本發(fā)明涉及植物培養(yǎng)繁殖技術領域，具體涉及一種蕙蘭無毒苗培養(yǎng)繁殖方法。

背景技術：

蕙蘭是蘭科蕙蘭屬的地生草本植物，假鱗莖不明顯，集生成叢，呈橢圓形。葉帶形，直立性強，葉脈透亮，邊緣常有粗鋸齒。花常為淺黃綠色，唇瓣有紫紅色斑，一莖多花。蕙蘭是中國栽培最久和最普及的蘭花之一，屬于珍稀物種，為國家二級重點保護野生物種，是比較耐寒的蘭花品種之一。

由于蕙蘭種子非常微小，幾乎無胚乳，在自然條件下種子萌發(fā)率極低，因此在生產(chǎn)實踐中多采用分株方式進行繁殖，無性繁殖引發(fā)的病毒傳播嚴重制約了蘭花產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，病毒可造成植株葉斑、壞死以及花朵變色、畸形等癥狀，嚴重影響其品質(zhì)，目前尚無藥物能有效防治病毒的危害與傳播，因此繁殖蕙蘭無毒苗是產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的必經(jīng)之路。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種蕙蘭無毒苗培養(yǎng)繁殖方法，從而培養(yǎng)蕙蘭無毒苗，實現(xiàn)蕙蘭的無病毒栽培。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：一種蕙蘭無毒苗培養(yǎng)繁殖方法，包括以下步驟：

(1)植株熱處理：將無病蟲害長勢良好的蕙蘭放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)期間，培養(yǎng)箱內(nèi)濕度為80～90％，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度開始時為30℃，每隔一天上升1℃，直至38℃，培養(yǎng)時間為22～25d，光照時間為16h/d，光照強度為3000～5000lx；

(2)材料選?。簩⑸鲜鰺崽幚砗蟮霓ヌm從培養(yǎng)箱中取出，切取蕙蘭的莖尖；

(3)材料消毒：將上述切取的莖尖用清水沖洗干凈，沖洗后剝?nèi)ネ鈱尤~片，在超凈工作臺上用體積分數(shù)為70％的酒精浸泡20～30s，然后用質(zhì)量分數(shù)為0.2％的氯化汞溶液分2～3次共消毒5～6min，每次用氯化汞溶液消毒后用無菌水漂洗5次，并用消毒濾紙吸干表面水分；

(4)原球莖誘導培養(yǎng)：將上述消毒后的莖尖在解剖鏡下剝離成長度為0.3～0.5mm的莖段，然后接種到誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述誘導培養(yǎng)基為：B5培養(yǎng)基+0.3～0.7mg/L 6-BA+0.1～0.3mg/L IBA+0.2～0.3mg/L VC+0.05～0.15mg/L GA3，培養(yǎng)時間為22～25d，培養(yǎng)溫度24～26℃，光照時間為12h/d，光照強度為1500～2000lx；培養(yǎng)時間結束后，再將培養(yǎng)材料整體移入新的誘導培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為15～20d，培養(yǎng)溫度24～26℃，光照時間為12h/d，光照強度為1500～2000lx；

(5)增殖繼代培養(yǎng)：將培養(yǎng)后的原球莖在無菌工作臺上進行分割，然后在接入到增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，所述增殖培養(yǎng)基為：B5培養(yǎng)基+0.8～1.5mg/L6-BA+0.1～0.3mg/L NAA+8～12％椰汁，培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度24～26℃，光照時間為12h/d，光照強度為1500～2000lx；

(6)壯苗培養(yǎng)：增殖繼代培養(yǎng)后，選擇高2cm以上、基部有明顯突起的小苗轉入壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述壯苗培養(yǎng)基為：B5培養(yǎng)基+2～4mg/L NAA，培養(yǎng)時間為15～20d，培養(yǎng)溫度24～26℃，光照時間為13h/d，光照強度為1800～21000lx；培養(yǎng)時間結束后，再向壯苗培養(yǎng)基中加入0.3％活性炭，培養(yǎng)溫度27～29℃，光照時間為15h/d，光照強度為2500～3000lx；

(7)移栽：當試管苗生長至4～5cm高，根2～4條，葉1～2片時，將試管苗放在自然光下煉苗5～7天，打開瓶蓋煉苗1～2天；然后取出培養(yǎng)苗，用清水洗凈附著在根部的培養(yǎng)基，清洗時注意不要損害根部，然后移栽至水苔和腐殖土質(zhì)量比為1:2的混合基質(zhì)中，保持濕度和通風，空氣濕度為75～85％，溫度為20～25℃。

如上所述的一種蕙蘭無毒苗培養(yǎng)繁殖方法，進一步說明為，所述材料消毒步驟中，每次用質(zhì)量分數(shù)為0.2％的氯化汞溶液消毒時，向氯化汞溶液中加入一滴吐溫-20。

如上所述的一種蕙蘭無毒苗培養(yǎng)繁殖方法，進一步說明為，所述誘導培養(yǎng)基為：B5培養(yǎng)基+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+0.25mg/L VC+0.1mg/L GA3。

如上所述的一種蕙蘭無毒苗培養(yǎng)繁殖方法，進一步說明為，所述增殖培養(yǎng)基為：B5培養(yǎng)基+1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+10％椰汁。

本發(fā)明的有益效果是：采用本方法能使培養(yǎng)后的蕙蘭苗株發(fā)病率低，成苗率高，苗株品質(zhì)好，栽培后適應性強，苗株長勢良好，通過生物技術手段在短時間內(nèi)，滿足了商業(yè)化生產(chǎn)的需求，為企業(yè)規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)蕙蘭無毒苗提供了技術支持。

具體實施方式

下面對本發(fā)明具體實施方式做進一步的闡述。

本發(fā)明提供了一種蕙蘭無毒苗培養(yǎng)繁殖方法，從而培養(yǎng)蕙蘭無毒苗，實現(xiàn)蕙蘭的無病毒栽培，該方法包括以下步驟：

(1)植株熱處理：將無病蟲害長勢良好的蕙蘭放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)期間，培養(yǎng)箱內(nèi)濕度為80～90％，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度開始時為30℃，每隔一天上升1℃，直至38℃，培養(yǎng)時間為22～25d，光照時間為16h/d，光照強度為3000～5000lx；部分病毒在高溫條件下會失去活性，持續(xù)一定時間后，病毒含量不斷下降，經(jīng)過熱處理能在一定程度上脫掉部分病毒，蕙蘭熱處理的溫度上限為38℃，超過38℃，會使蕙蘭失去活性，甚至枯死，熱處理溫度采用階梯上升，能使蕙蘭植物逐漸適應溫度的變化。

(2)材料選?。簩⑸鲜鰺崽幚砗蟮霓ヌm從培養(yǎng)箱中取出，切取蕙蘭的莖尖；植物病毒在植株體內(nèi)主要沿植物輸導組織蔓延發(fā)展，植物頂端分生組織沒有導管、篩管的分化，同時植物頂端細胞生活力強，能不斷分裂擺脫病毒的侵入，所以植物頂端分生細胞中一般不含病毒，切取蕙蘭的莖尖進行組培，從而可以獲得蕙蘭無毒苗。

(3)材料消毒：將上述切取的莖尖用清水沖洗干凈，沖洗后剝?nèi)ネ鈱尤~片，在超凈工作臺上用體積分數(shù)為70％的酒精浸泡20～30s，然后用質(zhì)量分數(shù)為0.2％的氯化汞溶液分2～3次共消毒5～6min，每次用氯化汞溶液消毒后用無菌水漂洗5次，并用消毒濾紙吸干表面水分；一般消毒用的0.1％氯化汞溶液滅菌效果不佳，而濃度較高的氯化汞溶液又易使莖尖失去活性，抑制誘導，而本培育方法采用質(zhì)量分數(shù)為0.2％的氯化汞溶液能較好起到滅菌作用而又對其活性影響較小，并且采用分2～3次操作，能更好的保護莖尖活性；

表1為采用上述消毒方法對蕙蘭莖尖進行處理后，放置于普通誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，對培養(yǎng)后蕙蘭莖尖誘導率的試驗結果：

由表1中可以看出，采用質(zhì)量分數(shù)為0.2％的氯化汞溶液能較好起到滅菌作用而又對其活性影響較小，并且采用分2～3次操作，能更好的保護蕙蘭莖尖活性，大大增加蕙蘭莖尖的誘導率。作為優(yōu)選，每次用質(zhì)量分數(shù)為0.2％的氯化汞溶液消毒時，向氯化汞溶液中加入一滴吐溫-20。

(4)原球莖誘導培養(yǎng)：將上述消毒后的莖尖在解剖鏡下剝離成長度為0.3～0.5mm的莖段，接種成活率與莖段大小成正比關系，莖段小于0.2mm時，成活率不超過25％，所以本發(fā)明采用0.3～0.5mm的莖段，然后接種到誘導培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，所述誘導培養(yǎng)基為：B5培養(yǎng)基+0.3～0.7mg/L 6-BA+0.1～0.3mg/L IBA+0.2～0.3mg/L VC+0.05～0.15mg/L GA3，通過加入VC和GA3，能有效遏制培養(yǎng)材料的褐化，在誘導培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間為22～25d，培養(yǎng)溫度24～26℃，光照時間為12h/d，光照強度為1500～2000lx，經(jīng)過22～25天的培養(yǎng)后莖尖頂端周圍開始出現(xiàn)白色晶瑩的小突起，并逐漸長大形成1至數(shù)個原球莖，這時再將培養(yǎng)材料整體移入新的誘導培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為15～20d，培養(yǎng)溫度24～26℃，光照時間為12h/d，光照強度為1500～2000lx，經(jīng)過15～20天的繼續(xù)培養(yǎng)后，原球莖體積不斷增大，逐漸轉綠，在表面長出毛狀假根，此時可進行增殖繼代培養(yǎng)；

表2為誘導培養(yǎng)基成分及用量

作為優(yōu)選，所述誘導培養(yǎng)基為：B5培養(yǎng)基+0.5mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+0.25mg/L VC+0.1mg/L GA3，即為表2中誘導培養(yǎng)基1的成分及用量；

(5)增殖繼代培養(yǎng)：將培養(yǎng)后的原球莖在無菌工作臺上進行分割，然后在接入到增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，所述增殖培養(yǎng)基為：B5培養(yǎng)基+0.8～1.5mg/L6-BA+0.1～0.3mg/L NAA+8～12％椰汁，培養(yǎng)條件：培養(yǎng)溫度24～26℃，光照時間為12h/d，光照強度為1500～2000lx；通過在增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，加快了原球莖的吸收，使原球莖體積和數(shù)量得到快速繁殖；

表3為增殖培養(yǎng)基成分及用量

作為優(yōu)選，所述增殖培養(yǎng)基為：B5培養(yǎng)基+1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+10％椰汁，即為表3中增殖培養(yǎng)基1的成分及用量；

(6)壯苗培養(yǎng)：增殖繼代培養(yǎng)后，選擇高2cm以上、基部有明顯突起的小苗轉入壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述壯苗培養(yǎng)基為：B5培養(yǎng)基+2～4mg/L NAA，培養(yǎng)時間為15～20d，培養(yǎng)溫度24～26℃，光照時間為13h/d，光照強度為1800～21000lx；培養(yǎng)時間結束后，再向壯苗培養(yǎng)基中加入0.3％活性炭，培養(yǎng)溫度27～29℃，光照時間為15h/d，光照強度為2500～3000lx；加入活性炭能模擬土壤黑暗環(huán)境有利于根系的生長，同時增加培養(yǎng)溫度和光照強度，試管苗邊分化邊生根。

(7)移栽：當試管苗生長至4～5cm高，根2～4條，葉1～2片時，將試管苗放在自然光下煉苗5～7天，打開瓶蓋煉苗1～2天；然后取出培養(yǎng)苗，用清水洗凈附著在根部的培養(yǎng)基，清洗時注意不要損害根部，然后移栽至水苔和腐殖土質(zhì)量比為1:2的混合基質(zhì)中，保持濕度和通風，空氣濕度為75～85％，溫度為20～25℃，移栽成活率達90％以上。采用本方法能使培養(yǎng)后的蕙蘭苗株發(fā)病率低，成苗率高，苗株品質(zhì)好，栽培后適應性強，苗株長勢良好，通過生物技術手段在短時間內(nèi)，滿足了商業(yè)化生產(chǎn)的需求，為企業(yè)規(guī)?；a(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)蕙蘭無毒苗提供了技術支持。

本發(fā)明并不限于上述實例，在本發(fā)明的權利要求書所限定的范圍內(nèi)，本領域技術人員不經(jīng)創(chuàng)造性勞動即可做出的各種變形或修改均受本專利的保護。