本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種皺葉青蘚原絲體和配子體無菌快速繁殖方法。

背景技術(shù)：

苔蘚是一類由水生向陸生過渡的高等植物類群，全世界約有21200種，遍布除海洋外的地球上每個(gè)角落，甚至生長于荒漠、凍原及巖石上，耐旱、耐寒、耐貧瘠，適應(yīng)力極強(qiáng)，是大自然的先鋒與拓荒者(Kidron,2014；曹同等，2014)。云南的苔蘚資源尤其豐富，具有全世界約36％的苔蘚品種。對我國多省大型銅礦和金礦生態(tài)環(huán)境破壞嚴(yán)重地區(qū)的植物資源調(diào)查發(fā)現(xiàn)，苔蘚作為先鋒植物在這些維管植物無法存活的地方生長。例如，在云南東川湯丹銅礦分布著青蘚、羽蘚等6科22種苔蘚植物，其中68％是直接生活在布滿銅綠的礦巖石上，另外32％是生活在含氧化銅的礦土上。云南墻蘚等廣泛分布在黔西南紅土型金礦、云南東川拖布卡‐播卡金礦和湯丹銅礦區(qū)(Zhou&Zhang,2007；江洪和張朝暉，2012)，尤其是礦區(qū)的中心區(qū)，破壞最嚴(yán)重的地方，除了零星的苔蘚以外看不到其他植物的生長。

皺葉青蘚(BrachytheciumkuroishicumBesch.)是云南山坡、巖面廣泛分布的一種苔蘚，生境極廣，林下潮濕陰暗和草地陽光充足的地方都能生長。枝葉狹長，可生長至20厘米，具有耐貧瘠、耐高溫、低溫等多種優(yōu)點(diǎn)，生長繁殖周期很短，僅僅1個(gè)半月，與極端抗旱的苔蘚品種山墻蘚或齒肋赤蘚等近一年的生育周期相比具有生產(chǎn)優(yōu)勢。目前對苔蘚的應(yīng)用主要停留于野外的大量挖掘，一方面造成自然環(huán)境的破壞和野生資源的匱乏；另一方面造成品種的混淆，而因?yàn)椴煌贩N的生理差異致使后期繁殖和研究困難。孢子囊僅僅在溫度交替變化時(shí)產(chǎn)生，但敗育率較高。實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的人工繁殖比較困難，目前也未見任何相關(guān)技術(shù)方法的報(bào)道。如果要將皺葉青蘚商業(yè)化生產(chǎn)，組織培養(yǎng)技術(shù)將是推動其規(guī)?；咝Х敝车闹匾夹g(shù)之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種皺葉青蘚無菌快速繁殖方法，包括配子體和孢子囊的消毒、培養(yǎng)、原絲體繼代和擴(kuò)大。目的是為皺葉青蘚工程化生產(chǎn)或研究苔蘚登陸的逆境適應(yīng)性進(jìn)化機(jī)制提供技術(shù)基礎(chǔ)。鑒于皺葉青蘚的自然生長多于夏秋之際，日照、光強(qiáng)和溫度參考自然條件，設(shè)置以下的人工培養(yǎng)參數(shù)。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：

一種皺葉青蘚的快速繁殖方法，該方法包括下述步驟：配子體和孢子囊消毒后，接種于BCD培養(yǎng)基中，在一定的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，然后進(jìn)行原絲體的繼代和擴(kuò)大，記錄生長情況和生物量。

如所述的一種皺葉青蘚的快速繁殖方法，其中所述的配子體和孢子囊消毒是野外采集皺葉青蘚莖葉配子體和孢子囊，無菌水浸泡5小時(shí)，配子體沖洗干凈后剪成1厘米小段，在直徑5厘米的無菌小培養(yǎng)皿中1.5％次氯酸鈉消毒1分鐘，無菌水清洗5遍后打磨粉碎接種于BCD培養(yǎng)基，同時(shí)孢子囊置于1.5ml離心管消毒5分鐘，用鑷子碾碎后接種于BCD培養(yǎng)基。

如所述的一種皺葉青蘚的快速繁殖方法，其中所述的接種是采用勻漿儀進(jìn)行皺葉青蘚的機(jī)械打磨，1g植物材料混合12ml無菌水粉碎后轉(zhuǎn)移2ml接種于6皿培養(yǎng)基，置于16h長日照培養(yǎng)箱，勻漿儀采用10s/次，3次/材料打磨參數(shù)進(jìn)行材料打磨與繼代快繁。

如所述的一種皺葉青蘚的快速繁殖方法，其中培養(yǎng)基設(shè)置用：利用BCD基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為背景培養(yǎng)基，所述BCD基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方為：MgSO₄.7H₂O 1μM，KH₂PO₄ 18.4μM，KNO₃ 10μM，F(xiàn)eSO₄.7H2O 45μM；CuSO₄.5H₂O 0.22μM，H₃BO₃ 10μM，CoCl₂.6H₂O 0.23μM，Na₂MoO₄.2H₂O 0.1μM，ZnSO₄.7H₂O 0.19μM，MnCl₂.4H₂O 2μM，KI 0.17μM，酒石酸銨5mM，瓊脂0.8％，121℃，20min滅菌。平板培養(yǎng)基中添加3％phytogel。

如所述的一種皺葉青蘚的快速繁殖方法，其中所述的培養(yǎng)是待配子體和孢子囊消毒后，配子體接種于BCD培養(yǎng)基，孢子囊用鑷子碾碎后接種于BCD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)過16小時(shí)長日照培養(yǎng)2周，配子體和孢子長出新原絲體后，經(jīng)機(jī)械打磨粉碎后均勻接種于BCD培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)一周得大量繁殖的原絲體，一個(gè)月得成熟配子體。

如所述的一種皺葉青蘚的快速繁殖方法，其中在所述的培養(yǎng)期間設(shè)置三種溫度和光強(qiáng)梯度的培養(yǎng)條件，三種不同溫度梯度為：18℃，23℃，28℃；三種不同光強(qiáng)梯度為：40μmol photons m^-2s^-1，80μmol photons m^-2s^-1，120μmol photons m^-2s^-1。

如所述的一種皺葉青蘚的快速繁殖方法，其中培養(yǎng)期間設(shè)置培養(yǎng)條件為溫度23℃，80μmol photons m^-2s^-1光強(qiáng)。

如所述的一種皺葉青蘚的快速繁殖方法，其中皺葉青蘚原絲體和配子體生長狀態(tài)觀測采用光學(xué)顯微鏡及帶熒光通道的顯微鏡進(jìn)行不同放大倍數(shù)下的原絲體和配子體生長狀態(tài)觀測，并每天拍照記錄，對比分支及生長狀態(tài)。

如所述的一種皺葉青蘚的快速繁殖方法，其中所述的記錄生長情況和生物量采用收集9種培養(yǎng)條件下，每一種不少于5皿材料，測量生物量，用student’s t-test統(tǒng)計(jì)分析。

本發(fā)明的方法也可描述為：野外采集皺葉青蘚莖葉配子體和孢子囊，無菌水浸泡5小時(shí)；配子體沖洗干凈后剪成1厘米小段，在直徑5厘米的無菌小培養(yǎng)皿中次氯酸鈉消毒1分鐘，無菌水清洗5遍后打磨粉碎接種于BCD培養(yǎng)基，同時(shí)孢子囊置于1.5ml離心管消毒5分鐘，用鑷子碾碎后接種于BCD培養(yǎng)基；16小時(shí)長日照培養(yǎng)2周后配子體和孢子長出新原絲體后，經(jīng)機(jī)械打磨粉碎后接種于BCD培養(yǎng)基，這是第二次繼代，培養(yǎng)一周即可得到大量繁殖的原絲體，一個(gè)月得到成熟配子體。第二次繼代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)期間設(shè)置溫度和光強(qiáng)梯度，得到最佳培養(yǎng)條件為溫度23℃，80μmol photons m^-2s^-1光強(qiáng)。三種不同溫度梯度為：18℃，23℃，28℃。三種不同光強(qiáng)梯度為：40μmol photons m^-2s^-1，80μmol photons m^-2s^-1，120μmol photons m^-2s^-1。所用BCD培養(yǎng)基配方為:MgSO₄.7H₂O 1μM，KH₂PO₄ 18.4μM，KNO₃ 10μM，F(xiàn)eSO₄.7H2O 45μM；CuSO₄.5H₂O 0.22μM，H₃BO₃ 10μM，CoCl₂.6H₂O 0.23μM，Na₂MoO₄.2H₂O 0.1μM，ZnSO₄.7H₂O 0.19μM，MnCl₂.4H₂O 2μM，KI 0.17μM，酒石酸銨5mM，瓊脂0.8％，121℃，20min滅菌。平板培養(yǎng)基中添加3％phytogel，代替一般培養(yǎng)基中所用瓊脂粉，以方便顯微觀測。皺葉青蘚快繁材料的培養(yǎng)條件為：23℃，16h光照，8h黑暗，光強(qiáng)80μmol photons m^-2s^-1的培養(yǎng)箱。野外皺葉青蘚消毒所用次氯酸鈉濃度為1.5％。通過培養(yǎng)材料的顯微觀測進(jìn)行配子體復(fù)綠和原絲體生長狀態(tài)的判斷及記錄。本方法的使用可以最適條件的促進(jìn)皺葉青蘚原絲體的分枝及生長，在短時(shí)間內(nèi)獲得最大量的皺葉青蘚原絲體和配子體材料。

附圖說明

圖1為本發(fā)明皺葉青蘚配子體和孢子囊消毒接種生長2周后顯微鏡照片；

圖2為皺葉青蘚各溫度和光強(qiáng)梯度下的生長一周后情況(右下角標(biāo)尺＝100μm)；

圖3為皺葉青蘚各溫度和光強(qiáng)梯度下的生物量測量。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖，用本發(fā)明的實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此來限定本發(fā)明。

實(shí)施例1：

1.材料和方法：

1.1研究材料：

本發(fā)明使用材料為皺葉青蘚(BrachytheciumkuroishicumBesch.)，采集地點(diǎn)是中國云南昆明，具體位置是Alt.1942m，北緯25°8ˊ16〞，東經(jīng)102°44ˊ38〞。

1.2研究方法：

1.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：野外采集皺葉青蘚莖葉配子體和孢子囊，無菌水浸泡5小時(shí)；配子體沖洗干凈后剪成1厘米小段，在直徑5厘米的無菌小培養(yǎng)皿中1.5％次氯酸鈉消毒1分鐘，無菌水清洗5遍后接種于BCD培養(yǎng)基，同時(shí)孢子囊置于1.5ml離心管消毒5分鐘，用鑷子碾碎后接種于BCD培養(yǎng)基；16小時(shí)長日照培養(yǎng)2周后配子體和孢子長出新原絲體后，經(jīng)機(jī)械打磨粉碎后均勻接種于BCD培養(yǎng)基平板，培養(yǎng)一周即可得到大量繁殖的原絲體，一個(gè)月得到成熟配子體。實(shí)驗(yàn)期間設(shè)置溫度和光強(qiáng)梯度，三種不同溫度梯度為：18℃，23℃，28℃；三種不同光強(qiáng)梯度為：40μmol photons m^-2s^-1，80μmol photons m^-2s^-1，120μmol photons m^-2s^-1。最終得到最佳培養(yǎng)條件為溫度23℃，80μmol photons m^-2s^-1光強(qiáng)。記錄每一種培養(yǎng)條件下的生長情況和生物量。

1.2.2原絲體和配子體接種技術(shù)：利用勻漿儀進(jìn)行植物材料的機(jī)械打磨，1g植物材料混合12ml無菌水粉碎后轉(zhuǎn)移2ml接種于6皿培養(yǎng)基，置于16h長日照培養(yǎng)箱，本發(fā)明使用的勻漿儀為：IKA(ULTRA TURRAX Tube Drive)，采用10s/次，3次/材料打磨參數(shù)進(jìn)行材料打磨與繼代快繁。

1.2.3培養(yǎng)基設(shè)置：本發(fā)明利用BCD基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為背景培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基配方為：MgSO₄.7H₂O 1μM，KH₂PO₄ 18.4μM，KNO₃ 10μM，F(xiàn)eSO₄.7H2O 45μM；CuSO₄.5H₂O0.22μM，H₃BO₃ 10μM，CoCl₂.6H₂O 0.23μM，Na₂MoO₄.2H₂O 0.1μM，ZnSO₄.7H₂O 0.19μM，MnCl₂.4H₂O 2μM，KI 0.17μM，酒石酸銨5mM，瓊脂0.8％，121℃，20min滅菌。平板培養(yǎng)基中添加3％phytogel。

1.2.4皺葉青蘚原絲體和配子體生長狀態(tài)觀測：采用光學(xué)顯微鏡及帶熒光通道的顯微鏡進(jìn)行不同放大倍數(shù)下的原絲體和配子體生長狀態(tài)觀測，并每天拍照記錄，對比分支及生長狀態(tài)。本發(fā)明使用的顯微鏡為中國科學(xué)院昆明植物研究所生物技術(shù)平臺熒光顯微鏡，儀器型號：Leica DM5500B。

1.2.5皺葉青蘚原絲體生物量測量統(tǒng)計(jì)：收集9種培養(yǎng)條件下不少于5皿材料，分析天平測量生物量，用student’s t-test統(tǒng)計(jì)分析。

2.結(jié)果與分析

2.1皺葉青蘚配子體和孢子囊消毒接種生長2周后形態(tài)。

皺葉青蘚是單倍體配子體世代占優(yōu)勢的植物，其體細(xì)胞再生能力極強(qiáng)，經(jīng)過植株材料的機(jī)械粉碎后無菌條件下接種培養(yǎng)基可進(jìn)行大量繁殖。同時(shí)孢子囊僅僅在溫度交替變化時(shí)產(chǎn)生，但敗育率較高，也是產(chǎn)生原絲體的原材料。配子體或孢子消毒接種后培養(yǎng)新生植物組織為皺葉青蘚的原絲體形態(tài)，原絲體為在培養(yǎng)基表面匍匐生長，通過不斷地細(xì)胞分枝及細(xì)胞延長獲得生物量的增加。葉綠素在紫外光激發(fā)下產(chǎn)生紅色熒光，是反應(yīng)細(xì)胞活力的指標(biāo)。消毒后的外植體因?yàn)槿~綠素降解，在熒光顯微鏡觀察中顯示非常微弱的紅色熒光，活力旺盛的細(xì)胞具有成熟的葉綠體，顯示強(qiáng)烈的紅色熒光(圖1，白色箭頭指示剛接種的外植體位置)。

2.2皺葉青蘚各溫度和光強(qiáng)梯度下的生長情況

第二次打磨繼代培養(yǎng)期間設(shè)置溫度和光強(qiáng)梯度，培養(yǎng)1周后結(jié)果顯示，9種培養(yǎng)條件下都檢測到原絲體大量繁殖，而置于23℃，光強(qiáng)80μmol photons m^-2s^-1的培養(yǎng)箱中時(shí)，皺葉青蘚原絲體生長最旺盛，18℃，光強(qiáng)40μmol photons m^-2s^-1的培養(yǎng)條件下生長最慢(圖2)。說明皺葉青蘚適應(yīng)的溫度和光照強(qiáng)度范圍較廣，但是更喜歡較高的溫度和光強(qiáng)度。

2.3皺葉青蘚各溫度和光強(qiáng)梯度下的生物量測量

統(tǒng)計(jì)分析9種培養(yǎng)條件下一周生長的生物量，結(jié)果與圖2顯示一致。23℃，光強(qiáng)80μmol photons m^-2s^-1培養(yǎng)皺葉青蘚原絲體生長最快，18℃，光強(qiáng)40μmol photons m^-2s^-1的培養(yǎng)條件下生長最慢。橫坐標(biāo)顯示光強(qiáng)，縱坐標(biāo)顯示生物量，單位為毫克。星號顯示同一光強(qiáng)度下數(shù)值與18℃的生物量比較時(shí)t-test檢測在p<0.01水平上的顯著性差異；數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n≧5(圖3)。