本發(fā)明屬于黃顙魚育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種黃顙魚雄性化誘導(dǎo)生產(chǎn)XX♂偽雄魚的方法。
背景技術(shù)：
：黃顙魚的性別決定是雌性配子同型，雄性配子異型，性腺分化時(shí)間卵巢要比精巢早。組織學(xué)觀察表明，卵巢分化的最早形態(tài)學(xué)標(biāo)志和細(xì)胞學(xué)標(biāo)志分別出現(xiàn)于13DAH（Daysafterhatching，距孵化出膜的天數(shù)）和34DAH，精巢分化的最早形態(tài)形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)標(biāo)志分別出現(xiàn)于55DAH和64DAH。魚類的性別分化具有可塑性，采用激素人工誘導(dǎo)，可以將遺傳性別為雄性的仔魚誘導(dǎo)生理性雌魚，也可以將遺傳性別為雌性的仔魚誘導(dǎo)為生理性雄魚（偽雄魚）。人工誘導(dǎo)XX偽雄魚（基因型為XX的生理雄魚）在鯉魚、泥鰍等全雌魚的生產(chǎn)中有成功報(bào)道。一般方法是在魚苗性別分化的敏感期，通過雄性激素、芳香化酶抑制劑等藥物處理，誘導(dǎo)性腺發(fā)育為精巢。不同的魚類在藥物種類、劑量，以及藥物處理開始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間等方面不同。黃顙魚的雄性化可通過雄性激素誘導(dǎo)或者芳香化酶抑制劑處理，17α甲基睪丸酮（MT）和來曲唑（LZ，Letrozole）是常用的雄性化誘導(dǎo)藥物。由于黃顙魚精巢分化晚于卵巢分化，雄性化誘導(dǎo)較雌性化誘導(dǎo)困難。掌握黃顙魚性腺發(fā)育特征和性別分化的關(guān)鍵期鑒定技術(shù)，篩選出有效的雄性化藥物種類、藥物濃度、藥物處理開始時(shí)間和持續(xù)時(shí)間，是黃顙魚雄性化誘導(dǎo)技術(shù)的關(guān)鍵。目前，有少量關(guān)于黃顙魚雄性化誘導(dǎo)的報(bào)道，但沒有獲得成功繁殖的XX偽雄魚，也沒有針對(duì)不同遺傳性別黃顙魚性腺人工誘導(dǎo)效果鑒定的技術(shù)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明提供一種黃顙魚雄性化誘導(dǎo)生產(chǎn)XX♂偽雄魚的方法，包括如下步驟：步驟1）人工繁殖黃顙仔魚：利用挑選性成熟的野生黃顙魚親本XX♀與XY♂，利用常規(guī)人工繁殖和孵化技術(shù)，獲得XX♀和XY♂的仔魚；步驟2）雄性化誘導(dǎo)：用17α甲基睪丸酮和來曲唑溶液處理輪蟲、鹵蟲和水蚯蚓投喂步驟1）得到的XX♀和XY♂的仔魚，輪蟲的投放為每天投喂4次，每次相隔6小時(shí)，投喂1-2天后，再用鹵蟲投喂15天后，再用水蚯蚓投喂，投喂量約為魚體重的3-5%，每天上午、下午和晚上各投喂一次，以半個(gè)小時(shí)吃完為準(zhǔn)，一直喂到76天，養(yǎng)至性成熟，通過外形判定雌雄：雄魚的生殖器已開始突起，而雌魚則無；剔除XX♀，剩XX♂偽雄魚和ＸＹ♂；步驟3）獲得XX♂偽雄魚：利用分子標(biāo)記，淘汰XY♂，篩選獲得XX♂偽雄魚，同時(shí)，采用測(cè)交驗(yàn)證，篩選性腺為精巢且具有繁殖能力的XX♂偽雄魚。進(jìn)一步的，還包括4）批量生產(chǎn)XX♀仔魚：將步驟3）得到的XX♂偽雄魚與XX♀雌魚交配，產(chǎn)生XX♀仔魚；5）擴(kuò)群：將步驟4）批量生產(chǎn)XX♀仔魚重復(fù)步驟2）和步驟3），批量得到XX♂偽雄魚。進(jìn)一步的，步驟2)所述17α甲基睪丸酮溶液的濃度為30ugL-1，來曲唑溶液的濃度為50ugL-1。進(jìn)一步的，濃度為30ugL-1的17α甲基睪丸酮溶液和濃度為50ugL-1為來曲唑溶液的比例為1:1。進(jìn)一步的，步驟3）所述分子標(biāo)記為XY1-F：GATTGTAGAAGCCATCTCCTTAGCGTA；XY1-R：CATGTAGATCACTGTACAATCCCTG。進(jìn)一步的，步驟3）所述測(cè)交驗(yàn)證用成熟的XX♀作為母本。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：1、利用遺傳性別和生理性別早期鑒定技術(shù)，實(shí)現(xiàn)在性腺分化過程中適時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)性效果，從而能夠較精準(zhǔn)地篩選出性腺分化人工調(diào)控參數(shù)。2、利用全雌性仔魚轉(zhuǎn)雄性，可以快速高效地批量獲得XX♂偽雄魚，可實(shí)現(xiàn)全雌魚快速擴(kuò)繁。3、采用芳香化酶抑制劑LZ和雄性激素MT聯(lián)合處理方法，更高效地誘導(dǎo)XX雌魚雄性化。附圖說明圖1黃顙魚雄性化誘導(dǎo)技術(shù)原理圖；圖2為本發(fā)明所述方法的工藝流程圖；圖3為利用分子標(biāo)記檢測(cè)黃顙魚基因型的電泳圖譜。如圖所示，1-24均代表電泳泳道。具體實(shí)施方式為了本領(lǐng)域技術(shù)人員更好理解和實(shí)施本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但所舉實(shí)例不作為本發(fā)明的限定。實(shí)施例1本發(fā)明所述一種黃顙魚雄性化誘導(dǎo)生產(chǎn)XX♂偽雄魚的方法，如圖2所示，包括如下步驟，步驟1）人工繁殖黃顙仔魚：利用挑選性成熟的野生黃顙魚親本XX♀與XY♂，利用常規(guī)人工繁殖和孵化技術(shù)，獲得XX♀和XY♂的仔魚；仔魚利用活餌培育，首先用輪蟲開口，再用鹵蟲培育至稚魚期后，投喂剪碎的水蚯蚓。步驟2）轉(zhuǎn)性參數(shù)篩選：選擇17α甲基睪丸酮和/或來曲唑作為雄性化誘導(dǎo)藥物。每種藥物設(shè)置高低范圍較大的兩個(gè)濃度梯度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，估計(jì)藥物有效濃度范圍，再根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置兩個(gè)范圍較小的濃度梯度，篩選最佳藥物濃度。首先，MT藥物設(shè)置高低范圍較大（10ugL-1、60ugL-1）的兩個(gè)濃度梯度、LZ藥物設(shè)置高低范圍較大（20ugL-1、70ugL-1）的兩個(gè)濃度梯度進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，估計(jì)MT藥物有效濃度范圍（20-50ugL-1），MT藥物有效濃度范圍（30-70ugL-1），再根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置兩個(gè)范圍較小的濃度梯度（MT藥物30ugL-1、40ugL-1，LZ藥物40ugL-1、50ugL-1）。每次處理設(shè)置5個(gè)試驗(yàn)組，即對(duì)照組、MT低濃度組、MT高濃度組、LZ低濃度組、LZ高濃度組。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每組約200尾仔魚。采用活餌作為藥物載體進(jìn)行性別調(diào)控處理，用17α甲基睪丸酮和來曲唑溶液處理輪蟲、鹵蟲和水蚯蚓投喂步驟1）得到的XX♀和XY♂的仔魚，輪蟲的投放為每天投喂4次，每次相隔6小時(shí)，投喂1-2天后，再用鹵蟲投喂15天后，再用水蚯蚓投喂，投喂量約為魚體重的3-5%，每天上午、下午和晚上各投喂一次，以半個(gè)小時(shí)吃完為準(zhǔn)，一直喂到76天，養(yǎng)至性成熟，通過外形判定雌雄：雄魚的生殖器已開始突起，而雌魚則無；剔除XX♀，剩XX♂偽雄魚和ＸＹ♂。轉(zhuǎn)性效果鑒定：試驗(yàn)魚在仔魚時(shí)期利用5L魚缸試驗(yàn)，進(jìn)入稚魚時(shí)期后利用60L魚缸飼養(yǎng)，轉(zhuǎn)性處理結(jié)束后的幼魚轉(zhuǎn)入池塘網(wǎng)箱或者水泥池，飼養(yǎng)至性成熟。在轉(zhuǎn)性過程中以及轉(zhuǎn)性結(jié)束后，對(duì)各組試驗(yàn)魚性腺發(fā)育情況進(jìn)行適時(shí)取樣檢測(cè)，取樣時(shí)間根據(jù)黃顙魚性腺發(fā)育特征設(shè)置，例如，如圖1所示，在第7，14，35，56，70DAH時(shí)取樣。每次取樣每組取6尾試驗(yàn)魚。每尾試驗(yàn)魚用MS222麻醉后，取尾鰭作為DNA樣本，取軀干作為性腺組織樣本。鰭條用無水乙醇固定，軀干用5%多聚甲醛固定24h后，轉(zhuǎn)入70%乙醇中保存。采用性別連鎖分子標(biāo)記鑒定仔魚的遺傳性別，篩選區(qū)分出XX基因型和XY基因型試驗(yàn)魚性腺樣本，制作石蠟切片。分子標(biāo)記的引物為：XY1-F：GATTGTAGAAGCCATCTCCTTAGCGTA；XY1-R：CATGTAGATCACTGTACAATCCCTG；通過PCR擴(kuò)增，得到的X片段大小826bp，Y片段大小955bp。首先觀察描述對(duì)照組XX♀基因型和XY♂基因型試驗(yàn)魚性腺發(fā)育特征，再將各試驗(yàn)組XX♀基因型試驗(yàn)魚性腺組織學(xué)特征與對(duì)照比較。在XX♀基因型試驗(yàn)魚的轉(zhuǎn)性過程中，依據(jù)是否成功誘導(dǎo)精巢分化、抑制卵巢發(fā)育、促進(jìn)精巢發(fā)育、維持精巢發(fā)育，判斷轉(zhuǎn)性效果，進(jìn)而，篩選出最佳藥物及處理濃度。結(jié)合性別連鎖標(biāo)記和石蠟切片，初步推斷最佳藥物及處理濃度轉(zhuǎn)性為MT藥物30ugL-1、LZ藥物50ugL-1。將用MT藥物30ugL-1、LZ藥物50ugL-1處理的魚種培育至性成熟。利用外形觀察淘汰XX♀，養(yǎng)至性成熟，通過外形判定雌雄：雄魚的生殖器已開始突起，而雌魚則無。用藥物對(duì)XX♀仔魚雄性轉(zhuǎn)化率結(jié)果存在三種：1、真正轉(zhuǎn)成功的，即精巢發(fā)育和普通精巢發(fā)育一樣，精子有活力，與雌魚交配可以繁殖魚苗；2、轉(zhuǎn)成功了，精巢發(fā)育看上去可普通精巢一樣，但精子沒活力，不能進(jìn)行繁殖；3、兼性性腺，即同時(shí)存在精巢和卵巢情況。本發(fā)明計(jì)算的轉(zhuǎn)化率為第一種情況。表1不同濃度的MT和LZ對(duì)XX♀仔魚雄性轉(zhuǎn)化率和成活率的影響MTMTLZLZMT30：LZ50=1:1空白對(duì)照濃度30ugL-140ugL-140ugL-150ugL-10ugL-1轉(zhuǎn)化率(%)50.138.552.671.268.40成活率(%)56.745.543.937.751.161.1步驟3）利用分子標(biāo)記淘汰XY♂，如圖3所示，利用分子標(biāo)記的引物為：XY1-F：GATTGTAGAAGCCATCTCCTTAGCGTA；XY1-R：CATGTAGATCACTGTACAATCCCTG；擴(kuò)增DNA，如1-8泳道所示擴(kuò)增片段長(zhǎng)為826bp，為YY基因型，如9-16泳道所示擴(kuò)增片段為826bp和955bp，為XY基因型，如17-24泳道所示擴(kuò)增片段955bp，為XX基因型。淘汰XY♂，留XX♂偽雄魚。采用測(cè)交驗(yàn)證，XX♂偽雄魚與正常XX雌魚交配，檢驗(yàn)其繁殖力，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)性效果，篩選性腺為精巢且具有繁殖能力的XX♂偽雄魚。轉(zhuǎn)性方法優(yōu)化：經(jīng)過步驟2和步驟3篩選出的最佳MT和LZ的劑量后，將兩種藥物按照1:1劑量進(jìn)行配組，按照步驟2和步驟3的方法，確定MT和LZ混合處理的效果更佳，篩選出XX雌魚最佳雄性化方法。規(guī)模化應(yīng)用：獲得XX♂偽雄魚后，采用步驟1批量獲得XX♀仔魚，利用篩選的最佳雄性化方法批量獲得XX♂偽雄魚。XX♂偽雄魚培育至性成熟后，供應(yīng)XX♀全雌魚的規(guī)模化生產(chǎn)。為全雌魚生產(chǎn)提供來源清晰、質(zhì)量穩(wěn)定的母父本。序列表<110>武漢百瑞生物技術(shù)有限公司<120>一種黃顙魚雄性化誘導(dǎo)生產(chǎn)XX♂偽雄魚的方法<130><160>2<170>PatentInversion3.5<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>1gattgtagaagccatctccttagcgta27<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>2catgtagatcactgtacaatccctg25當(dāng)前第1頁1 2 3