24周齡以上即得前列腺神經(jīng)內分泌癌基因工程動物模型。

作為優(yōu)選實施方式，將TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠飼養(yǎng)至24周齡即得前列腺神經(jīng)內分泌癌基因工程動物模型。

如上所述構建方法得到的前列腺神經(jīng)內分泌癌基因工程動物模型在篩選治療前列腺神經(jīng)內分泌癌藥物中的應用。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明提供的前列腺神經(jīng)內分泌癌基因工程動物模型可以用來研究前列腺神經(jīng)內分泌癌發(fā)病機理及篩選靶向藥物和療效評估。由于該模型在整體水平更自然地模擬臨床上疾病的發(fā)生發(fā)展過程，可有效地將復雜的生物學問題與藥物的作用結合起來考察藥物的治療效果。而且在我們建立的小鼠模型活體動物中進行研究,能兼顧類似于人體內的各種背景因素，研究結論具有很高的可靠性。因此，我們發(fā)現(xiàn)的本實驗小鼠模型是一種很好的用來篩選抗前列腺神經(jīng)內分泌癌藥物的有效工具，對尋找有效治療藥物的關鍵靶點以及神經(jīng)疾病的治療方法具有重要的意義。

附圖說明

圖1為TRAMP;PSGL-1^-/-雜交小鼠的建系流程圖。

圖2為TRAMP基因的鑒定結果。

圖3為PSGL-1基因的鑒定結果。

圖4為 TRAMP小鼠和TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠前列腺癌病理發(fā)展進程H&E染色結果。

圖5為 TRAMP小鼠和TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠前列腺癌病理發(fā)展進程免疫組化結果。

圖6為 24周齡TRAMP和TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠前列腺癌組織透射電鏡觀察結果。

具體實施方式

下面結合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作出進一步地詳細闡述，所述實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的試驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

TRAMP小鼠品系名稱為C57BL/6-Tg(TRAMP)8247Ng/J，PSGL-1基因敲除小鼠(PSGL-1 Knock out；PSGL-1^-/-)品系名稱為B6.Cg-Selplgtm1Fur/J，TRAMP小鼠和PSGL-1基因敲除小鼠均購自美國Jackson實驗室，C57小鼠購自廣東省動物中心。實驗動物均飼養(yǎng)于SPF級的環(huán)境中。

實施例1

一、TRAMP;PSGL-1^-/-雜交小鼠的建系（構建流程見圖1）：將雄性PSGL-1^-/-小鼠和雌性TRAMP小鼠合籠飼養(yǎng)，每籠以雄：雌=1：3的最佳比例配種，得F1代后分籠鑒定；將F1代中的TRAMP陽性; PSGL-1^+/-雌性小鼠與雄性PSGL-1^-/-小鼠雜交得F2代小鼠，F(xiàn)2代分籠鑒定；將F2代中的TRAMP陽性; PSGL-1^-/-雌性小鼠與PSGL-1^-/-雄性小鼠雜交擴群，獲得F3代小鼠，F(xiàn)3代分籠鑒定將獲得的TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠用于實驗。

其中TRAMP及PSGL-1^-/-小鼠的鑒定方法如下：

小鼠基因組DNA提?。航M織放入已標記好的EP管中；將組織浸沒于500ul裂解緩沖液A(25mM NaOH 0.5g；0.2mM Na₂EDTA.2H₂O0.037g加H₂O至500ml)中；金屬浴中100℃，1h；加入500ul裂解緩沖液B（40mM Tris Acid 6.3g加H₂O至500ml），旋渦混合，離心，5000rpm，1min，4℃保存；

TRAMP基因片段的擴增：TRAMP小鼠PCR反應引物序列如下所示。

Mouse β Casein正向引物:5′-GAT GTG CTC CAG GCT AAA GTT-3′；

Mouse β Casein 反向引物:5′-AGA AAC GGA ATG TTG TGG AGT-3′；

Probasin-1 正向引物:5′-CCG GTC GAC CGG AAG CTT CCA CAA GTG CAT TTA-3′；

T-antigen reverse primer:5′-CTC CTT TCA AGA CCT AGA AGG TCC A-3。

配置25ul PCR反應體系：四個引物各1ul，2×PCR Master Mix 12.5ul，DNA模板3ul，加水補足25ul。

TRAMP小鼠PCR反應條件：94℃ 1min 預變性；（94℃ 1min 變性，60℃ 2min 退火，72℃ 3min 延伸）30個循環(huán)；72℃ 5min 充分延伸；4℃冷卻擴增產(chǎn)物；取PCR反應產(chǎn)物10ul，加樣于1.2%瓊脂糖凝膠孔，于1×TAE緩沖液中電泳170V，30分鐘。在凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結果，如圖2：TRAMP基因陽性小鼠有500 bp(野生型)和600 bp (Tag片段)兩條帶，陰性小鼠只有500 bp一條帶。

PSGL-1基因片段的檢測：檢測引物如下所示。

Wild type 正向引物：5'-AGC TTC CTT GTG CTG CTG AC-3'；

Common：5'-TCA AAA TCG TCA TCC CCA AC-3'；

Mutant 1：5'-TCA AAA TCG TCA TCC CCA AC-3'；

Mutant 2：5-'CCT TCT ATC GCC TTC TTG ACG-3'。

配置25ul PCR反應體系：四個引物各1ul，2×PCR Master Mix 12.5ul，DNA模板3ul，加水補足25ul。

PCR反應條件為：94℃ 5min 預變性；（94℃ 30s 變性，65℃ 1min 退火，72℃ 1min 延伸）35個循環(huán)；72℃ 2min 充分延伸；4℃冷卻擴增產(chǎn)物；取PCR反應產(chǎn)物10ul，加樣于1.2%瓊脂糖凝膠孔，于1×TAE電泳緩沖液中電泳160V，25min。用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結果。如圖3：PSGL-1雜合子為500 bp和140 bp；PSGL-1全敲為500 bp；野生型小鼠為140 bp。

二、按照常規(guī)操作飼養(yǎng)TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠，定期檢測不同周齡小鼠的腫瘤組織病理學特征，結果發(fā)現(xiàn)TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠飼養(yǎng)至24周齡時，前列腺腫瘤出現(xiàn)顯著的神經(jīng)內分泌癌特性。

TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠飼養(yǎng)至24周齡時的腫瘤組織病理學特征檢測方法和結果如下：

一、H&E染色，取24周，55周TRAMP小鼠前列腺組織和24周TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠前列腺組織得到的石蠟切片，厚度為3～4μm。組織石蠟切片脫蠟、蘇木素染色4 分鐘，返藍，伊紅染色3 秒，37℃過夜、封片。正置顯微鏡下觀察各個組織結構變化并拍照，結果見圖4。

二、免疫組化染色

1、隨機選取24周，55周TRAMP小鼠前列腺組織和24周TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠，每組小鼠各3只。

2、用脫臼法處死小鼠，取沒有壞死區(qū)域的前列腺組織，將前列腺組織后葉制成石蠟組織切片。

① 固定：4%多聚甲醛固定液中固定24小時；

② 脫水：固定后的組織經(jīng)過蒸餾水及70%乙醇清洗后進入脫水步驟，脫水過程使用梯度濃度酒精：70%—80%—90%—95%—無水乙醇1—無水乙醇2，其中70%至90%乙醇中放置30分鐘，其余步驟均放置1小時。

③透明：二甲苯1放置1小時，二甲苯2放置1小時。

④浸蠟：準備兩個蠟缸分別盛放低熔點石蠟及高熔點石蠟，預先放入65℃烘箱熔化。透明后的組織分別放入低熔點石蠟1小時，高熔點石蠟1小時。

⑤包埋：預先在自動包埋機熔化高熔點蠟，并保持其熔化狀態(tài)，將浸蠟后的組織調整到切片需要的狀態(tài)放入包埋盒，倒入高熔點蠟并置于冰上或室溫等待其冷卻凝固。

⑥切片：先將展片池的水溫調節(jié)為42℃并在冰箱預冷蠟塊，修片至需要的截面后將切片厚度調節(jié)為4μm開始切片。得到到切片放入展片池以除去皺褶，展片完成后用預先涂有APES的載玻片撈取組織，放置于60℃烘箱4小時或者37℃烘箱過夜烤干后4℃保存。

3、每個標本隨機提取三張組織切片進行PSA、CgA、Syn和NSE特異性免疫染色：

①組織切片脫蠟及重新水化：將載玻片按次序放置于二甲苯1－二甲苯2－1/2二甲苯：乙醇－100％乙醇－95％乙醇－85％乙醇－75％乙醇中浸泡各10min。最后放置于雙蒸水中振蕩30s。

②將組織切片放入3％H₂O₂-甲醇溶液（提前預熱30min）中，37℃，30min。

③從3％H₂O₂-甲醇溶液中取出切片，PBS洗三次，每次5min。

④胃蛋白酶修復：將玻片上的溶液擦干，于組織上加上0.4%胃蛋白酶，37℃，30min。

⑤PBS洗三次，每次5min。將玻片上的溶液擦干，于組織上加上10％BSA，以蓋住組織為準，放置于封閉盒中，盒中放入適量雙蒸水，37℃，1h。

⑥用微量移液器將10％BSA直接吸掉，分別加上一抗PSA、CgA、Syn和NSE，置于4℃，過夜。

⑦將組織切片從封閉盒中拿出，PBS 洗三次，每次5min。擦干，于組織上加上二抗goat-anti-mouse IgG（中衫金橋），置于封閉盒中，37℃，40min。

⑧從封閉盒中拿出玻片，PBS洗三次，每次5min。

⑨DAB顯色，蘇木素復染：擦干，于組織上加上DAB Substrate Kit溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配），室溫靜置約5min，放置于水中停止反應。蘇木素染色40s，用流水洗去染色劑，小心不要沖掉組織。

⑩脫水、封片。結果見圖5。

三、透射電鏡檢測：小鼠用6%的水合氯醛麻醉，24周TRAMP小鼠和24周TRAMP;PSGL-1^-/-小鼠前列腺組織，每組小鼠各3只，然后用含2%戊二醛和1%蔗糖的0.1 摩爾濃度的二鉀砷酸鹽溶液固定3 小時。樣品再用0.1 摩爾濃度的二鉀砷酸鹽溶液清洗，然后用含有1%四氧化鋨的0.1 摩爾濃度的二鉀砷酸鹽溶液固定2 小時，所有的固定條件都是25℃和pH7.0。組織用梯度乙醇溶液脫水后，用包埋劑EPON 包埋，包埋劑EPON 需要在60℃的條件下聚合48小時。聚合完全后，使用鉆石刀頭超薄切片機將組織切成80納米的連續(xù)切片，用銅網(wǎng)收集切片。切片用醋酸雙氧鈾反透，再用1%的甲苯氨藍染色。最后樣品銅網(wǎng)用電子透射顯微鏡（Hitachi 600 TEM）拍照檢測，結果見圖6。

由上述檢測結果可以看出：敲除PSGL-1后的TRAMP小鼠(TRAMP;PSGL-1^-/-)飼養(yǎng)至24周齡時，前列腺腫瘤出現(xiàn)顯著的神經(jīng)內分泌癌特性，腫瘤組織病理學表現(xiàn)為由燕麥形的小細胞組成，細胞異型性明顯，細胞小，胞漿少，核仁不明顯，幾乎不表達分泌前列腺特異性抗原（PSA），但表達神經(jīng)內分泌細胞標志物，如嗜鉻粒蛋白A（CgA），突觸素（Syn）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE），且電鏡下可見胞漿內含有很多神經(jīng)內分泌顆粒，這些是臨床病理診斷NEPC的依據(jù)，因此，這樣的模型可以作為研究前列腺神經(jīng)內分泌癌發(fā)病機理及篩選靶向藥物和療效評估的動物模型。