本發(fā)明涉及鯽、鯉的四倍體繁育方法，具體涉及一種提高鯽、鯉雄性四倍體育成率的方法。
背景技術(shù)：
鯽魚：指二倍體鯽魚（包括青鯽、紅鯽、白鯽和黑鯽等）；鯉魚：俗稱鯉拐子、鯉子，包括鏡鯉、紅鯉、裸鯉等。其生長速度快，肉質(zhì)鮮美。而人工三倍體鯽（鯽魚天然三倍體是可育的）和鯉的不育特征，使其在生長速度、抗逆性、抗病性以及肉質(zhì)等方面表現(xiàn)出更為顯著的優(yōu)勢?，F(xiàn)有技術(shù)中，不育三倍體魚是通過四倍體魚與二倍體魚倍間雜交獲得，但要獲得98%以上的四倍體魚，那么就需要建立遺傳穩(wěn)定、純度極高的四倍體魚系。
在魚類遺傳育種中，通常利用冷/熱休克，或通過雜交等方法抑制受精卵的第一次有絲分裂或直接異源染色體加倍，制備出同源或異源四倍體魚，其中冷休克一般是與靜水壓處理一起，難以獲得較高純度的四倍體系，而熱休克的方式雖然易于操作，同樣，難以獲得純度高的四倍體系；而雜交的方法雖然純度高，但成功率低、周期長。此外，上述這些方法制備的四倍體魚，有些可育、有些又不可育，同時也可能存在基因混雜現(xiàn)象（異源四倍體），容易造成生物危險。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種方法穩(wěn)定的提高鯽、鯉雄性四倍體育成率的方法。
為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
一種提高鯽、鯉雄性四倍體育成率的方法，包括如下步驟：
（1）他莫昔芬抑制劑配備：取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入90%的乙醇溶液進(jìn)行溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量約為60～90mg/ml，待用；
（2）他莫昔芬注射液的配制：取上述母液直接加入到已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，其比例為1ml他莫昔芬母液加入到240～450ml的已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，制成注射液待用；催產(chǎn)劑溶液是將絨毛膜促性腺激素用0.9%生理鹽水稀釋配制，催產(chǎn)劑溶液中絨毛膜促性腺激素的劑量為5-10 IU/g；
（3）注射處理母本：在母本人工產(chǎn)卵前，按常規(guī)人工催產(chǎn)方法對母本進(jìn)行人工注射他莫昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量約為60～120μg/kg，即每kg母本注射他莫昔芬注射液60-120μg；
（4）冷休克+靜水壓處理：在一次卵裂時，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把經(jīng)過注射處理的母本與不經(jīng)過任何處理的父本雜交獲得的受精卵放入溫度為-1～1.0℃的冷水中，靜水壓壓力為250～340Kg/cm2，持續(xù)時間為3～5min；
（5）雌激素抑制劑溶液的配制：將氯米芬和睪酮一起溶于80%～90%的乙醇中，再加蒸餾水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為80～200mg/l，睪酮的濃度為20～80mg/l；
（6）四倍體純系的獲得：取步驟（4）處理后的受精卵放入按步驟（5）所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸泡10～30s，然后取出放于孵化器中正常孵化；從而獲得100%鯽、鯉雄性四倍體純系。
本發(fā)明的優(yōu)點：1、本發(fā)明中在母本中注射他莫昔芬，起到抑制DNA復(fù)制和促雄性的雙重作用的同時，推延了受精卵第一次卵裂的時間（3-5min）、提高了所有受精卵第一次卵裂的同步程度（可達(dá)99%），為操作下一步提供時間保障和奠定了染色體加倍的基礎(chǔ)；2、在受精卵一次卵裂采用冷休克與較低的靜水壓（低于常用的350kg/cm2），以及較短的處理時間（低于5min），不僅有效減少對受精卵的不良影響，提高受精卵的成活率，而且進(jìn)一步強(qiáng)化四倍體的轉(zhuǎn)化率；3、雌激素抑制劑溶液浸泡，再一次強(qiáng)化與保證雄性轉(zhuǎn)化率。因而通過此方法，可獲得100%的鯽、鯉雄性四倍體純系，有效提高了四倍體的育成率及出苗率，相比雜交而言，能獲得純度更高、后代更為穩(wěn)定的雄性四倍體魚系，為不育三倍體鯽、鯉魚的育成奠定了堅實的基礎(chǔ)。
具體實施方式
現(xiàn)結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
實施例一
提高鯽魚雄性四倍體育成率的方法，包括如下步驟：
（1）他莫昔芬抑制劑配備：取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入90%的乙醇溶液進(jìn)行溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量約為90mg/ml，待用；
（2）他莫昔芬注射液的配制：取上述母液直接加入到已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，其比例為1ml他莫昔芬母液加入到240ml的已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，制成注射液，注射液中他莫昔芬的濃度約為0.375mg/ml，待用；
（3）注射處理母本：在母本人工產(chǎn)卵前，按常規(guī)人工催產(chǎn)方法對母本進(jìn)行人工注射他莫昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量約為80μg/kg；
（4）冷休克+靜水壓處理：在一次卵裂時，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把經(jīng)過注射處理的母本與不經(jīng)過任何處理的父本雜交獲得的受精卵放入溫度為0℃的冷水中，靜水壓壓力為310Kg/cm2，持續(xù)時間為5min；
（5）雌激素抑制劑溶液的配制：將氯米芬和睪酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸餾水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為160mg/l，睪酮的濃度為60mg/l；
（6）四倍體純系的獲得：取步驟（4）處理后的受精卵放入按步驟（5）所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸泡30s，然后取出放于孵化器中正常孵化；從而獲得100%鯽魚雄性四倍體純系。
實施例二
提高鯉魚雄性四倍體育成率的方法，包括如下步驟：
（1）他莫昔芬抑制劑配備：取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入90%的乙醇溶液進(jìn)行溶解，制成母液，其中他莫昔芬含量約為90mg/ml，待用；
（2）他莫昔芬注射液的配制：取上述母液直接加入到已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，其比例為1ml他莫昔芬母液加入到450ml的已配制好的催產(chǎn)劑溶液中，制成注射液，注射液中他莫昔芬的濃度為0.2mg/ml，待用；
（3）注射處理母本：在母本人工產(chǎn)卵前，按常規(guī)人工催產(chǎn)方法對母本進(jìn)行人工注射他莫昔芬注射液，其中他莫昔芬注射液的用量約為120μg/kg；
（4）冷休克+靜水壓處理：在一次卵裂時，采用冷休克與靜水壓相結(jié)合的方法，把經(jīng)過注射處理的母本與不經(jīng)過任何處理的父本雜交獲得的受精卵放入溫度為-1℃的冷水中，靜水壓壓力為250Kg/cm2，持續(xù)時間為3min；
（5）雌激素抑制劑溶液的配制：將氯米芬和睪酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸餾水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為200mg/l，睪酮的濃度為80mg/l；
（6）四倍體純系的獲得：取步驟（4）處理后的受精卵放入按步驟（5）所制備的雌激素抑制劑溶液中，常溫浸泡10s，然后取出放于孵化器中正常孵化；從而獲得鯉魚雄性四倍體純系。
上述兩個實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選方案之二，并不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，任意與本發(fā)明等同或相似的技術(shù)手段視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。以下附上本發(fā)明部分處理方式及結(jié)果統(tǒng)計。
附：鯽、鯉雄性四倍體育成結(jié)果統(tǒng)計
注：上述結(jié)果是在注射液中他莫昔芬的濃度為0.2mg/ml的條件下常溫浸泡10S，靜水壓處理3分鐘所取得的結(jié)果。