本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種基于中型土壤動(dòng)物多代觀測的轉(zhuǎn)基因作物風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)方法。
背景技術(shù)：
中型土壤動(dòng)物是指體寬在0.2mm-2mm的終生或部分生活史生活在土壤中的動(dòng)物。中型土壤動(dòng)物與土壤微生物、大型土壤動(dòng)物關(guān)系密切，在分解植物凋落物，提高土壤肥力，地下生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)與能量流動(dòng)方面具有重要影響。以往關(guān)于轉(zhuǎn)基因作物凋落物的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)主要以其對土壤動(dòng)物單一世代存活率和繁殖率的影響為指標(biāo)；然而中型土壤動(dòng)物一個(gè)世代周期是一個(gè)月左右，轉(zhuǎn)基因作物種植一個(gè)生長季，土壤動(dòng)物可進(jìn)行多代繁殖，因此需要關(guān)注土壤動(dòng)物連續(xù)多代對轉(zhuǎn)基因作物凋落物的響應(yīng)；另一方面，以土壤動(dòng)物存活率和繁殖率為指標(biāo)，僅僅反映了土壤動(dòng)物種群數(shù)量對轉(zhuǎn)基因作物的響應(yīng)，并未考慮土壤動(dòng)物自身生理狀態(tài)對轉(zhuǎn)基因作物的響應(yīng)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種基于中型土壤動(dòng)物多代觀測的轉(zhuǎn)基因作物風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)方法。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的基于中型土壤動(dòng)物多代觀測的轉(zhuǎn)基因作物風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)方法，在添加有轉(zhuǎn)基因作物凋落物的培養(yǎng)基中飼養(yǎng)中型土壤動(dòng)物，通過多代連續(xù)觀測，統(tǒng)計(jì)土壤動(dòng)物不同代際間的存活率、繁殖率、體長等，并對土壤動(dòng)物功能酶進(jìn)行檢測，綜合評價(jià)轉(zhuǎn)基因作物對連續(xù)多代土壤動(dòng)物種群適合度的影響。
其中，所述培養(yǎng)基是由經(jīng)滅菌處理的石膏粉和活性炭按體積比9:5混合，所得混合粉與無菌水按等體積混合制得，飼養(yǎng)盒或培養(yǎng)皿中鋪設(shè)厚度約2cm。活性炭的作用是吸收土壤動(dòng)物排泄物，石膏的作用是使培養(yǎng)基穩(wěn)定，該配方與石膏粉和活性炭按體積比9:1混合所得培養(yǎng)基相比，可以承受更多的土壤動(dòng)物排泄物，從而完成多代連續(xù)觀測。
前述的方法，還包括設(shè)立非轉(zhuǎn)基因作物對照的步驟，所述轉(zhuǎn)基因作物和非轉(zhuǎn)基因作物的種植地、種植條件以及種植時(shí)間和收割時(shí)間相同。
在作物成熟后期，取轉(zhuǎn)基因作物凋落物，去除葉柄后，破碎，得到凋落物粉末，經(jīng)紫外線照射滅菌后，按4g/m2添加到培養(yǎng)基中。滅菌條件為：紫外線光源與凋落物粉末的垂直距離為50cm，照射強(qiáng)度90μW/cm2，照射時(shí)間2h。對轉(zhuǎn)基因作物及其對照的凋落物進(jìn)行滅菌處理，以排除凋落物中微生物對土壤動(dòng)物評估的影響。
土壤動(dòng)物培養(yǎng)采用ISO標(biāo)準(zhǔn)方法--ISO 11267:1999(E)。單一土壤動(dòng)物在培養(yǎng)后需同步化，將三天內(nèi)產(chǎn)的卵收集到一起，卵孵化成幼蟲后的第12天，將幼蟲接入添加有轉(zhuǎn)基因作物凋落物的培養(yǎng)基中。
按約2000頭/m2向添加有轉(zhuǎn)基因作物凋落物的培養(yǎng)基中接入單一類群、同日齡的所述中型土壤動(dòng)物，以啤酒酵母作為食物，采用黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20±1℃，相對濕度為90％-100％，每周至少用無菌水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基一次，保持培養(yǎng)基濕潤。
每兩天更換一次食物，同時(shí)將培養(yǎng)基中殘余的凋落物粉末清理干凈，重新加入凋落物粉末，并加入適量無菌水。優(yōu)選水的用量為200mL水/m2。
前述的方法，在培養(yǎng)的第10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天和90天分別采樣，利用體視鏡進(jìn)行人工計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)所述土壤動(dòng)物的活體成蟲數(shù)量、幼蟲數(shù)量、卵粒數(shù)量，計(jì)算存活率、單一世代和多世代繁殖率，培養(yǎng)60天后，隨機(jī)取樣，測量成蟲及幼蟲的體長，評估轉(zhuǎn)基因作物對連續(xù)多代土壤動(dòng)物種群適合度的影響。
培養(yǎng)開始后第n天，土壤動(dòng)物存活率的計(jì)算公式為：存活率＝Pn/P0
其中，Pn表示培養(yǎng)開始后第n天，白符跳成體存活個(gè)體數(shù)，P0表示原始接入成體頭數(shù)。
培養(yǎng)開始后第n′天(土壤動(dòng)物已完成繁殖并且幼蟲已孵化出來)，土壤動(dòng)物單一世代繁殖率的計(jì)算公式為：繁殖率＝(Pn′-P0)/P0
其中，Pn′表示培養(yǎng)開始后第n′天的總個(gè)體數(shù)(包括活體與死體)，P0表示原始接入成體頭數(shù)。
在培養(yǎng)的第85-95天(優(yōu)選90天)，對土壤動(dòng)物功能酶進(jìn)行檢測；所述功能酶包括乙酰膽堿酯酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等中的至少一種。
本發(fā)明所述中型土壤動(dòng)物包括線蟲、蟎、彈尾類、原尾類和燭，優(yōu)選白符跳。
本發(fā)明還提供一種用于轉(zhuǎn)基因作物風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)的土壤動(dòng)物培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基是由經(jīng)滅菌處理的石膏粉和活性炭按體積比9:5混合，所得混合粉與無菌水按等體積混合制得。
本發(fā)明提供一種基于中型土壤動(dòng)物連續(xù)多代觀測的方法，研究其種群數(shù)量以及土壤動(dòng)物體內(nèi)功能酶對轉(zhuǎn)基因作物凋落物的響應(yīng)，綜合評價(jià)轉(zhuǎn)基因作物對中型土壤動(dòng)物影響的風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
(一)通過對土壤動(dòng)物培養(yǎng)基配方進(jìn)行改良，使之更適應(yīng)轉(zhuǎn)基因作物對土壤動(dòng)物的多代連續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)結(jié)合實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化方法喂飼土壤動(dòng)物。
(二)提供了評價(jià)中型土壤動(dòng)物連續(xù)多代對轉(zhuǎn)基因作物凋落物響應(yīng)的方法，考慮到土壤動(dòng)物對轉(zhuǎn)基因作物凋落物影響的累積效應(yīng)，盡可能接近自然狀態(tài)。
(三)本發(fā)明通過監(jiān)測土壤動(dòng)物自身功能酶中乙酰膽堿酯酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等對轉(zhuǎn)基因作物凋落物響應(yīng)，結(jié)合土壤動(dòng)物死亡率和繁殖率等參數(shù)，綜合反映土壤動(dòng)物對轉(zhuǎn)基因作物的響應(yīng)。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。本發(fā)明中各步操作均在無菌條件下進(jìn)行。
以下實(shí)施例中使用的轉(zhuǎn)基因作物為轉(zhuǎn)基因玉米Bt-799、對照為鄭58，種子由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)提供；實(shí)施例2中，使用的轉(zhuǎn)基因作物為轉(zhuǎn)基因玉米IE09S034、對照為綜31，種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。
以下實(shí)施例中所用單一土壤動(dòng)物為實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化土壤動(dòng)物白符跳，F(xiàn)CDK系列，采自“國家轉(zhuǎn)基因玉米、大豆中試與產(chǎn)業(yè)化基地(公主嶺)”。
實(shí)施例1基于中型土壤動(dòng)物多代觀測的轉(zhuǎn)基因作物風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)方法
包括以下步驟：
1、土壤動(dòng)物培養(yǎng)基配制：將石膏粉和活性炭培養(yǎng)基按體積比9:5混合，石膏和活性炭混合粉與水體積比為1:1充分混勻攪拌，放在培養(yǎng)皿中約2cm，震蕩平后放置待干，作為實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基。同時(shí)，設(shè)立對照組，對照組培養(yǎng)基為石膏粉和活性炭按體積比9:1混合，所得混合粉與無菌水按等體積混合制得。
2、轉(zhuǎn)基因玉米Bt-799和對照鄭58凋落物處理：在作物成熟后期，取轉(zhuǎn)基因和對照作物凋落物各1000g，去除葉柄后，剪成長×寬＝1cm×1cm小塊，植物組織粉碎機(jī)破碎后，用紫外燈照射2小時(shí)保存待用。紫外線光源與凋落物粉末的垂直距離為50cm，照射強(qiáng)度90μW/cm2。
3、土壤動(dòng)物培養(yǎng)：白符跳實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)，在石膏:活性炭＝9:1的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，添加啤酒酵母作為食物，全黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20±1℃，相對濕度接近100％，每周用去離子水調(diào)節(jié)一次，保持整個(gè)培養(yǎng)基濕潤。同步化時(shí)需將三天內(nèi)產(chǎn)的卵收集到一起，于12日齡可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
4、作物凋落物添加及土壤動(dòng)物接種：首先，取步驟2中0.02g轉(zhuǎn)基因或?qū)φ盏蚵湮锶~片，放入步驟1中所制備的培養(yǎng)基中(按4g/m2添加)，接入步驟3中培養(yǎng)的土壤動(dòng)物10頭(按約2000頭/m2接種)，每個(gè)凋落物處理設(shè)置10個(gè)重復(fù)，每兩天進(jìn)行一次食物更新，將培養(yǎng)盒內(nèi)剩余的葉片粉末清理干凈，重新添加0.02g葉片粉末并加入1ml蒸餾水，喂飼實(shí)驗(yàn)環(huán)境同步驟3中實(shí)驗(yàn)環(huán)境。
5、取樣及分析：標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)的第10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天和90天后進(jìn)行采樣，利用體視鏡進(jìn)行人工計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)各培養(yǎng)容器內(nèi)白符跳的活體成蟲數(shù)量、幼蟲數(shù)量、卵粒數(shù)量，計(jì)算存活率、單一世代和多世代繁殖率，評估轉(zhuǎn)基因作物種植對單一土壤動(dòng)物類群的適合度影響；標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)60天后，每個(gè)培養(yǎng)盒中隨機(jī)測量3頭白符跳成蟲及幼蟲的體長；實(shí)驗(yàn)開始后第90天搜集各培養(yǎng)容器內(nèi)白符跳，同一個(gè)處理集中到一起，分為5個(gè)重復(fù)，利用酶標(biāo)儀測定乙酰膽堿酯酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶。
培養(yǎng)開始后第n天，土壤動(dòng)物存活率的計(jì)算公式為：存活率＝Pn/P0
其中，Pn表示培養(yǎng)開始后第n天，白符跳成體存活個(gè)體數(shù)，P0表示原始接入成體頭數(shù)(10頭)。
培養(yǎng)開始后第n′天(土壤動(dòng)物已完成繁殖并且幼蟲已孵化出來)，土壤動(dòng)物單一世代繁殖率的計(jì)算公式為：繁殖率＝(Pn′-P0)/P0
其中，Pn′表示培養(yǎng)開始后第n′天的總個(gè)體數(shù)(包括活體與死體)，P0表示原始接入成體頭數(shù)。
土壤動(dòng)物存活率及繁殖率計(jì)算結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，無論是對照組培養(yǎng)基還是實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)取樣第10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天和90天后，Bt-799和鄭58中白符跳存活率無顯著影響；實(shí)驗(yàn)取樣第40天、50天、60天、70天、80天和90天后，Bt-799和鄭58中白符跳繁殖率無顯著影響。
與對照培養(yǎng)基相比，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基在第10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天和90天后，存活率提高了3％-73％，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)間越久，提高的效果越明顯。
與對照培養(yǎng)基相比，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基在第40天、50天、60天、70天、80天和90天后，繁殖率提高了18％-81％，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)間越久，提高的效果越明顯。
表1轉(zhuǎn)基因玉米Bt-799和對照鄭58中跳蟲存活率和繁殖率(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)
注：不同小寫字母表示顯著影響。
體長及功能酶數(shù)據(jù)見表2，結(jié)果顯示，無論是對照組培養(yǎng)基還是實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中，Bt-799和鄭58中白符跳體長和功能酶(乙酰膽堿酯酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶)均無顯著影響。
與對照培養(yǎng)基相比，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基成蟲和幼蟲分別增加了17.8％和26％(Bt-799和鄭58均值)，說明本發(fā)明培養(yǎng)基促進(jìn)了白符跳成蟲和幼蟲的生長；乙酰膽堿酯酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶含量降低了15.2％、12.9％和22.1％，說明本發(fā)明培養(yǎng)基改善了白符跳生活環(huán)境，降低了跳蟲的應(yīng)激反應(yīng)。
表2轉(zhuǎn)基因玉米Bt-799和對照鄭58中跳蟲體長和功能酶(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)
注：不同小寫字母表示顯著影響。
實(shí)施例2基于中型土壤動(dòng)物多代觀測的轉(zhuǎn)基因作物風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)方法
包括以下步驟：
1、土壤動(dòng)物培養(yǎng)基配制：將石膏粉和活性炭培養(yǎng)基按體積比9:5混合，石膏和活性炭混合粉與水體積比為1:1充分混勻攪拌，放在培養(yǎng)皿中約2cm，震蕩平后放置待干，作為實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基。同時(shí)，設(shè)立對照組，對照組培養(yǎng)基為石膏粉和活性炭按體積比9:1混合，所得混合粉與無菌水按等體積混合制得。
2、轉(zhuǎn)基因玉米IE09S034和對照綜31凋落物處理：在作物成熟后期，取轉(zhuǎn)基因和對照作物凋落物各1000g，去除葉柄后，剪成長×寬＝1cm×1cm小塊，植物組織粉碎機(jī)破碎后，用紫外燈照射2小時(shí)保存待用。紫外線光源與凋落物粉末的垂直距離為50cm，照射強(qiáng)度90μW/cm2。
3、土壤動(dòng)物培養(yǎng)：白符跳實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化培養(yǎng)，在石膏:活性炭＝9:1的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，添加啤酒酵母作為食物，全黑暗培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為20±1℃，相對濕度接近100％，每周用去離子水調(diào)節(jié)一次，保持整個(gè)培養(yǎng)基濕潤。同步化時(shí)需將三天內(nèi)產(chǎn)的卵收集到一起，于12日齡可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
4、作物凋落物添加及土壤動(dòng)物接種：首先，取步驟2中0.02g轉(zhuǎn)基因或?qū)φ盏蚵湮锶~片，放入步驟1中所制備的培養(yǎng)基中(按4g/m2添加)，接入步驟3中培養(yǎng)的土壤動(dòng)物10頭(按約2000頭/m2接種)，每個(gè)凋落物處理設(shè)置10個(gè)重復(fù)，每兩天進(jìn)行一次食物更新，將培養(yǎng)盒內(nèi)剩余的葉片粉末清理干凈，重新添加0.02g葉片粉末并加入1ml蒸餾水，喂飼實(shí)驗(yàn)環(huán)境同步驟3中實(shí)驗(yàn)環(huán)境。
5、取樣及分析：標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)的第10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天和90天后進(jìn)行采樣，利用體視鏡進(jìn)行人工計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)各培養(yǎng)容器內(nèi)白符跳的活體成蟲數(shù)量、幼蟲數(shù)量、卵粒數(shù)量，計(jì)算存活率、單一世代和多世代繁殖率，評估轉(zhuǎn)基因作物種植對單一土壤動(dòng)物類群的適合度影響；標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)60天后，每個(gè)培養(yǎng)盒中隨機(jī)測量3頭白符跳成蟲及幼蟲的體長；實(shí)驗(yàn)開始后第90天搜集各培養(yǎng)容器內(nèi)白符跳，同一個(gè)處理集中到一起，分為5個(gè)重復(fù)，利用酶標(biāo)儀測定乙酰膽堿酯酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶。
土壤動(dòng)物存活率及繁殖率的計(jì)算公式同實(shí)施例1。
土壤動(dòng)物存活率及繁殖率計(jì)算結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，無論是對照組培養(yǎng)基還是實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)取樣第10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天和90天后，Bt-799和鄭58中白符跳存活率無顯著影響；實(shí)驗(yàn)取樣第40天、50天、60天、70天、80天和90天后，IE09S034和綜31中白符跳繁殖率無顯著影響。
與對照培養(yǎng)基相比，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基在第10天、20天、30天、40天、50天、60天、70天、80天和90天后，存活率提高了10.7％-78％，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)間越久，提高的效果越明顯。
與對照培養(yǎng)基相比，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基在第40天、50天、60天、70天、80天和90天后，繁殖率提高了2.5％-56％，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行時(shí)間越久，提高的效果越明顯。
表3轉(zhuǎn)基因玉米IE09S034和對照綜31中跳蟲存活率和繁殖率(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)
注：不同小寫字母表示顯著影響。
體長及功能酶數(shù)據(jù)見表4，結(jié)果顯示，無論是對照組培養(yǎng)基還是實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基中，IE09S034和綜31中白符跳體長和自身功能酶(乙酰膽堿酯酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶)均無顯著影響。
與對照培養(yǎng)基相比，實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基成蟲和幼蟲分別增加了12.1％和27.2％(Bt-799和鄭58均值)，說明本發(fā)明培養(yǎng)基增加了白符跳的體長，有助于白符跳成蟲和幼蟲的生長；乙酰膽堿酯酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶含量降低了33.9％、14.4％和25.1％，說明本發(fā)明培養(yǎng)基改善了白符跳生存環(huán)境，降低了白符跳的應(yīng)激反應(yīng)。
表4轉(zhuǎn)基因玉米IE09S034和對照綜31中跳蟲體長和功能酶(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)
雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。