本發(fā)明涉及植物分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種基于EESI-MS及多變量統(tǒng)計技術(shù)對馬鈴薯微型種薯進(jìn)行活性鑒定的方法。

背景技術(shù)：

馬鈴薯在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整中占有重要地位，尤其在西北干旱、半干旱地區(qū)和西南高寒山區(qū)，馬鈴薯不僅是主要的糧食作物，而且是重要的經(jīng)濟(jì)作物，在促進(jìn)農(nóng)民增收和區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展中發(fā)揮著不可低估的重要作用。自世紀(jì)八十年代以來，隨著我國經(jīng)濟(jì)的改革開放，馬鈴薯生產(chǎn)有了較大的發(fā)展。種植面積己從1982年245萬hm²發(fā)展到2012年870萬hm²，總產(chǎn)量由2383萬噸增加到7500萬噸，單產(chǎn)由9.7噸/hm²提高到16噸/hm²，分別增長了91.8％、214.7％和64.9％，總產(chǎn)值為600億元以上。但是，目前我國馬鈴薯單產(chǎn)水平仍然較低，每公頃產(chǎn)量僅為16噸，與世界平均單產(chǎn)水平有較大差距，與先進(jìn)水平的荷蘭43噸、德國40噸、美國39噸、澳大利亞39噸相差更大。造成產(chǎn)量低的原因，除栽培技術(shù)粗放外，主要是種薯質(zhì)量低的問題。

微型種薯是由植物莖尖分生組織培養(yǎng)、病毒檢測和試管苗工廠化擴(kuò)繁等生物技術(shù)方法培育的脫毒試管苗，通過工廠化切段快繁和在防蚜溫室或網(wǎng)棚中無土栽培繁殖，獲得的微型脫毒小薯。微型種薯具有下列顯著的性能和特點：1)品種純度高：品種純度達(dá)到100％；2)無毒無?。何⑿头N薯不帶任何病毒和真、細(xì)菌病害；3)貯運性能好：體積小易于貯藏運輸，可大幅度降低調(diào)種成本；4)增產(chǎn)幅度大：生產(chǎn)上一般增產(chǎn)幅度可達(dá)50％-200％；5)持續(xù)增產(chǎn)性強(qiáng)：在良好的栽培和管理條件下，可連續(xù)4年保持增產(chǎn)增收效益：6)用種量?。何⑿头N薯千粒重僅為2-5kg，每畝用種量8-10kg，不足普通種薯的1/10；7)易于栽培：種薯大小整齊一致，易于機(jī)械化栽培管理：8)市場反應(yīng)快：能在較短的時間內(nèi)對市場需求的品種進(jìn)行大量繁殖。

種薯活性即種薯的健壯度，是種薯發(fā)芽和出苗率、幼苗生長的潛勢、植株抗逆能力和生產(chǎn)潛力的總和，是衡量種薯質(zhì)量的重要指標(biāo)，也是種薯生產(chǎn)和經(jīng)營必須重視的主要內(nèi)容，如何提高種薯質(zhì)量一直是種子研究和生產(chǎn)者關(guān)注的重點。

目前，針對馬鈴薯種薯活性鑒定方面，還未見很好的質(zhì)譜分析方法；其他經(jīng)濟(jì)作物的種子活性鑒定最常見的方法為電導(dǎo)率法。該方法基于的原理為：種子在水中浸泡后，種子內(nèi)可溶性物質(zhì)或電解質(zhì)水通過細(xì)胞膜外滲，而在老化種子中，營養(yǎng)物外滲是電導(dǎo)率法測定種子活性的基礎(chǔ)；電導(dǎo)率測試因為它能夠通過確定種子浸泡液中釋放的電解質(zhì)的數(shù)量間接地評價細(xì)胞膜的退化程度。但有試驗表明，電導(dǎo)率法難以準(zhǔn)確檢測活性太低的種子，只能通過釋放的電解質(zhì)的數(shù)量來間接評價種子活性，且結(jié)果受環(huán)境影響較大。

電噴霧萃取電離質(zhì)譜法(Eextractive electrospray ionization-mass spectrometry，EESI-MS)是一種新興的離子化技術(shù)，可在無需樣品預(yù)處理的條件下對復(fù)雜基體樣品進(jìn)行直接質(zhì)譜分析。已用于蓮子中生物堿、人參中人參皂苷以及大蒜等的快速分析。EESI-MS具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點，能夠在1min內(nèi)檢測完單個樣品用于快速質(zhì)譜分析，直接獲得有關(guān)物質(zhì)的化學(xué)成分信息，從而達(dá)到快速、準(zhǔn)確檢測種子活性的目的。

因此，本發(fā)明基于電噴霧萃取電離質(zhì)譜法對馬鈴薯微型種薯的活性進(jìn)行鑒定，以期建立一種市面上還未出現(xiàn)的快速、準(zhǔn)確檢測馬鈴薯微型種薯活性的新方法，為馬鈴薯微型種薯的貯藏及種薯資源的研究與利用提供幫助。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中所存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種新型的基于EESI-MS及多變量統(tǒng)計技術(shù)對馬鈴薯微型種薯進(jìn)行活性鑒定的方法，建立一種快速、準(zhǔn)確檢測馬鈴薯微型種薯活性的新方法。

本發(fā)明提供一種基于EESI-MS及多變量統(tǒng)計技術(shù)對馬鈴薯微型種薯進(jìn)行活性鑒定的方法，包括如下步驟：

步驟一、對待測馬鈴薯微型種薯樣品進(jìn)行人工老化加速處理；

步驟二、將經(jīng)老化加速處理后的馬鈴薯微型種薯進(jìn)行發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)試驗，并計算發(fā)芽指數(shù)及活性指數(shù)；

步驟三、隨機(jī)抽樣選取老化加速處理后的馬鈴薯微型種薯進(jìn)行提取液的制備，獲取上清液；

步驟四、對馬鈴薯微型種薯提取液的上清液進(jìn)行電噴霧萃取電離質(zhì)譜分析，并結(jié)合變量分析方法對不同活性指數(shù)的馬鈴薯微型種薯進(jìn)行鑒定：

電噴霧萃取電離質(zhì)譜分析條件為：工作模式為正離子檢測模式，質(zhì)譜的掃描范圍均設(shè)置為200-1000m/z；電離的電壓為3.0-6.5kV；毛細(xì)管的溫度均為150-180℃；電噴霧的溶劑均為甲醇；噴霧為壓力為1.5MPa的氮氣；電噴霧溶劑和樣品上清液流速分別為6μL/min和8.5μL/min。

在本發(fā)明提供的所述基于EESI-MS及多變量統(tǒng)計技術(shù)對馬鈴薯微型種薯進(jìn)行活性鑒定的方法一較佳實施例中，所述步驟一具體為：將待測馬鈴薯微型種薯樣品分組篩選，將各組樣品分別放置在種子老化箱內(nèi)進(jìn)行老化加速處理；箱內(nèi)溫度為45℃、相對濕度100％，老化時間分別為0、1、2、3、5、7、9d。

在本發(fā)明提供的所述基于EESI-MS及多變量統(tǒng)計技術(shù)對馬鈴薯微型種薯進(jìn)行活性鑒定的方法一較佳實施例中，所述步驟一中，經(jīng)老化加速處理后的馬鈴薯微型種薯樣品在室溫條件下陰涼處晾4-7d至含水量降到原始狀態(tài)。

在本發(fā)明提供的所述基于EESI-MS及多變量統(tǒng)計技術(shù)對馬鈴薯微型種薯進(jìn)行活性鑒定的方法一較佳實施例中，所述步驟二具體為：將經(jīng)老化加速處理后的馬鈴薯微型種薯在人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)芽，發(fā)芽床為12cm培養(yǎng)皿加雙層濾紙，用水濕潤，箱內(nèi)溫度為25℃，且24h全黑暗；統(tǒng)計第21d的發(fā)芽率、芽鮮重及芽干重；

活性指數(shù)(VI)按下式計算：VI＝GT*SX

其中GT為在第21d時的發(fā)芽率，SX為在第21d時的平均芽干重。

在本發(fā)明提供的所述基于EESI-MS及多變量統(tǒng)計技術(shù)對馬鈴薯微型種薯進(jìn)行活性鑒定的方法一較佳實施例中，所述步驟二中芽干重采用高恒溫烘箱法測定，130℃烘至恒重，測定芽干重值。

在本發(fā)明提供的所述基于EESI-MS及多變量統(tǒng)計技術(shù)對馬鈴薯微型種薯進(jìn)行活性鑒定的方法一較佳實施例中，所述步驟三具體為：將經(jīng)老化加速處理后的馬鈴薯微型種薯去皮，冰凍研磨后15ml預(yù)冷甲醇浸提12h，4℃6000r/min離心10min，收集上清液，沉淀物用15ml預(yù)冷甲醇再浸提12h后4℃6000r/min再離心10min收集合并上清液，提取上清液再經(jīng)過0.45μm超微濾膜后，直接進(jìn)行質(zhì)譜分析。

在本發(fā)明提供的所述基于EESI-MS及多變量統(tǒng)計技術(shù)對馬鈴薯微型種薯進(jìn)行活性鑒定的方法一較佳實施例中，所述步驟四中，采用線性離子阱質(zhì)譜儀進(jìn)行電噴霧萃取電離質(zhì)譜分析，其中，兩個毛細(xì)管噴霧口距離為1.5mm，夾角為65°，樣品到質(zhì)譜進(jìn)樣口的距離為5mm，角度為150°。

相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的所述基于EESI-MS及多變量統(tǒng)計技術(shù)對馬鈴薯微型種薯進(jìn)行活性鑒定的方法的有益效果在于：通過對不同活性的馬鈴薯微型種薯提取液進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)合變量分析方法對不同活性指數(shù)的馬鈴薯微型種薯進(jìn)行鑒定，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點。此外，基于馬鈴薯種薯的老化機(jī)制，采用電噴霧萃取電離質(zhì)譜分析技術(shù)，在無需復(fù)雜樣品預(yù)處理前提下，對不同老化時間的馬鈴薯微型種薯的提取液進(jìn)行直接質(zhì)譜分析，獲得其正離子模式下指紋圖譜，并結(jié)合主成分分析中三個主成分因子，累計貢獻(xiàn)率達(dá)到91.70％，可以將不同活性的馬鈴薯微型種薯有效區(qū)分開。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖，其中：

圖1為本發(fā)明方法中不同老化天數(shù)馬鈴薯微型種薯提取液的電噴霧萃取電離質(zhì)譜圖；

圖2為本發(fā)明方法中不同老化天數(shù)馬鈴薯微型種薯提取液的電噴霧萃取電離質(zhì)譜數(shù)據(jù)主成分分析的得分圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅是本發(fā)明的一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明采用的待測樣品為馬鈴薯微型種薯，2016年收獲，甘肅省定西市旱作農(nóng)業(yè)科研推廣中心生產(chǎn)提供，采用無土栽培方式生產(chǎn),在日光溫室中將組培脫毒苗栽植到蛭石中培育微型種薯。

本發(fā)明采用的儀器、試劑及材料為：線性離子阱質(zhì)譜儀(美國Finnigan公司LTQ-XL型)，配有LTQ Xcalibur 2.0軟件處理系統(tǒng)(美國Finnigan公司)；EESI離子源(東華理工大學(xué)研制)；種子老化試驗箱(浙江托普儀器有限公司LH-150S型)；人工氣候箱(寧波東南儀器有限公司GXZ-380B型)；高恒溫烘箱(蘇州豪威樂烘箱設(shè)備有限公司HWL-101型)；甲醇(色譜純，美國Dikmapure公司)。實驗室用水為超純水，其它試劑均為分析純。

本發(fā)明提供一種基于電噴霧萃取電離質(zhì)譜技術(shù)對馬鈴薯微型種薯進(jìn)行活性鑒定的方法，包括如下步驟：

步驟一、對待測馬鈴薯微型種薯樣品進(jìn)行人工老化加速處理：

具體為將待測馬鈴薯微型種薯樣品依據(jù)體積大小、飽滿度等相似特征進(jìn)行分組篩選，將各組樣品分別放置在種子老化箱內(nèi)進(jìn)行老化加速處理；箱內(nèi)溫度為45℃、相對濕度100％，老化時間分別為0、1、2、3、5、7、9d。經(jīng)老化加速處理后的馬鈴薯微型種薯樣品在室溫25℃條件下置于陰涼處，晾4-7d至含水量降到原始狀態(tài)，保存并待用于發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)試驗及質(zhì)譜分析。

步驟二、將經(jīng)老化加速處理后的馬鈴薯微型種薯進(jìn)行發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)試驗，并計算發(fā)芽指數(shù)及活性指數(shù)：

具體為將經(jīng)老化加速處理后的馬鈴薯微型種薯在人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)芽，發(fā)芽床為12cm培養(yǎng)皿加雙層濾紙，用水濕潤，箱內(nèi)溫度為25℃，且24h全黑暗；統(tǒng)計第21d的發(fā)芽率、芽鮮重及芽干重，芽干重采用高恒溫烘箱法測定，130℃烘至恒重，測定芽干重值；并計算活性指數(shù)VI；

活性指數(shù)(VI)按下式計算：VI＝GT*SX

其中，GT為在第21d時的發(fā)芽率，SX為在第21d時的平均芽干重。

步驟三、隨機(jī)抽樣選取老化加速處理后的馬鈴薯微型種薯進(jìn)行提取液的制備，獲取上清液；

具體為將經(jīng)老化加速處理后的馬鈴薯微型種薯去皮，冰凍研磨后15ml預(yù)冷甲醇浸提12h，4℃6000r/min離心10min，收集上清液，沉淀物用15ml預(yù)冷甲醇再浸提12h后4℃6000r/min再離心10min收集合并上清液，提取上清液再經(jīng)過0.45μm超微濾膜后，直接進(jìn)行質(zhì)譜分析；每組樣品平行檢測六次。

步驟四、對馬鈴薯微型種薯提取液的上清液進(jìn)行電噴霧萃取電離質(zhì)譜分析，并結(jié)合變量分析方法對不同活性指數(shù)的馬鈴薯微型種薯進(jìn)行鑒定：

電噴霧萃取電離質(zhì)譜分析條件為：工作模式為正離子檢測模式，質(zhì)譜的掃描范圍均設(shè)置為200-1000m/z；電離的電壓為3.0-6.5kV，優(yōu)選4.5kV；毛細(xì)管的溫度均為150-180℃，優(yōu)選178℃；電噴霧的溶劑均為甲醇；噴霧為壓力為1.5MPa的氮氣；電噴霧溶劑和樣品上清液流速分別為6μL/min和8.5μL/min；其中，兩個毛細(xì)管噴霧口距離為1.5mm，夾角為65°，樣品到質(zhì)譜進(jìn)樣口的距離為5mm，角度為150°；其他參數(shù)由LTQ Xcalibur軟件系統(tǒng)自動優(yōu)化。

結(jié)果分析：

1)不同老化天數(shù)的馬鈴薯微型種薯發(fā)芽情況和種薯活性指數(shù)變化如表1所示?？梢钥闯?，未老化馬鈴薯微型種薯的發(fā)芽率和活性指數(shù)與老化1d后的馬鈴薯微型種薯之間的差異不明顯(P>0.05)，隨老化時間的延長，馬鈴薯微型種薯的活性指標(biāo)均呈下降趨勢，老化至第9d時，其發(fā)芽率和活性指數(shù)都為0，與未老化的馬鈴薯微型種薯之間差異極顯著(P<0.01)。未老化馬鈴薯微型種薯與老化1d至2d的發(fā)芽率間沒有顯著差異性(P>0.01)，但其他活性指標(biāo)間逐漸出現(xiàn)顯著性差異(P<0.01)，原因可能是前期老化處理時間較短，對馬鈴薯微型種薯造成的輕微損傷不足以導(dǎo)致發(fā)芽率發(fā)生明顯變化，但經(jīng)統(tǒng)計分析，其他指標(biāo)間是存在顯著性差異的(P<0.01)。出現(xiàn)老化5d與7d間發(fā)芽率差距較大，在老化5d后發(fā)芽率開始出現(xiàn)明顯的下降，活性下降幅度明顯。通過對各活性指標(biāo)與老化時間的相關(guān)性分析可以得出，馬鈴薯微型種薯的活性指標(biāo)(發(fā)芽率及活性指數(shù))與老化時間都呈極顯著負(fù)相關(guān)。表明不同的人工老化天數(shù)對于馬鈴薯微型種薯形成不同的活性水平有重要影響。

表1不同老化天數(shù)后馬鈴薯微型種薯的發(fā)芽率和活性指數(shù)

2)不同老化天數(shù)的馬鈴薯微型種薯提取液的電噴霧萃取電離質(zhì)譜圖如圖1所示?？梢钥闯?，隨著馬鈴薯微型種薯老化處理時間的增加，解析出來的物質(zhì)也逐漸增多，且相對豐度也逐漸增加。所有馬鈴薯微型種薯樣品的指紋圖譜中均存在信號峰m/z 157，279，317，518及755，且m/z 157和279均是最強(qiáng)的，m/z 473在老化0和1d的樣品中信號強(qiáng)度相差不大，在老化2d和3d的樣品中信號強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，但在老化5d、7d和9d的樣品中信號強(qiáng)度又明顯下降。分析原因為在人工加速老化處理過程中，一些揮發(fā)性化合物很快就揮發(fā)了，另一些則保持不變，隨著老化處理時間延長，易揮發(fā)的物質(zhì)逐漸減少，所以利用EESI-MS技術(shù)得到不同活性馬鈴薯微型種薯的指紋圖譜中，有很多信號峰存在于所有圖譜中，一些信號峰的豐度保持不變，而另一些信號峰則在老化處理過程中先迅速增強(qiáng)后又緩慢下降。

3)不同老化天數(shù)馬鈴薯微型種薯提取液的電噴霧萃取電離質(zhì)譜數(shù)據(jù)主成分分析如圖2所示。將不同老化時間的馬鈴薯微型種薯樣品提取液的上清液，共分為7組91個樣本(每個老化時間1組13個樣品)在正離子模式下所獲得的EESI-MS指紋譜圖信息導(dǎo)入軟件系統(tǒng)中進(jìn)行主成分分析(Principal pomponent analysis，PCA)數(shù)據(jù)處理與分析，得到PCA得分圖。由PCA得分圖可見，所有馬鈴薯微型種薯有規(guī)律地聚集和分散，相同活性的馬鈴薯微型種薯聚在一起，不同活性的馬鈴薯微型種薯可以完全分開；PC1、PC2和PC3的貢獻(xiàn)率分別為81.20％、8.50％和2.00％，共91.70％。其中，PC1描述了數(shù)據(jù)集合中最大變量的方向，沿著PC1的方向，不同活性的馬鈴薯微型種薯之間具有很好的區(qū)分效果。結(jié)果表明EESI-MS結(jié)合PCA可以有效區(qū)分不同活性的馬鈴薯微型種薯。

本發(fā)明提供的所述基于EESI-MS及多變量統(tǒng)計技術(shù)對馬鈴薯微型種薯進(jìn)行活性鑒定的方法的有益效果在于：通過對不同活性的馬鈴薯微型種薯提取液進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)合變量分析方法對不同活性指數(shù)的馬鈴薯微型種薯進(jìn)行鑒定，具有穩(wěn)定性好、靈敏度高、分析速度快等優(yōu)點。此外，基于馬鈴薯種薯的老化機(jī)制，采用電噴霧萃取電離質(zhì)譜分析技術(shù)，在無需復(fù)雜樣品預(yù)處理前提下，對不同老化時間的馬鈴薯微型種薯的提取液進(jìn)行直接質(zhì)譜分析，獲得其正離子模式下指紋圖譜，并結(jié)合主成分分析中三個主成分因子，累計貢獻(xiàn)率達(dá)到91.70％，可以將不同活性的馬鈴薯微型種薯有效區(qū)分開。

以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運用在其它相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。