本發(fā)明涉及一種涇陽鏈霉菌可濕性粉劑的制備方法，屬于農(nóng)業(yè)微生物與生物農(nóng)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：涇陽鏈霉菌(Streptomycesjingyangensis)是一種放線菌，俗稱5406。涇陽鏈霉菌的代謝活動(dòng)能促進(jìn)有機(jī)物分解，使養(yǎng)分有效化，同時(shí)能釋放抗菌物質(zhì)，從而能有效地防止多種作物病蟲害,并能產(chǎn)生刺激植物生長的激素，它還能促進(jìn)土壤團(tuán)聚體的形成，具有促進(jìn)腐殖質(zhì)的形成和產(chǎn)生多糖的能力。這種抗生菌已在多種農(nóng)作物上廣泛使用。鏈霉菌是最具生防價(jià)值的放線菌，鏈霉菌屬中的許多種對(duì)植物病原菌有拮抗作用。目前已篩選出了10多種最具生防價(jià)值的鏈霉菌。涇陽鏈霉菌對(duì)黃萎病菌、枯萎病菌、立枯病菌、猝倒病菌等多種植物病害具有抗性，且可促進(jìn)植物生長。涇陽鏈霉菌是一株優(yōu)良的生物肥料與生物農(nóng)藥菌株，隨著設(shè)施農(nóng)業(yè)的發(fā)展，特別是滴灌系統(tǒng)的出現(xiàn)，現(xiàn)有的菌粉不適合使用；盡管李亞寧等在專利號(hào)201110375945.8中公開了一種以硅藻土為基質(zhì)的玫瑰黃鏈霉菌生物殺菌劑的可濕性粉劑，其組分及含為：玫瑰黃鏈霉菌菌株式會(huì)0116繁殖體≥108個(gè)；潤濕分散劑4%。閆震等以玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63的種子液為試驗(yàn)材料，找到適宜的潤濕分散劑為木質(zhì)素磺酸鈉，添加此助劑后樣品的懸浮率最大可達(dá)50.27%。99.97%樣品細(xì)度〈44μm，水分減量〈1.5%，潤濕時(shí)間〈18s。最后檢測了玫瑰黃鏈霉菌Men-myco-93-63活菌的可濕性粉劑對(duì)大棚內(nèi)甜瓜白粉病的田間防效。結(jié)果表明，其防治效果高達(dá)87%。但涇陽鏈霉菌的可濕性粉劑的制備方法還未有報(bào)道，涇陽鏈霉菌的培養(yǎng)與研究在上世紀(jì)60-70年代研究較多，大部分是在肥土中進(jìn)行發(fā)酵，但我們經(jīng)過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在中國大部分土壤經(jīng)過近三十多年的重施化肥，少施有機(jī)肥的現(xiàn)狀下，肥土的獲得已經(jīng)沒有以前方便而且穩(wěn)定，我們?cè)谌珖?0多個(gè)省拿到的土地樣進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用現(xiàn)有的工藝發(fā)酵后，涇陽鏈霉菌的孢子含量最高的都沒有過20億CFU/g的，而且肥土發(fā)酵中會(huì)殘存大量的害蟲，無法殺滅，如果施入健康土壤中會(huì)引起害蟲的傳播，另外肥土不適宜做可濕性粉劑的載體?，F(xiàn)有的鏈霉菌的可濕性粉劑中菌體含量過低。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種菌體含量高，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的涇陽鏈霉菌可濕性粉劑及其制備方法，所述涇陽鏈霉菌可濕性粉劑由下列重量份組成：涇陽鏈霉菌發(fā)酵菌粉90-95份；潤濕劑：十二烷基苯磺酸鈉1-4份；分散劑：茶皂素0.2-1份；紫外保護(hù)劑：抗壞血酸0.5-2份，β-糊精0.2-1份；干燥保護(hù)劑：麥芽糖1-4份，甘露醇0.2-1份；其具體制備方法，由以下幾步驟組成：一、涇陽鏈霉菌發(fā)酵菌粉的制備取出菌種保藏管，用高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)4-5天。在平板下挑取單個(gè)菌落接種至茄子瓶中高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基上，涂滿整個(gè)茄子瓶，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)4-6天，等菌體表面有淺粉紅色孢子即可，將1L無菌水將茄子瓶中的菌苔洗下，將洗下的涇陽鏈霉菌接種于裝有350L涇陽鏈霉菌液體培養(yǎng)基的500L種子發(fā)酵罐，初始pH值為7.2，溫度為30℃，通風(fēng)1:1，開攪拌，轉(zhuǎn)速為200r/min；培養(yǎng)36-48小時(shí)，待菌體變粘稠，有大量菌絲產(chǎn)生，即可作為涇陽鏈霉菌液體菌種；將涇陽鏈霉菌以10%的接種量接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻攤至發(fā)酵托盤中，固體發(fā)酵培養(yǎng)基的厚度為3-5cm，28-32℃培養(yǎng)2-3天，待固體發(fā)酵培養(yǎng)基長出大量白色菌點(diǎn)，孢子含量超過105億cfu/g，即可風(fēng)干至水份含量低于4%即可；其中，所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配比為：高嶺土：玉米淀粉：豆粕粉：沼澤紅假單胞菌液=100：2：2：20；其中，所述高氏一號(hào)培養(yǎng)基：淀粉20g、NaCl0.5g、KNO31g、KH2PO4·3H2O0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、MgSO4·7H2O0.5g、瓊脂18g、水1000ml；其中，所述涇陽鏈霉菌液體培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，豆粕粉20g/L，氯化鈉5g/L，硫酸鎂0.5g/L，碳酸鈣2g/L，pH7.2；各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘；其中，沼澤紅假單胞菌菌液的制備：取出沼澤紅假單胞菌種保藏管，用沼澤紅假單胞菌固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，在光照培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)72小時(shí)。光照強(qiáng)度：1000lex-6000lex。在平板下挑取單個(gè)菌落接種50毫升沼澤紅假單胞菌液體培養(yǎng)基中，在光照培養(yǎng)箱中30℃厭氧培養(yǎng)120小時(shí)。種子采用20%的接種量，接種至裝有4L的沼澤紅假單胞菌液體培養(yǎng)基的5L大三角瓶，在光照培養(yǎng)箱中30℃厭氧培養(yǎng)72-96小時(shí)，檢測其菌液濃度，菌含量超過30億CFU/ml，即可作為沼澤紅假單胞菌菌液。其中所述沼澤紅假單胞菌固體培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1g，氯化鈣0.1g，碳酸鈉3g，醋酸鈉1g，氯化鎂0.5g，氯化銨1g，氯化鈉1g，瓊脂20g，pH7.5，水1000mL。其中所述沼澤紅假單胞菌液體培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1g，氯化鈣0.1g，碳酸氫鈉2g，醋酸鈉4g，氯化鎂0.5g，氯化銨1g，氯化鈉1g，微量元素10mL,pH7.5，水1000mL。各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘；其中，微量元素的配制：一水硫酸錳4g，硼酸2g，二水鉬酸鈉0.05g，五水硫酸銅0.005g，六水氯化鈷0.05g,水1000mL。二、將涇陽鏈霉菌發(fā)酵菌粉90-95份；潤濕劑：十二烷基苯磺酸鈉1-4份；分散劑：茶皂素0.2-1份；紫外保護(hù)劑：抗壞血酸0.5-2份，β-糊精0.2-1份；干燥保護(hù)劑：麥芽糖1-4份，甘露醇0.2-1份；混勻并過通過氣流粉碎機(jī)粉碎過400目篩，檢測其涇陽鏈霉菌孢子含量不低于100億cfu/g，懸浮率不低于85%，潤濕時(shí)間不高于85s，水分含量低于5%，真空包裝，即為涇陽鏈霉菌可濕性粉劑。其中，涇陽鏈霉菌可濕性粉劑由下列重量分優(yōu)先組成為：由涇陽鏈霉菌發(fā)酵菌粉90份；潤濕劑：十二烷基苯磺酸鈉3份；分散劑：茶皂素0.7份；紫外保護(hù)劑：抗壞血酸1.5份，β-糊精0.6份；干燥保護(hù)劑：麥芽糖3份，甘露醇0.8份。本發(fā)明的涇陽鏈霉菌發(fā)酵粉的制備以菌落形成單位數(shù)為指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行單因素篩選。首先選用硅藻土，膨潤土，沸石粉，高嶺土，白炭黑，磷礦粉，輕質(zhì)碳酸鈣為供試基質(zhì)，結(jié)果表明，該菌在以上基質(zhì)上均可生長，但在高嶺土中的生長狀況較優(yōu)，因此確定高嶺土為適宜的固體基質(zhì)。通過優(yōu)化碳氮源（玉米淀粉，葡萄糖，可溶性淀粉，面粉，木薯粉，蛋白胨，酵母膏，豆粕粉，棉粕粉，玉米漿干粉，硝酸鈉，氯化銨，硫酸銨），以及復(fù)合維生素，復(fù)合微量元素，沼澤紅假單胞菌液等，發(fā)現(xiàn)在載體為高嶺土，碳源為玉米淀粉，氮源為豆粕粉，特別是創(chuàng)造性的在培養(yǎng)基中加入沼澤紅假單胞菌液，沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液中含有多種生理活性物質(zhì)，如葉綠素Ａ、Ｂ，類胡蘿卜素，多種維生素(尤其是Ｂ族維生素)，多種生長激素(如IAA、GA3、ABA、乙烯、細(xì)胞分裂素)、核酸、水楊酸、多種氨基酸以及單細(xì)胞蛋白質(zhì)等，還可為涇陽鏈霉菌生長提供了某些未知營養(yǎng)因子，而使得其涇陽鏈霉菌孢子含量大大提高，提高差不多2倍以上，可超過120億CFU/克，大大提高了的鏈霉菌孢子的含量，本發(fā)明人通過對(duì)助劑（潤濕劑和分散劑）（聚乙烯醇，聚乙二醇，CMC-Na,吐溫-60，十二烷基苯磺酸鈉，T型木質(zhì)素，十二烷基硫酸鈉，茶皂素，MorwetEFW，MorwetD425，My100，D110，阿拉伯權(quán)膠，2-萘磺酸甲醛聚合物鈉鹽，辛基酚聚氧乙烯醚，二異辛基琥珀酸酯磺酸鈉，甲基纖維素，木質(zhì)素磺酸鈉）、紫外線保護(hù)劑（抗壞血酸，糊精，十二烷基苯磺酸鈉，剛果紅，羧甲基纖維素，卵磷脂），干燥保護(hù)劑（脫脂奶粉，蔗糖，谷氨酸鈉，麥芽糖，甘露醇，甲基纖維素等）進(jìn)行篩選，其每種助劑對(duì)涇陽鏈霉菌的孢子存活，懸浮性，濕潤性進(jìn)行試驗(yàn)，最后通過多輪單因素與正交試驗(yàn)確定涇陽鏈霉菌可濕性粉劑的配方。檢測其涇陽鏈霉菌孢子含量不低于100億cfu/g，懸浮率不低于85%，潤濕時(shí)間不高于85s，水分含量低于5%，通過驗(yàn)證，本發(fā)明的涇陽鏈霉菌可濕性粉劑在20-25℃下保存一年，其孢子存活率還可達(dá)到85%。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：創(chuàng)造性的將沼澤紅假單胞菌液引入涇陽鏈霉菌培養(yǎng)基中，使其孢子含量大大提高，比原來的配方提高了2倍以上，達(dá)到了120億CFU/克以上。提供了一種制備涇陽鏈霉菌可濕性粉劑，涇陽鏈霉菌孢子含量不低于100億cfu/g，細(xì)度粉碎過400目篩，懸浮率不低于85%，潤濕時(shí)間不高于85s，水分含量低于5%的制備方法，制備方法穩(wěn)定，使用量少，效果好。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種涇陽鏈霉菌可濕性粉劑，其特征在于，所述涇陽鏈霉菌可濕性粉劑由下列重量份組成：涇陽鏈霉菌發(fā)酵菌粉90份；潤濕劑：十二烷基苯磺酸鈉3份；分散劑：茶皂素0.7份；紫外保護(hù)劑：抗壞血酸1.5份，β-糊精0.6份；干燥保護(hù)劑：麥芽糖3份，甘露醇0.8份；其具體制備方法，由以下幾步驟組成：一、涇陽鏈霉菌發(fā)酵菌粉的制備取出菌種保藏管，用高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，30℃培養(yǎng)4-5天，在平板下挑取單個(gè)菌落接種至茄子瓶中高氏一號(hào)固體培養(yǎng)基上，涂滿整個(gè)茄子瓶，在培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)4-6天，等菌體表面有淺粉紅色孢子即可，將1L無菌水將茄子瓶中的菌苔洗下，將洗下的涇陽鏈霉菌接種于裝有350L涇陽鏈霉菌液體培養(yǎng)基的500L種子發(fā)酵罐，初始pH值為7.2，溫度為30℃，通風(fēng)1:1，開攪拌，轉(zhuǎn)速為200r/min；培養(yǎng)36-48小時(shí)，待菌體變粘稠，有大量菌絲產(chǎn)生，即可作為涇陽鏈霉菌液體菌種；將涇陽鏈霉菌液體菌種以10%的接種量接種至固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻攤至發(fā)酵托盤中，固體發(fā)酵培養(yǎng)基的厚度為3-5cm，28-32℃培養(yǎng)3天，待固體發(fā)酵培養(yǎng)基長出大量白色菌點(diǎn)，檢測孢子含量為112億cfu/g，即可風(fēng)干至水份含量低于4%即可；其中，所述固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配比為：高嶺土：玉米淀粉：豆粕粉：沼澤紅假單胞菌液=100：2：2：20；其中，所述高氏一號(hào)培養(yǎng)基：淀粉20g、NaCl0.5g、KNO31g、KH2PO4·3H2O0.5g、FeSO4·7H2O0.01g、MgSO4·7H2O0.5g、瓊脂18g、水1000ml；其中，所述涇陽鏈霉菌液體培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，豆粕粉20g/L，氯化鈉5g/L，硫酸鎂0.5g/L，碳酸鈣2g/L，pH7.2；各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘；其中，沼澤紅假單胞菌菌液的制備：取出沼澤紅假單胞菌種保藏管，用沼澤紅假單胞菌固體培養(yǎng)基劃平板進(jìn)行復(fù)蘇，在光照培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)72小時(shí)，光照強(qiáng)度：1000lex-6000lex，在平板下挑取單個(gè)菌落接種50毫升沼澤紅假單胞菌液體培養(yǎng)基中，在光照培養(yǎng)箱中30℃厭氧培養(yǎng)120小時(shí)，種子采用20%的接種量，接種至裝有4L的沼澤紅假單胞菌液體培養(yǎng)基的5L大三角瓶，在光照培養(yǎng)箱中30℃厭氧培養(yǎng)72-96小時(shí)，檢測其菌液濃度，菌含量超過30億CFU/ml，即可作為沼澤紅假單胞菌菌液；其中，所述沼澤紅假單胞菌固體培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1g，氯化鈣0.1g，碳酸鈉3g，醋酸鈉1g，氯化鎂0.5g，氯化銨1g，氯化鈉1g，瓊脂20g，pH7.5，水1000mL；其中，所述沼澤紅假單胞菌液體培養(yǎng)基：磷酸二氫鉀1g，氯化鈣0.1g，碳酸氫鈉2g，醋酸鈉4g，氯化鎂0.5g，氯化銨1g，氯化鈉1g，微量元素10mL,pH7.5，水1000mL；各培養(yǎng)基滅菌的條件為：0.10-0.15MPa，121℃滅菌30分鐘；其中，微量元素的配制：一水硫酸錳4g，硼酸2g，二水鉬酸鈉0.05g，五水硫酸銅0.005g，六水氯化鈷0.05g，水1000mL；二、將涇陽鏈霉菌發(fā)酵菌粉90份；潤濕劑：十二烷基苯磺酸鈉3份；分散劑：茶皂素0.7份；紫外保護(hù)劑：抗壞血酸1.5份，β-糊精0.6份；干燥保護(hù)劑：麥芽糖3份，甘露醇0.8份；混勻并過通過氣流粉碎機(jī)粉碎過400目篩，檢測其涇陽鏈霉菌孢子含量為104億cfu/g，懸浮率為89%，潤濕時(shí)間為60s，水分含量為4%，真空包裝，即為涇陽鏈霉菌可濕性粉劑。實(shí)施例2本發(fā)明涇陽鏈霉菌可濕性粉劑在香蕉枯萎病的防治的應(yīng)用效果1試驗(yàn)時(shí)間：2014年5月-2016年6月2．試驗(yàn)地點(diǎn)：廣東省徐聞縣某農(nóng)場3．試驗(yàn)方案：試驗(yàn)組：每月滴灌一次，用量為本發(fā)明的涇陽鏈鏈霉菌可濕性粉劑1公斤/畝，使用面積為22畝；對(duì)照組：使用市售某芽孢桿菌可濕性粉劑（香蕉專用）10公斤/畝，使用面積為108畝，對(duì)照組使用芽孢桿菌可濕性粉劑使用至2015年3月，從2015年4月開始也使用本發(fā)明的涇陽鏈霉菌可濕性粉劑；其他管理相同。4．試驗(yàn)結(jié)果：我們統(tǒng)計(jì)了試驗(yàn)組與對(duì)照組發(fā)病情況，結(jié)果如下表1，從表1中明顯可以看出，試驗(yàn)組使用本發(fā)明的涇陽鏈霉菌可濕性粉劑的發(fā)病率隨著時(shí)間的推移，發(fā)病率越來越低，至2016年6月發(fā)病率已經(jīng)控制到1%以下；而對(duì)照組在施用的芽孢桿菌可濕性粉劑（香蕉專用）其發(fā)病率沒有得到明顯的控制，還有越來越嚴(yán)重的趨勢，導(dǎo)致種植主在2015年4月私自改變?cè)囼?yàn)方案將所有的土地都用上本發(fā)明的涇陽鏈霉菌可濕性粉劑，才得以明顯的控制住病情。表1涇陽鏈霉菌可濕性粉劑對(duì)香蕉枯萎病的防治效果發(fā)病率/時(shí)間2014年5月2014年12月2015年3月2015年6月2015年12月2016年6月試驗(yàn)組15.8%12.6%10.3%7.4%3.3%0.9%對(duì)照組12.414.4%16.6%15.2%10.1%5.6%當(dāng)前第1頁1 2 3