豬精液體外低溫保存用稀釋劑及其制備方法與流程

文檔序號：12715196閱讀：1200來源：國知局

本發(fā)明屬于動物繁殖技術領域，具體涉及一種豬精液體外低溫保存用稀釋劑及其制備方法。

背景技術：

瑞典、英國、加拿大及美國等國家，在家畜動物育種及實際繁殖生產中已經建立人工授精技術平臺并且形成產業(yè)化，經濟效益顯著。而我國是一個養(yǎng)豬和消費大國，年產生豬量約6億多頭，豬肉產量約為6500萬噸，隨著人們生活水平的提高，人均豬肉的消費量逐年增加，養(yǎng)豬方式逐漸從傳統(tǒng)的庭院飼養(yǎng)方式轉變?yōu)楣S化、集約化和規(guī)?；?。我國由于飼養(yǎng)等因素，導致豬品種質量下降，如何有效利用優(yōu)質種豬資源進行聯(lián)合育種，提高優(yōu)質豬種質資源的利用率是目前養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的問題。隨著國家生豬改良政策支持及聯(lián)合育種的推廣，國外高端優(yōu)質種公豬的引進數量逐漸增加，優(yōu)質種公豬的高效利用已經引起廣泛重視。然而，缺乏可支撐體選育技術系，地方優(yōu)良品種以及引進優(yōu)質品種利用不足，導致整個繁育體系運行呈現(xiàn)“引進-擴繁-退化-再引進”依賴型循環(huán)狀態(tài)。優(yōu)質種豬的利用率低等問題逐漸顯現(xiàn)，已經成為目前養(yǎng)豬企業(yè)較為關注的突出問題。如何增強種豬的利用效率，提高繁殖生產效率，逐漸適應國內外消費市場對豬肉產品的新要求，擴大養(yǎng)豬企業(yè)生存和發(fā)展空間，實現(xiàn)上海地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)可持續(xù)循環(huán)發(fā)展是目前亟待解決的問題。

家畜動物牛、馬冷凍精子已經成功用于繁殖生產中，但豬凍精繁殖缺乏相應技術標準沒有達到普及推廣，尤其是凍精繁殖受孕及產仔數降低是凍精利用推廣的瓶頸，目前全球豬凍精的使用率不足1％。實際豬繁殖生產中，普遍利用17℃保存的新鮮精液進行人工輸精。然而，17℃保存的豬鮮精液有效利用期一般為3-5天，這樣在一定程度上限制優(yōu)質公豬鮮精液的有效利用率。因此，生豬繁殖生產中，凍精保存時間長，但繁殖受孕率、產仔數降低。相反，鮮精17℃人工輸精繁殖生產效率與自然交配繁殖率相似，但因保存溫度高，精子代謝相對超低溫冷凍保存時明顯增強，能量消耗過快致使精子體外存活時間縮短，因此精液有效利用期只有3-5天，致使優(yōu)質種公豬精液利用率大大降低。如何在確保受孕率及產仔數的同時，又能延長體外保存時間，最大限度利用優(yōu)質種公豬資源，是目前養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的關鍵問題。豬精液體外保存時溫度直接影響精子的代謝以及存活壽命，而與保存溫度相適應的稀釋防護劑配制是人工授精繁殖涉及到的關鍵性技術之一。研究表明，體外保存過程中，精子活力、存活時間以及質膜、頂體完整率等質量特性直接影響人工輸精的受孕率。豬精子與其它哺乳動物的精子類似，在超低溫冷凍保存過程中，精子對低溫損傷及氧化損傷的抗性較弱，致使精子活力下降，質膜完整率及頂體完整率亦明顯降低，人工授精的受孕率及胎仔數均低于自然繁殖(Watson，Anim Reprod Sci，2000，42：251～260.)。Petrunkina等(Theriogenology.2005)從理論上對動物精子冷凍保存作了進一步分析，認為在凍融過程中質膜結構發(fā)生變化引起精子的損傷，進而導致凍融精子的死亡或產生類似凋亡現(xiàn)象，從而引起母豬受孕率及產子數降低。理論上，4℃低溫保存能夠有效延長精液保存時間，避免精子的冷凍及解凍損傷，使精液利用率最大化。然而，目前在實際生產中尚未使用4℃溫度保存的豬精液。研究證實，4℃低溫保存時可能破壞了精子頂體質膜完整性，使細胞骨架發(fā)生不同程度遷移，導致細胞無法承受滲透壓變化，精子供能途徑受阻，細胞內ATP供應不足致使活力下降(Zhao等，Animal Science Journal，2013，84：600-606)；其次，精液在體外保存過程中，細胞內會產生過多不穩(wěn)定的活性氧離子(ROS)，使ROS在精子細胞中沉積，引起細胞發(fā)生氧化應激反應，造成精子質膜和頂體受損，導致活力下降(Roland等，Theriogenology，2006，66：1115-1123)。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對上述現(xiàn)有技術中指出的針對低溫(4℃-5℃)溫度保存豬精液時所產生的不利因素，篩選出有利于維護豬精子結構穩(wěn)定性、增強精子抗氧化損傷的稀釋劑成分，提供一種豬精液體外低溫(4℃-5℃)保存用稀釋劑及其制備方法。利用該稀釋液低溫4℃保存豬精液時，顯著降低精子ROS氧化損傷，有利于維持豬精子的質膜完整性及頂體完整性，能有效延長豬精子低溫保存的存活時間，提高優(yōu)質種公豬精液使用效率及人工養(yǎng)殖的經濟效益。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的：

第一方面，本發(fā)明涉及一種豬精液體外低溫保存用稀釋劑，所述稀釋劑包括如下組分：D-果糖、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇、檸檬酸三鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、N-乙?；?半胱氨酸、脫脂奶粉、蛋黃凍干粉和廣譜抗生素抑菌劑。

優(yōu)選地，按所述稀釋劑體積為100mL計，包括：

所述稀釋劑的pH值為6.80～7.30，滲透壓為280～350mOsmo/mL。

優(yōu)選地，所述脫脂奶粉和蛋黃凍干粉的用量比為用量比為1∶0.31～1∶1.86。更優(yōu)選為1∶0.5～1∶1.4；在該用量范圍內，稀釋劑中的脫脂奶粉和蛋黃凍干粉能協(xié)同發(fā)揮最佳的乳化作用以及非滲透性保護作用，進而可以更好地維持豬精子活力各項參數，有效延長豬精子體外存活的時間。

優(yōu)選地，所述脫脂奶粉為超聲波加工處理后的脫脂奶粉；所述蛋黃凍干粉為超聲波加工處理后的蛋黃凍干粉；超聲波的參數范圍：頻率范圍為20～25KHz，超聲時間為5～30min。

優(yōu)選地，所述廣譜抗生素抑菌劑包括硫酸丁胺卡那霉素、阿莫斯林、慶大霉素、青霉素、頭孢類抗生素中的一種或幾種。

優(yōu)選地，所述豬精液體外低溫保存用稀釋劑中低溫指的是4℃～5℃。

優(yōu)選地，按所述稀釋劑體積為100mL計，包括：

第二方面，本發(fā)明還涉及一種前述的豬精液體外低溫保存用稀釋劑的制備方法，所述方法包括如下步驟：

S1、稱取所述D-果糖、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇、檸檬酸三鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉、N-乙?；?半胱氨酸溶于重蒸水或者超純水中；

S2、依次加入脫脂奶粉、蛋黃凍干粉，超聲混合；

S3、加入廣譜抗生素抑菌劑，最后用重蒸水或者超純水混合均勻定容至100mL即可。

優(yōu)選地，步驟S2中，所述超聲混合是以60～80頻率振幅超聲5～10分鐘。

本發(fā)明采用D-果糖、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇、檸檬酸三鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸、乙二胺四乙酸二鈉等成分，N-乙?；?半胱氨酸、脫脂奶粉、蛋黃凍干粉、硫酸丁胺卡那霉素等常規(guī)抑菌劑配制成豬精液體外低溫保存的稀釋劑。該稀釋劑能有利于維持豬精子代謝功能，為精子提供充足的ATP用于保存自身一定的活力，有效延長豬精子低溫體外保存過程中的存活時間。

本發(fā)明的新型豬精液體外低溫(4℃-5℃)保存稀釋劑，有提供能量代謝基礎的糖類、離子中間載體、滲透壓調節(jié)劑、抗氧化劑、維持精子質膜結構穩(wěn)定性的乳化劑以及廣譜抗菌劑等多種成分。利用該新型稀釋劑體外低溫(4℃-5℃)保存豬精液過程中，體現(xiàn)如下特點：能夠在低溫條件下，為處于似休眠狀態(tài)的精子提供充分的能量，用以維持正常的代謝活動；能夠為處于低溫環(huán)境中的豬精子提供適宜滲透壓、pH內環(huán)境，保證精子的正常生理機能；具有良好的抗氧化作用，有效抑制ROS的產生及精子凋亡，增強精子的抗氧化損傷能力；具有較高的乳化作用，有效抑制精子質膜與活性氧離子(ROS)接觸而發(fā)生的過氧化反應，有效地保護精子質膜結構的完整性。本發(fā)明的稀釋劑，能有效克服低溫對豬精子的機械損傷，延長豬精子低溫體外保存過程中的存活時間，利于維持豬精子的質膜完整性及頂體完整性，能有效延長豬精子低溫保存的存活時間，提高優(yōu)質種公豬精液使用效率及人工養(yǎng)殖的經濟效益。本發(fā)明涉及的硫酸丁胺卡那霉素等常規(guī)抑菌劑，包括廣譜抗生素等抑菌劑，這屬于本領域的常識。

本發(fā)明采用N-乙?；?半胱氨酸作為抗氧化劑，具有較好的抗氧化作用。研究證實，豬精液低溫體外保存過程中，精子細胞會產生氧化物質ROS，一定量的ROS能引起精子自身的氧化損傷，導致精子細胞色素C功能變化以及質膜內層磷脂酰絲氨酸外移，引起凋亡相關蛋白酶活性及精子代謝異常，進而誘導精子進入凋亡狀態(tài)。本發(fā)明中利用N-乙?；?半胱氨酸能夠減少超氧自由基的生成，有效抑制ROS的產生及精子凋亡，增強精子的抗氧化損傷能力，表現(xiàn)出明顯的抗氧化作用。因此，體外低溫保存過程中，N-乙酰基-半胱氨酸作為一種非酶類抗氧化劑，可以有效阻止ROS在細胞中沉積過多，避免精子細胞發(fā)生氧化應激，能有效減少豬精子的氧化損傷，延長豬精子的存活時間，從而提高豬精子的有效利用率。

本發(fā)明采用脫脂奶粉、蛋黃凍干粉等成分，經過超聲波加工處理后，能夠產生大量低密度脂蛋白及磷脂顆粒，具有一定乳化作用。豬精子體外保存過程中，在低溫刺激等機械損傷后，精子質膜極易受到破壞，尤其是低溫導致質膜及頂體膜產生融合，從而引起質膜破裂以及頂體囊泡的形成，使精子進入似獲能狀態(tài)，致使精子存活時間縮短。本發(fā)明中，脫脂奶粉、蛋黃凍干粉作為一種非滲透性保護劑，超聲波加工處理后產生的低密度脂蛋白及磷脂顆粒，可以通過清除離子和小分子維持精子質膜兩側的滲透壓，并且可以阻止精子質膜與活性氧離子(ROS)接觸而發(fā)生的過氧化反應，有效地保護精子質膜結構的穩(wěn)定性。實驗數據證實，添加了脫脂奶粉及蛋黃凍干粉的稀釋液可以有效維持豬精子活力各項參數，有效延長豬精子體外存活的時間。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：

(1)本發(fā)明的新型稀釋劑低溫4℃條件下體外保存豬精液，既克服超低溫冷凍保存對精子造成的機械性損傷，又能避免17℃條件下體外保存過程中精子壽命縮短的缺陷。在維持精子結構穩(wěn)定性的同時，有效延長豬鮮精液體外保存時間，顯著提高優(yōu)質種公豬精液的使用效率，同時節(jié)省飼養(yǎng)成本。

(2)本發(fā)明能有效提高豬精子的抗氧化能力，在乳化劑的平衡保護下，有效維持豬精子質膜、頂體結構的完整性，延長豬精子低溫環(huán)境下的存活時間，效果顯著。

(3)本發(fā)明的產品取材容易，成本價格低廉，易于推廣。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1

本實施例涉及一種新型低溫(4℃-5℃)保存豬精液的稀釋劑；所述豬精液稀釋劑包括如下各組分：按豬精液稀釋劑體積為100mL計，D-果糖(3250mg)、2-氨基-2-羥甲基-1，3-丙二醇(580mg)、檸檬酸三鈉(720mg)、碳酸氫鈉(120mg)、檸檬酸(380mg)、乙二胺四乙酸二鈉(265mg)、N-乙?；?半胱氨酸(18.5mg)、脫脂奶粉(800mg)、蛋黃凍干粉(520mg)、硫酸丁胺卡那霉素(30mg)。