本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種能夠顯著縮短小麥耐鹽育種周期、大大加快小麥耐鹽育種速度的利用花培單倍體篩選優(yōu)良耐鹽株系的小麥耐鹽育種方法。
背景技術(shù)：
土壤鹽漬化是一個(gè)世界性的資源問題和生態(tài)問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球有各種鹽漬土約9.5億公頃，占全球陸地面積的10%，廣泛分布于100多個(gè)國(guó)家和地區(qū)。而且，全球灌溉土地面積中，約50%的土地在不同程度地遭受著土壤鹽堿化的危害，由于土壤的次生鹽漬化，全球鹽漬化面積還在迅速增加。土壤鹽漬化的發(fā)展，帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和生態(tài)危害。來自世界糧農(nóng)組織和教科文組織的統(tǒng)計(jì)表明，全世界灌溉土地約有一半不同程度遭受鹽漬化危害，每年約有100萬公頃土地因土壤的次生鹽漬化而廢棄。我國(guó)鹽堿化土壤主要分布在華北、西北、東北、黃泛區(qū)和濱海地帶，總面積達(dá)4萬公頃，約占總耕地面積的10%，是世界上鹽堿土較多的國(guó)家之一，而且鹽堿土面積還將不斷擴(kuò)大，土地鹽堿化形勢(shì)十分嚴(yán)峻。為了合理開發(fā)和利用鹽堿土地資源，人們進(jìn)行了不懈的努力，采取了多種措施。在鹽堿地利用的眾多方式中，篩選利用耐鹽植物新品種是改良鹽堿地最經(jīng)濟(jì)有效的方法之一。
小麥?zhǔn)鞘澜缟戏植紖^(qū)域最廣，總產(chǎn)量最高，貿(mào)易額最大的糧食作物，同時(shí)小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要的糧食作物之一，產(chǎn)量?jī)H次于水稻，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占重要地位，也是我國(guó)鹽堿地地區(qū)主要栽培作物。因此，培育耐鹽小麥新品種，成為小麥育種工作的重要任務(wù)之一。
目前小麥耐鹽育種方法主要有選擇育種、雜交育種、誘變育種和基因工程的方法，其中雜交育種仍是培育小麥耐鹽品種較為普遍的方法。我國(guó)利用雜交育種已培育出的耐鹽小麥品種有德選1號(hào)、德抗961、魯麥10號(hào)、輪抗6號(hào)、輪抗7號(hào)、新春16、新春29和新冬34等。印度和巴基斯坦采用雜交育種育成的品種有KRL1-4、KRL19、LU26S和SARC-1等。但是雜交育種具有篩選工作量大、育種周期長(zhǎng)、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)，誘變育種具有誘變效率低、工作量大的缺點(diǎn)，已越來越不能滿足育種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，而基因工程育種依賴于小麥耐鹽基因的發(fā)掘，未能得到普遍性的應(yīng)用。
與傳統(tǒng)的育種方法相比，單倍體育種可以縮短育種時(shí)間提高選擇效率。從20世紀(jì)70年代以來，單倍體育種技術(shù)已廣泛用于小麥育種，至今已培育出許多優(yōu)良品種，是小麥育種的有效途徑之一，而且單倍體誘導(dǎo)可以與分子標(biāo)記和遺傳操作技術(shù)相結(jié)合用于作物的遺傳改良研究。目前，小麥單倍體育種主要是通過花藥培養(yǎng)途徑來實(shí)現(xiàn)的。
小麥屬中度耐鹽植物，當(dāng)土壤鹽分超過一定限度時(shí)，小麥生長(zhǎng)會(huì)受到抑制，輕則生長(zhǎng)發(fā)育受到影響，重則造成植株死亡。研究發(fā)現(xiàn)，在小麥在不同生育時(shí)期都具有耐鹽堿性，小麥組織細(xì)胞分化過程已顯著表現(xiàn)出耐感的差異。國(guó)內(nèi)外一些科研單位已采用鹽處理小麥組織的方法來進(jìn)行小麥耐鹽變異體的篩選，也有將小麥花藥培養(yǎng)篩選耐鹽變異體培育小麥耐鹽品種的報(bào)道，但是在小麥單倍體途徑的拓展利用上有所缺乏。普通小麥?zhǔn)?倍體，體細(xì)胞中含有6個(gè)染色體組，42條染色體，基因組龐大，小麥耐鹽機(jī)理非常復(fù)雜，是大量基因協(xié)調(diào)表達(dá)的結(jié)果，其中鹽誘導(dǎo)表達(dá)基因的作用非常重要，小麥對(duì)鹽分的抗性受數(shù)量性狀控制，基因的補(bǔ)償效應(yīng)導(dǎo)致常規(guī)的小麥組織對(duì)鹽害的抵抗消弱了小麥組織鹽處理的敏感性，導(dǎo)致常規(guī)的耐鹽篩選敏感性不強(qiáng)。
通?；ㄋ幣囵B(yǎng)育種階段會(huì)產(chǎn)生大量的小麥單倍體植株，常規(guī)的花藥培養(yǎng)途徑中誘導(dǎo)培養(yǎng)階段和分化培養(yǎng)階段應(yīng)盡量減少單倍體植株的比例，通過自然加倍或者人工誘導(dǎo)加倍來盡量實(shí)現(xiàn)單倍體植株恢復(fù)倍性。然而，單倍體植株由于其染色體組和染色體數(shù)量減半，單倍體植株對(duì)鹽處理的敏感性大大提高，成為我們的重點(diǎn)研究方向。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對(duì)常規(guī)小麥耐鹽育種的缺陷，提供了一種顯著縮短小麥耐鹽育種周期、大大加快小麥耐鹽育種速度的利用花培單倍體篩選優(yōu)良耐鹽株系的小麥耐鹽育種方法。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案解決的：
一種利用花培單倍體篩選優(yōu)良耐鹽株系的小麥耐鹽育種方法，其特征在于：該育種方法的步驟如下：
（1）篩選小麥耐鹽資源和育種主干親本：采用鹽池鑒定法對(duì)小麥資源庫各材料進(jìn)行耐鹽性鑒定，選取相對(duì)鹽害指數(shù)低于8%的小麥品種或家系作為小麥耐鹽資源；選擇小麥耐鹽性不足但農(nóng)藝性狀優(yōu)良的地方主栽品種作為育種主干親本；正季種植小麥耐鹽資源和育種主干親本；
（2）確定小麥耐鹽篩選壓：選取步驟（1）種植的小麥耐鹽資源和育種主干親本的花藥分別進(jìn)行花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得花藥愈傷，在分化培養(yǎng)基中加入梯度濃度的NaCl溶液，然后將小麥耐鹽資源和育種主干親本的花藥愈傷轉(zhuǎn)移到該分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)，篩選小麥耐鹽資源和育種主干親本花藥愈傷分化率均為0.75%～1.5%的分化培養(yǎng)基添加的NaCl濃度，將二者的平均值濃度的NaCl溶液確定為小麥耐鹽篩選壓；
（3）將小麥耐鹽資源和育種主干親本雜交，獲得F1雜交種：將步驟（1）正季種植的小麥耐鹽資源和育種主干親本雜交，獲得F1雜交種；
（4）F1雜交種花培獲得單倍體植株：F1雜交種正季播種種植，選取健壯主穗花藥進(jìn)行花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得花藥愈傷組織，并挑選直徑0.5～0.8cm的花藥愈傷接種于添加了小麥耐鹽篩選壓的分化培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)，獲得單倍體植株；
（5）單倍體植株繼代壯根：待單倍體植株苗長(zhǎng)至3～5cm之后轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基進(jìn)行繼代壯根，15d后可觀察到單倍體植株生長(zhǎng)出旺盛的白色根系，打開封口膜煉苗；
（6）單倍體植株浸根加倍：將壯根并煉苗后的小麥單倍體植株取出，洗凈根部培養(yǎng)基殘留，剪去部分根須，留根長(zhǎng)度2～3cm，用添加了2%二甲基亞砜+0.5‰秋水仙堿溶液浸泡根系，25℃條件下處理24h，處理結(jié)束后再用清水將藥液沖洗干凈，然后將植株移栽到溫室中，遮陰5～7d后常規(guī)栽培管理；
（7）花培苗單株收種獲得花培家系，進(jìn)一步農(nóng)藝性狀、耐鹽性篩選獲得小麥耐鹽新品系：溫室種植小麥花培苗，單株收種獲得小麥耐鹽新家系，不同花培家系進(jìn)一步大田播種，農(nóng)藝性狀、耐鹽性篩選獲得農(nóng)藝形狀良好且耐鹽性得到改良的小麥新品系。
所述步驟（1）中對(duì)小麥資源庫各材料進(jìn)行耐鹽性鑒定的鹽池鑒定法的具體步驟為：將鹽池中鹽分濃度控制在0.42%～0.48%，設(shè)置淡水池作為對(duì)照，鑒定材料按株系種植，每個(gè)株系種植2行，每行20株，株距3cm，行距20cm，待小麥生長(zhǎng)至起身-拔節(jié)期和孕穗期，調(diào)查記載單株鹽害癥狀和鹽害級(jí)別，計(jì)算相對(duì)鹽害指數(shù)。
所述單株鹽害級(jí)別的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：生長(zhǎng)發(fā)育正常、不表現(xiàn)任何鹽害癥狀為0級(jí)，生長(zhǎng)發(fā)育基本正常、葉尖略有鹽害表現(xiàn)為1級(jí)，生長(zhǎng)發(fā)育接近正常、基部葉片干枯、中上部葉片1/3表現(xiàn)鹽害為2級(jí)，生長(zhǎng)發(fā)育受抑制、基部葉片及中部葉片干枯、上部葉片1/2表現(xiàn)鹽害為3級(jí)，生長(zhǎng)發(fā)育嚴(yán)重受抑制、只上部頂端有綠葉為4級(jí)，植株死亡或臨近死亡為5級(jí)；所述相對(duì)鹽害指數(shù)的計(jì)算方法為：相對(duì)鹽害指數(shù)=分級(jí)記載的株數(shù)與該級(jí)別數(shù)值乘積的總和/（調(diào)查總株數(shù)×5）×100%。
所述步驟（2）和步驟（4）中小麥花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)的過程如下：
（a）花藥取材與低溫預(yù)處理：花培材料常規(guī)大田種植，4月中下旬小麥孕穗期時(shí)于每日9點(diǎn)～11點(diǎn)取材小孢子發(fā)育處于單核晚期的主莖穗的中部小穗，剝掉旗葉外其他葉子，75%酒精擦拭表面后插入盛少許純凈水的燒杯中，用黑色塑料袋套住杯子，放入4℃冰箱低溫預(yù)處理3～5d；
（b）花藥接種：預(yù)處理后取出材料，用75%酒精消毒幼穗表面，然后放進(jìn)超凈工作臺(tái)，從旗葉中撥出麥穗放入滅菌過的消毒盒中，倒入1‰升汞溶液至幼穗浸沒，期間不時(shí)晃動(dòng)瓶子，保證幼穗與消毒液浸泡均勻，消毒10min后，將幼穗用無菌水沖洗3～4次，用消毒后的鑷子夾取幼穗中部小穗兩邊的花藥，最后用消毒過的剪刀剪開花藥上部，抖藥法接種花藥于小麥花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；
（c）誘導(dǎo)培養(yǎng)：將小麥花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于24～26℃的黑暗環(huán)境中誘導(dǎo)愈傷組織，30～40天后在花藥的邊緣出現(xiàn)白-淡黃色的無定型細(xì)胞團(tuán)，即小麥花藥愈傷組織。
所述步驟（a）中的取材小孢子發(fā)育處于單核晚期的麥穗的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)為：幼穗頂部位于旗葉的葉耳與旗葉葉耳1/3～2/3處的小麥植株，用剪刀沿著莖部剪斷所獲得的部分。
所述步驟（b）和（c）中的小麥花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良癸培養(yǎng)基，其配方為：NH4NO3200mg/L，KNO3 1400mg/L，KH2PO4 500mg/L，CaCl2 150mg/L，MgSO4?7H2O 100mg/L，Na2-EDTA 37.25mg/L，F(xiàn)eSO4?7H2O 27.85mg/L，MnSO4?4H2O 4.0mg/L，ZnSO4?7H2O 2.0mg/L，生物素 2.0mg/L，H3BO3 1.5mg/L，KI 1.0mg/L，CaSO4?5H2O 0.1mg/L，CoCl2?6H2O 0.2mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，維生素B1 1.0mg/L，維生素B6 0.5mg/L，煙酸 0.5mg/L，肌醇 100mg/L，KT 1.5mg/L，IAA 0.5mg/L，絲氨酸 0.25mg/L，谷氨酰胺 5.0mg/L，水解酪蛋白 0.4g/L，植物血凝素 3.5mg/L，AgNO3 5.0mg/L，幼穗提取液 25mg/L，瓊脂 7g/L，麥芽糖 90g/L，pH值為5.8。
所述幼穗提取液的獲取方法為：將小麥幼穗洗凈后稱取30g，切成碎片，加入100ml蒸餾水，煮沸20min，用4～6層紗布過濾靜置，待沉淀后取上清液。
所述步驟（2）和（4）中的分化培養(yǎng)基的配方為：C17+蔗糖30g/L+瓊脂5.5g/L+AgNO31.5mg/L+山梨醇80mol/L+NAA 0.15mg/L+KT 1.5mg/L+ABA 0.1mg/L，pH值為5.8；所述的分化培養(yǎng)的條件為：將分化培養(yǎng)基置于溫度為25～27℃，光照強(qiáng)度為1500～2000Lx，光周期為光14h/暗10h的培養(yǎng)室條件下進(jìn)行分化培養(yǎng)。
所述步驟（5）中的生根培養(yǎng)基的配方為：1/2MS基本培養(yǎng)基+多效唑3.0g/L，pH值為5.8；所述的生根培養(yǎng)的條件為：將生根培養(yǎng)基置于溫度為27～29℃，光照強(qiáng)度為2500～3000Lx，光周期為光14h/暗10h的培養(yǎng)室條件下生根壯苗。
所述步驟（5）中的煉苗方法為：將生根培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶封口膜打開，在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行開瓶練苗4～6天，然后轉(zhuǎn)移到光照強(qiáng)度為3000～6000Lx，溫度為10～30℃，濕度為70～85%，利用自然光煉苗7～10天。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)有如下優(yōu)點(diǎn)：
本發(fā)明的育種方法與常規(guī)育種方法相比，通過調(diào)控小麥花藥培養(yǎng)過程，大大提高了小麥單倍體植株的比例，利用小麥單倍體植株對(duì)鹽處理敏感度高的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行耐鹽性篩選，極大地提高了篩選效率，進(jìn)而利用單倍體加倍手段獲得倍性恢復(fù)的正常六倍體小麥植株，從而大大加快了小麥耐鹽育種速度，顯著縮短耐鹽育種周期，3年即可實(shí)現(xiàn)耐鹽育種，具有重要的產(chǎn)業(yè)價(jià)值。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
一種利用花培單倍體篩選優(yōu)良耐鹽株系的小麥耐鹽育種方法，該育種方法的步驟如下：
（1）篩選小麥耐鹽資源和育種主干親本：采用鹽池鑒定法對(duì)小麥資源庫各材料進(jìn)行耐鹽性鑒定，首先將鹽池中鹽分濃度控制在0.42%～0.48%，設(shè)置淡水池作為對(duì)照，鑒定材料按株系種植，每個(gè)株系種植2行，每行20株，株距3cm，行距20cm，待小麥生長(zhǎng)至起身-拔節(jié)期和孕穗期，調(diào)查記載單株鹽害癥狀，根據(jù)單株鹽害級(jí)別分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)區(qū)分鹽害級(jí)別；
單株鹽害級(jí)別分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：生長(zhǎng)發(fā)育正常、不表現(xiàn)任何鹽害癥狀為0級(jí)，生長(zhǎng)發(fā)育基本正常、葉尖略有鹽害表現(xiàn)為1級(jí)，生長(zhǎng)發(fā)育接近正常、基部葉片干枯、中上部葉片1/3表現(xiàn)鹽害為2級(jí)，生長(zhǎng)發(fā)育受抑制、基部葉片及中部葉片干枯、上部葉片1/2表現(xiàn)鹽害為3級(jí)，生長(zhǎng)發(fā)育嚴(yán)重受抑制、只上部頂端有綠葉為4級(jí)，植株死亡或臨近死亡為5級(jí)；
根據(jù)相對(duì)鹽害指數(shù)計(jì)算方法：相對(duì)鹽害指數(shù)=分級(jí)記載的株數(shù)與該級(jí)別數(shù)值乘積的總和/（調(diào)查總株數(shù)×5）×100%，進(jìn)一步計(jì)算相對(duì)鹽害指數(shù)；
選取相對(duì)鹽害指數(shù)低于8%的小麥品種或家系作為小麥耐鹽資源；選擇小麥耐鹽性不足但農(nóng)藝性狀優(yōu)良的地方主栽品種作為育種主干親本；正季種植小麥耐鹽資源和育種主干親本；
（2）確定小麥耐鹽篩選壓：選取步驟（1）種植的小麥耐鹽資源和育種主干親本的花藥分別進(jìn)行花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)的過程如下：
（a）花藥取材與低溫預(yù)處理：花培材料常規(guī)大田種植，4月中下旬小麥孕穗期時(shí)于每日9點(diǎn)～11點(diǎn)取材小孢子發(fā)育處于單核晚期的主莖穗的中部小穗，小孢子發(fā)育處于單核晚期的形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)為：幼穗頂部位于旗葉的葉耳與旗葉葉耳1/3～2/3處的小麥植株，用剪刀沿著莖部剪斷所獲得的部分；剝掉旗葉外其他葉子，75%酒精擦拭表面后插入盛少許純凈水的燒杯中，用黑色塑料袋套住杯子，放入4℃冰箱低溫預(yù)處理3～5d；
（b）花藥接種：預(yù)處理后取出材料，用75%酒精消毒幼穗表面，然后放進(jìn)超凈工作臺(tái)，從旗葉中撥出麥穗放入滅菌過的消毒盒中，倒入1‰升汞溶液至幼穗浸沒，期間不時(shí)晃動(dòng)瓶子，保證幼穗與消毒液浸泡均勻，消毒10min后，將幼穗用無菌水沖洗3～4次，用消毒后的鑷子夾取幼穗中部小穗兩邊的花藥，最后用消毒過的剪刀剪開花藥上部，抖藥法接種花藥于小麥花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，小麥花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良癸培養(yǎng)基，其配方為：NH4NO3 200mg/L，KNO3 1400mg/L，KH2PO4 500mg/L，CaCl2 150mg/L，MgSO4?7H2O 100mg/L，Na2-EDTA 37.25mg/L，F(xiàn)eSO4?7H2O 27.85mg/L，MnSO4?4H2O 4.0mg/L，ZnSO4?7H2O 2.0mg/L，生物素 2.0mg/L，H3BO3 1.5mg/L，KI 1.0mg/L，CaSO4?5H2O 0.1mg/L，CoCl2?6H2O 0.2mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，維生素B1 1.0mg/L，維生素B6 0.5mg/L，煙酸 0.5mg/L，肌醇 100mg/L，KT 1.5mg/L，IAA 0.5mg/L，絲氨酸 0.25mg/L，谷氨酰胺 5.0mg/L，水解酪蛋白 0.4g/L，植物血凝素 3.5mg/L，AgNO3 5.0mg/L，幼穗提取液 25mg/L（幼穗提取液的獲取方法為：將小麥幼穗洗凈后稱取30g，切成碎片，加入100ml蒸餾水，煮沸20min，用4～6層紗布過濾靜置，待沉淀后將取上清液），瓊脂 7g/L，麥芽糖 90g/L，pH值為5.8；
（c）誘導(dǎo)培養(yǎng)：將小麥花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)基置于24～26℃的黑暗環(huán)境中誘導(dǎo)愈傷組織，30～40天后在花藥的邊緣出現(xiàn)白-淡黃色的無定型細(xì)胞團(tuán)，即小麥花藥愈傷組織；
獲得花藥愈傷后，在分化培養(yǎng)基（配方為：C17+蔗糖30g/L+瓊脂5.5g/L+AgNO31.5mg/L+山梨醇80mol/L+NAA 0.15mg/L+KT 1.5mg/L+ABA 0.1mg/L，pH值為5.8）中加入梯度濃度的NaCl溶液，然后將小麥耐鹽資源和育種主干親本的花藥愈傷轉(zhuǎn)移到該分化培養(yǎng)基中，將分化培養(yǎng)基置于溫度為25～27℃，光照強(qiáng)度為1500～2000Lx，光周期為光14h/暗10h的培養(yǎng)室條件下分化培養(yǎng)；篩選小麥耐鹽資源和育種主干親本花藥愈傷分化率均為0.75%～1.5%的分化培養(yǎng)基添加的NaCl濃度，將二者的平均值濃度的NaCl溶液確定為小麥耐鹽篩選壓；
（3）將小麥耐鹽資源和育種主干親本雜交，獲得F1雜交種：將步驟（1）正季種植的小麥耐鹽資源和育種主干親本雜交，獲得F1雜交種；
（4）F1雜交種花培獲得單倍體植株：F1雜交種正季播種種植，選取健壯主穗花藥進(jìn)行花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)，藥誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件和過程同步驟（2），獲得花藥愈傷組織，并挑選直徑0.5～0.8cm的花藥愈傷接種于添加了小麥耐鹽篩選壓的分化培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)，獲得單倍體植株，分化培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)條件、赤霉病粗毒素獲取方法和過程均同步驟（2）；
（5）單倍體植株繼代壯根：待單倍體植株苗長(zhǎng)至3-5cm之后轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基（生根培養(yǎng)基的配方為：1/2MS基本培養(yǎng)基+多效唑3.0g/L，pH值為5.8），然后將生根培養(yǎng)基置于溫度為27～29℃，光照強(qiáng)度為2500～3000Lx，光周期為光14h/暗10h的培養(yǎng)室條件下生根壯苗；15d后可觀察到單倍體植株生長(zhǎng)出旺盛的白色根系，將生根培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶封口膜打開，在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行開瓶練苗4～6天，然后轉(zhuǎn)移到光照強(qiáng)度為3000～6000Lx，溫度在10～30℃，濕度為70～85%，利用自然光煉苗7～10天；
（6）單倍體植株浸根加倍：將壯根并煉苗后的小麥單倍體植株取出，洗凈根部培養(yǎng)基殘留，剪去部分根須，留根長(zhǎng)度2～3cm，用添加了2%二甲基亞砜+0.5‰秋水仙堿溶液浸泡根系，25℃條件下處理24h，處理結(jié)束后再用清水將藥液沖洗干凈，然后將植株移栽到溫室中，遮陰5～7d后常規(guī)栽培管理；
（7）花培苗單株收種獲得花培家系，進(jìn)一步農(nóng)藝性狀、耐鹽性篩選獲得小麥耐鹽新品系：溫室種植小麥花培苗，單株收種獲得小麥耐鹽新家系，不同花培家系進(jìn)一步大田播種，農(nóng)藝性狀、耐鹽性篩選獲得農(nóng)藝形狀良好且耐鹽性得到改良的小麥新品系。
實(shí)施例
2011年開始，采用本發(fā)明的利用花培單倍體篩選優(yōu)良耐鹽株系的小麥耐鹽育種方法進(jìn)行優(yōu)質(zhì)中筋小麥新品種濟(jì)麥22的耐鹽性改良工作，其育種步驟如下。
（1）分別篩選新冬34號(hào)和濟(jì)麥22作為小麥耐鹽親本和育種主干親本：
濟(jì)麥22是山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所育成的超高產(chǎn)、多抗、優(yōu)質(zhì)中筋小麥新品種，畝有效穗40-45萬穗，穗粒數(shù)36-38粒，千粒重42-45克，容重800克/升左右，各地普遍反映產(chǎn)量高、增產(chǎn)潛力大，綜合抗性突出、穩(wěn)產(chǎn)性好（抗寒、抗倒、抗病、抗干熱風(fēng)），適應(yīng)性廣、易于栽培和獲得高產(chǎn)，對(duì)災(zāi)害性氣候的適應(yīng)性尤其好，解決了淮北地區(qū)小麥品種的安全性問題，應(yīng)用前景十分廣闊。然而，濟(jì)麥22對(duì)鹽害耐性不佳，2011年鹽池鑒定，相對(duì)鹽害指數(shù)為48.2%，耐鹽級(jí)別為3級(jí)，因此，急需進(jìn)行耐鹽改良。新冬34號(hào)是由中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所多年選育而成的優(yōu)質(zhì)中筋耐鹽冬小麥，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗鹽堿特性和明顯的豐產(chǎn)優(yōu)勢(shì)，平均畝產(chǎn)達(dá)到403.32公斤，不僅具有耐鹽性好的優(yōu)點(diǎn)，還具有抗病、抗倒性好的特點(diǎn)。2011年鹽池鑒定，新冬34號(hào)相對(duì)鹽害指數(shù)為3.1%，耐鹽級(jí)別為1級(jí)，耐鹽性極佳。
（2）確定小麥耐鹽篩選壓：2012年正季種植新冬34號(hào)和濟(jì)麥22，選取單核晚期的花藥分別進(jìn)行花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)，分別獲得花藥愈傷，在分化培養(yǎng)基中加入梯度濃度的NaCl溶液，然后將新冬34號(hào)和濟(jì)麥22的花藥愈傷轉(zhuǎn)移到該分化培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)，結(jié)果如下表1和表2；
由上表1和表2我們可以發(fā)現(xiàn)，濟(jì)麥22的花藥愈傷分化率為1%的分化培養(yǎng)基添加的NaCl溶液濃度約為2‰，新冬34號(hào)的花藥愈傷分化率為1%的分化培養(yǎng)基添加的NaCl溶液濃度約為5‰，取二者的平均值3.5‰的NaCl濃度確定為小麥耐鹽篩選壓。
同時(shí)，我們選擇不加NaCl的分化培養(yǎng)基分化出的花培植株進(jìn)行倍性鑒定，發(fā)現(xiàn)花培植株中單倍體植株的比例高達(dá)92.5%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)花藥培養(yǎng)中單倍體植株的比例，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)添加了NaCl的分化培養(yǎng)基中分化苗的單倍體植株比例，發(fā)現(xiàn)二者并無顯著差異。因此可以發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的分化培養(yǎng)基可以大大提高愈傷組織分化出單倍體植株的比例，減少了單倍體植株自然加倍的出現(xiàn)。
（3）將新冬34號(hào)和濟(jì)麥22雜交，獲得F1雜交種，F(xiàn)1雜交種花培獲得單倍體植株：
將2012年正季種植的新冬34號(hào)和濟(jì)麥22雜交，獲得F1雜交種，F(xiàn)1雜交種2013年正季種植，選取健壯主穗花藥進(jìn)行花藥誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得花藥愈傷組織，并挑選直徑0.5～0.8cm的花藥愈傷接種于添加了3.5%NaCl的分化培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)，獲得單倍體植株175棵。
（4）單倍體植株繼代壯根：
待單倍體植株苗長(zhǎng)至3-5cm之后轉(zhuǎn)接于生根培養(yǎng)基進(jìn)行繼代壯根，待單倍體植株生長(zhǎng)出旺盛的白色根系后，將生根培養(yǎng)的培養(yǎng)瓶封口膜打開，在培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行開瓶練苗4～6天，然后轉(zhuǎn)移到光照強(qiáng)度為3000～6000Lx，溫度為10～30℃，濕度為70～85%的條件下，利用自然光煉苗7～10天。
（5）單倍體植株浸根加倍：
將壯根并煉苗后的小麥單倍體植株取出，洗凈根部培養(yǎng)基殘留，剪去部分根須，留根長(zhǎng)度2～3cm，用添加了2%二甲基亞砜+0.5‰秋水仙堿溶液浸泡根系，25℃條件下處理24h，處理結(jié)束后再用清水將藥液沖洗干凈，然后將植株移栽到溫室中，遮陰5～7d后常規(guī)栽培管理。
（6）花培苗單株收種獲得花培家系，進(jìn)一步農(nóng)藝性狀、耐鹽性篩選獲得小麥耐鹽新品系：
2014年溫室種植小麥花培苗，單株收種獲得169個(gè)花培家系，2014年正季大田播種，2015年春季進(jìn)行農(nóng)藝性狀和耐鹽鑒定篩選到了農(nóng)藝形狀良好且耐鹽性得到改良的小麥新品系3個(gè)。
由此可見，本發(fā)明的育種方法與常規(guī)育種方法相比，通過調(diào)控小麥花藥培養(yǎng)過程，大大提高了小麥單倍體植株的比例，利用小麥單倍體植株對(duì)鹽處理敏感度高的優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行耐鹽性篩選，極大地提高了篩選效率，進(jìn)而利用單倍體加倍手段獲得倍性恢復(fù)的正常六倍體小麥植株，從而大大加快了小麥耐鹽育種速度，顯著縮短耐鹽育種周期，3年即可實(shí)現(xiàn)耐鹽育種，具有重要的產(chǎn)業(yè)價(jià)值。
以上實(shí)施例僅為說明本發(fā)明的技術(shù)思想，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡是按照本發(fā)明提出的技術(shù)思想，在技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的任何改動(dòng)，均落入本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)；本發(fā)明未涉及的技術(shù)均可通過現(xiàn)有技術(shù)加以實(shí)現(xiàn)。