本發(fā)明屬于細胞工程組織培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種南美星油藤快速繁殖的方法。

背景技術：

南美星油藤(Plukenetia volubilis L.)又名南美油藤、印加果、印加花生等，印加語稱Sacha Inchi，為大戟科多年生常綠木質藤本油料作物，原產(chǎn)于南美洲安第斯山脈的熱帶雨林地區(qū)。該植物當年種植當年即可開花結實，2～3年即進入豐產(chǎn)期，盛產(chǎn)期長達10年以上。從南美星油藤種子中榨取的油含有較高的不飽和脂肪酸(尤其是亞麻酸和亞油酸)、V_A和V_E，對調整人體血脂、預防心血管疾病、保養(yǎng)肌膚防衰老等作用明顯，廣泛用于食品、制藥、保健和化妝品等領域，被譽為“植物腦黃金”。此外，南美星油藤還可作為退耕還林地區(qū)替代樹種，是一種極具開發(fā)和推廣利用前景的經(jīng)濟油料作物。

南美星油藤引入我國的時間較短，目前主要在云南西南部、貴州和海南少部分地區(qū)有種植。其種苗繁育主要為種子直接播種、嫁接和扦插繁殖等方式，種子播種雖在短時間內可獲得大量幼苗，但因南美星油藤為異花授粉植物，種子播種遺傳性狀不穩(wěn)定，難以保留親本的優(yōu)良性狀；嫁接繁殖操作程序繁瑣，技術要求高，不易掌握；扦插繁殖則需要大量枝條，且繁殖率較低，耗時較長，這在很大程度上影響了南美星油藤規(guī)?；?、產(chǎn)業(yè)化的生產(chǎn)和市場化的要求。而植物組織培養(yǎng)技術具有繁殖系數(shù)高、繁殖時間短、改良植物品質、不受季節(jié)限制等優(yōu)點，可有效地解決南美星油藤繁殖系數(shù)低、繁殖時間長等問題。

目前，關于南美星油藤組織培養(yǎng)的研究僅見于以種子播種獲得的無菌苗為實驗材料，以無菌苗的頂芽為外植體，通過芽的誘導、增殖、生根及移栽等方式達到微繁的目的，繁殖效果不理想。公開號為CN 104798684A的中國專利文獻公開了一種南美星油藤的組織培養(yǎng)快繁方法，以南美星油藤帶節(jié)莖段為外植體，通過不定芽誘導、增殖、生根、煉苗移栽等過程成功獲得了南美星油藤離體再生植株。該方法雖成功地獲得了南美星油藤離體再生植株，但是其不定芽的誘導率不高(92.7％)，也未對外植體進行愈傷組織的誘導及分化等研究。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種南美星油藤育苗的方法。

本發(fā)明提供的南美星油藤育苗的方法包括如下步驟：

(1)將南美星油藤的外植體在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上進行誘導培養(yǎng)，得到愈傷組織；

(2)將所述愈傷組織在愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基上進行誘導分化培養(yǎng)，得到不定芽；

(3)將所述不定芽在壯苗生根培養(yǎng)基上進行壯苗生根培養(yǎng)，得到南美星油藤幼苗。

上述方法中，

所述南美星油藤的外植體為南美星油藤枝條；所述南美星油藤枝條為當年生未木質化的南美星油藤枝條；

所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的溶質包括IBA、6-BA和TDZ；

所述愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基中的溶質包括IBA、CCC和TDZ；

所述壯苗生根培養(yǎng)基中的溶質包括IBA和AC；

所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的IBA、6-BA和TDZ的質量比為1：(1-10)：(1-10)；

所述愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基中的IBA、CCC和TDZ的質量比為1：(1-3)：(1-10)；

所述壯苗生根培養(yǎng)基中的IBA和AC的質量比為(0.1-1)：1。

上述方法中，

所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基是將基礎培養(yǎng)基、IBA、6-BA、TDZ、蔗糖和凝固劑混勻得到的培養(yǎng)基；

所述愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基是將基礎培養(yǎng)基、IBA、CCC、TDZ、蔗糖和凝固劑混勻得到的培養(yǎng)基；

所述壯苗生根培養(yǎng)基是將基礎培養(yǎng)基、IBA、AC、蔗糖和凝固劑混勻得到的培養(yǎng)基。

上述方法中，

所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基和所述愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基中的基礎培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，其配方如下：NH₄NO₃ 1.65g/L,H₃BO₃ 6.2mg/L,CaCl₂ 332.2mg/L,CoCl₂﹒6H₂O 0.025mg/L,CuSO₄﹒5H₂O 0.025mg/L,EDTA二鈉二水合物37.26mg/L,FeSO₄﹒7H₂O 27.8mg/L,MgSO₄ 180.7mg/L,MnSO₄﹒H₂O 16.9mg/L,Na₂MoO₄﹒2H₂O 0.25mg/L,KI 0.83mg/L,KNO₃ 1.9g/L,KH₂PO₄ 170mg/L,ZnSO₄﹒7H₂O 8.6mg/L。

所述壯苗生根培養(yǎng)基中的基礎培養(yǎng)基可以是上述MS培養(yǎng)基，也可以是MS _vit培養(yǎng)基，所述MS _vit培養(yǎng)基的配方如下：NH₄NO₃ 1.65g/L,H₃BO₃ 6.2mg/L,CaCl₂ 332.2mg/L,CoCl₂﹒6H₂O 0.025mg/L,CuSO₄﹒5H₂O 0.025mg/L,EDTA二鈉二水合物37.26mg/L,FeSO₄﹒7H₂O 27.8mg/L,甘氨酸2mg/L,MgSO₄ 180.7mg/L,MnSO₄﹒H₂O 16.9mg/L,Na₂MoO₄﹒2H₂O 0.25mg/L,肌醇100mg/L,尼克酸0.5mg/L,KI 0.83mg/L,KNO₃ 1.9g/L,KH₂PO₄ 170mg/L,鹽酸吡哆醇0.5mg/L,鹽酸硫胺素0.1mg/L,ZnSO₄﹒7H₂O 8.6mg/L。

上述方法中，

所述IBA在所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的濃度為0-1.0mg/L；

所述6-BA在所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的濃度為0-1.0mg/L；

所述TDZ在所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.5-2.0mg/L；

所述IBA在所述愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基中的濃度為0-2.0mg/L；

所述CCC在所述愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基中的濃度為0-1.0mg/L；

所述TDZ在所述愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基中的濃度為0-1.0mg/L；

所述IBA在所述壯苗生根培養(yǎng)基中的濃度為0-2.0mg/L；

所述AC在所述壯苗生根培養(yǎng)基中的濃度為0-1.0mg/L。

上述方法中，

所述凝固劑為瓊脂；

所述IBA在所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L；

所述6-BA在所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的濃度為1.0mg/L；

所述TDZ在所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基中的濃度為0.5mg/L；

所述IBA在所述愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基中的濃度為0.1mg/L；

所述CCC在所述愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基中的濃度為0.1mg/L；

所述TDZ在所述愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基中的濃度為0.1mg/L；

所述蔗糖在所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基和所述愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基中的濃度均為30g/L；

所述瓊脂在所述愈傷組織誘導培養(yǎng)基、所述愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基和所述壯苗生根培養(yǎng)基中的濃度均為8g/L；

所述IBA在所述壯苗生根培養(yǎng)基中的濃度為0.1mg/L；

所述AC在所述壯苗生根培養(yǎng)基中的濃度為1g/L；

所述蔗糖在所述壯苗生根培養(yǎng)基中的濃度為40g/L。

上述方法中，

所述培養(yǎng)基的pH均為5.8-6.0。

上述方法中，

所述培養(yǎng)的條件均為：溫度23-27℃，相對濕度55-60％，光照強度40μmol m^-2·s^-1，光照時間12h/d。

上述方法中，

所述在愈傷組織誘導培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導培養(yǎng)前還包括消毒的步驟；

所述壯苗生根培養(yǎng)后還包括煉苗移栽的步驟。

本發(fā)明的另一個目的是提供上述愈傷組織誘導培養(yǎng)基或上述愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基或上述壯苗生根培養(yǎng)基。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種用于南美星油藤育苗的試劑盒。

本發(fā)明提供的用于南美星油藤育苗的試劑盒包括上述愈傷組織誘導培養(yǎng)基和/或上述愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基和/或上述壯苗生根培養(yǎng)基。

本發(fā)明的最后一個目的是提供上述方法或上述愈傷組織誘導培養(yǎng)基或上述愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基或上述壯苗生根培養(yǎng)基或上述試劑盒的新用途。

本發(fā)明提供了上述方法或上述愈傷組織誘導培養(yǎng)基或上述愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基或上述壯苗生根培養(yǎng)基或上述試劑盒在如下(1)-(4)中任一種中的應用：

(1)提高南美星油藤的愈傷組織誘導率；

(2)提高南美星油藤愈傷組織分化出的不定芽數(shù)；

(3)提高南美星油藤不定芽的生根數(shù)；

(4)提高南美星油藤的植株成活率。

本發(fā)明的突出優(yōu)點在于：

(1)本發(fā)明對南美星油藤進行愈傷組織的誘導和分化試驗，通過選取生長健壯、當年生未木質化的南美星油藤枝條為外植體，進行愈傷組織的誘導分化，在短時間內培育出大量長勢優(yōu)良的南美星油藤幼苗，為其工廠化生產(chǎn)提供了技術參考。

(2)本發(fā)明涉及IBA、CCC、TDZ和6-BA等植物激素可顯著提高愈傷組織的誘導率和分化形成不定芽的能力；其中，TDZ(噻苯隆)能快速誘導外植體從愈傷組織的形成到不定芽的分化，AC等可抑制培養(yǎng)過程中外植體及愈傷組織的褐化。

(3)采用本發(fā)明所述的培養(yǎng)方法培養(yǎng)20d左右愈傷組織誘導率達100％，產(chǎn)生的愈傷組織呈淺綠色，質地較疏松，健康；繼續(xù)培養(yǎng)15～20d，約98％以上愈傷組織可誘導分化形成不定芽，且不定芽的平均發(fā)芽數(shù)達12.83個，長勢較好。

本發(fā)明提供了一種通過植物組織培養(yǎng)方法短時間內獲得大量優(yōu)質的南美星油藤種苗的方法。以南美星油藤當年生未木質化的枝條為外植體，經(jīng)過外植體表面消毒、外植體培養(yǎng)誘導愈傷組織、愈傷組織誘導芽的分化和伸長、壯苗生根、煉苗移栽等步驟獲得再生植株的一種方法，整個過程在可控條件下進行，不受季節(jié)限制，還大大縮短了繁殖周期，增加了繁殖倍數(shù)，為滿足對南美星油藤優(yōu)質種苗的需求、加速南美星油藤良種的推廣具有重要的現(xiàn)實意義。另外，大多數(shù)的遺傳轉化方法都是建立在細胞和組織能夠再生成完整植株的基礎之上，本方法以南美星油藤當年生未木質化的枝條為外植體，進行愈傷組織的誘導和分化獲得再生植株，由此可篩選出高產(chǎn)、優(yōu)質、抗病、抗逆性較強的優(yōu)良植株，可成為以后快速獲得大量優(yōu)質種苗和基因改良的一種高效可行的技術手段。通過實驗證明：本發(fā)明的方法可大大加快其繁殖速率、增加繁殖倍數(shù)、縮短育種年限，為以后南美星油藤的大面積推廣和規(guī)?；N植提供理論依據(jù)和技術參考，同時還可為以后南美星油藤的基因改良、遺傳轉化等研究奠定基礎。

附圖說明

圖1為外植體培養(yǎng)誘導愈傷組織效果圖。

圖2為愈傷組織誘導分化形成不定芽效果圖。

圖3為誘導分化形成芽的伸長效果圖。

圖4為壯苗生根培養(yǎng)效果圖。

圖5為煉苗移栽效果圖。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。

下述實施例中的愈傷組織誘導培養(yǎng)基和愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基中所用的MS為Murashige&Skoog基礎鹽，購自海南微氪生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為MSP01-50LT，具體配方如下：NH₄NO₃ 1.65g/L,H₃BO₃ 6.2mg/L,CaCl₂ 332.2mg/L,CoCl₂﹒6H₂O 0.025mg/L,CuSO₄﹒5H₂O 0.025mg/L,EDTA二鈉二水合物37.26mg/L,FeSO₄﹒7H₂O 27.8mg/L,MgSO₄180.7mg/L,MnSO₄﹒H₂O 16.9mg/L,Na₂MoO₄﹒2H₂O 0.25mg/L,KI 0.83mg/L,KNO₃ 1.9g/L,KH₂PO₄ 170mg/L,ZnSO₄﹒7H₂O 8.6mg/L。

下述實施例中的壯苗生根培養(yǎng)基中所用的MS _vit為含有維他命的Murashige&Skoog基礎鹽，購自海南微氪生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號為MSP09-50LT，具體配方如下：NH₄NO₃ 1.65g/L,H₃BO₃ 6.2mg/L,CaCl₂ 332.2mg/L,CoCl₂﹒6H₂O 0.025mg/L,CuSO₄﹒5H₂O 0.025mg/L,EDTA二鈉二水合物37.26mg/L,FeSO₄﹒7H₂O 27.8mg/L,甘氨酸2mg/L,MgSO₄180.7mg/L,MnSO₄﹒H₂O 16.9mg/L,Na₂MoO₄﹒2H₂O 0.25mg/L,肌醇100mg/L,尼克酸0.5mg/L,KI 0.83mg/L,KNO₃ 1.9g/L,KH₂PO₄ 170mg/L,鹽酸吡哆醇0.5mg/L,鹽酸硫胺素0.1mg/L,ZnSO₄﹒7H₂O 8.6mg/L。

下述實施例中的IBA(吲哚丁酸)，購置于濟南普朗特生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號：PLT-02。

下述實施例中的6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)，購置于濟南普朗特生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號：PLT-02。

下述實施例中的TDZ(噻苯隆)，購置于濟南普朗特生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號：51707-55-2。

下述實施例中的CCC(矮壯素)，購置于濟南普朗特生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號：724C032。

下述實施例中的AC(抗壞血酸)，購置于濟南普朗特生物科技有限公司，產(chǎn)品目錄號：20150501-1。

下述實施例中的NAA(a-萘乙酸)，購置于國藥集團化學試劑有限公司，產(chǎn)品目錄號：F 20110613。

實施例1、一種南美星油藤育苗的方法

一、外植體采集與表面消毒

剪取生長健壯的當年生未木質化的南美星油藤枝條于封口袋中帶回，并將采集的新鮮枝條進行表面消毒。具體步驟如下：

1、將枝條切成約為1.5cm長的莖段，置于200ml燒杯中，先用適量洗潔劑(雕牌洗潔劑，購自家樂福超市；產(chǎn)品目錄號GB9985-2000)浸泡30min，期間每3-5min輕輕搖晃燒杯，浸泡后在流水下沖洗30min后置于超凈工作臺上，得到浸泡后的外植體；

2、用70％乙醇對浸泡后的外植體消毒30s，用無菌水清洗5次；再用2％NaCl消毒8min，無菌水清洗5次，無菌濾紙吸干表面的水珠，得到消毒處理后的外植體，備用。

二、外植體培養(yǎng)誘導愈傷組織

用手術刀將步驟一獲得的消毒處理后的外植體的莖段兩端切掉，按照培養(yǎng)基中溶質濃度的不同分別接種到如下a)、b)和c)所示的愈傷組織誘導培養(yǎng)基及愈傷組織誘導對照培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導培養(yǎng)：

a)MS+0.1mg/L IBA+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L TDZ+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂(pH＝5.8)。

b)MS+0.5mg/L IBA+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L TDZ+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂(pH＝5.8)。

c)MS+1.0mg/L IBA+0.5mg/L 6-BA+1.0mg/L TDZ+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂(pH＝5.8)。

愈傷組織誘導對照培養(yǎng)基：MS+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂(pH＝5.8)。

培養(yǎng)條件：溫度25±2℃，光照強度40μmol m^-2·s^-1，光照時間12h/d。

外植體培養(yǎng)30天后，除對照培養(yǎng)基外，所有培養(yǎng)基均可通過外植體誘導形成愈傷組織，差別在于愈傷組織的誘導率和疏松程度不同。外植體在各個愈傷組織誘導培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)的結果具體如下：

a)所示的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-10天時形成淺黃綠色愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)15-25天，愈傷組織膨大，淺綠色，較疏松，誘導率達100％。

b)所示的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-10天時形成淺黃綠色或淺綠色愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)15-20天，愈傷組織膨大，淺綠色，較疏松，健康，誘導率達100％。b)所示的培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)的外植體如圖1所示。

c)所示的培養(yǎng)基中培養(yǎng)7-10天時形成淺黃綠色愈傷組織，繼續(xù)培養(yǎng)15-30天，愈傷組織膨大，疏松，且部分愈傷組織不同程度褐化，誘導率達95％。

由上述培養(yǎng)結果可知，不同愈傷組織誘導培養(yǎng)基對南美星油藤愈傷組織的誘導效果不同，差異較顯著。南美星油藤愈傷組織誘導培養(yǎng)基配方優(yōu)選為b)所示的培養(yǎng)基(MS+0.5mg/L IBA+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L TDZ+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂，pH＝5.8)，其誘導產(chǎn)生的愈傷組織較疏松、健康，誘導率達100％。

三、愈傷組織誘導芽的分化和伸長

將步驟二中b)所示的培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)獲得的愈傷組織按照培養(yǎng)基中溶質濃度的不同分別接種到如下d)、e)和f)所示的愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基和愈傷組織誘導分化對照培養(yǎng)基上進行愈傷組織分化培養(yǎng)：

d)MS+0.1mg/L IBA+0.1mg/L CCC+0.1mg/L TDZ+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂(pH＝5.8)。

e)MS+0.5mg/L IBA+0.2mg/L CCC+1.0mg/L TDZ+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂(pH＝5.8)。

f)MS+1.0mg/L IBA+0.3mg/L CCC+0.5mg/L TDZ+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂(pH＝5.8)。

愈傷組織誘導分化對照培養(yǎng)基：MS+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂(pH＝5.8)。

培養(yǎng)條件：溫度25±2℃，光照強度40μmol m^-2·s^-1，光照時間12h/d。

外植體培養(yǎng)45天后，外植體在各個愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基中誘導培養(yǎng)的結果具體如下：

d)培養(yǎng)15-20天，約98％以上的愈傷組織分化出不定芽，繼續(xù)培養(yǎng)45天后，誘導分化產(chǎn)生的不定芽長勢較好，平均發(fā)芽數(shù)為12.83個，平均芽長為6.64mm。d)所示的培養(yǎng)基中愈傷組織分化出不定芽如圖2和圖3所示。

e)培養(yǎng)15-30天，約90％以上的愈傷組織分化形成不定芽，繼續(xù)培養(yǎng)45天后，平均發(fā)芽數(shù)為9.33個，平均芽長為12.34mm。

f)培養(yǎng)15-30天，約70％以上的愈傷組織分化形成不定芽，繼續(xù)培養(yǎng)45天后，小部分愈傷組織褐化，少許芽萎蔫，長勢一般，平均發(fā)芽數(shù)為7.67個，平均芽長為5.74mm。

在愈傷組織誘導分化對照培養(yǎng)基中未發(fā)現(xiàn)愈傷組織的產(chǎn)生。

由上述培養(yǎng)結果可知，南美星油藤愈傷組織誘導分化培養(yǎng)基配方優(yōu)選為d)所示的培養(yǎng)基(MS+0.1mg/L IBA+0.1mg/L CCC+0.1mg/L TDZ+30g/L蔗糖+8g/L瓊脂，pH＝5.8)其誘導分化出芽長勢較為健康，芽數(shù)最多，達12.83個，遠高于專利號CN 104798684 A中外植體誘導分化形成的不定芽數(shù)。

四、壯苗生根培養(yǎng)

將步驟三中d)所示的培養(yǎng)基誘導分化獲得的高度約2.5-4cm的小芽分切下，并按照培養(yǎng)基中溶質及其濃度的不同分別接種到g)、h)和i)所示的壯苗生根培養(yǎng)基上進行壯苗生根培養(yǎng)：

g)MS _vit+0.1mg/L IBA+1g/L AC+40g/L蔗糖+8g/L瓊脂。

h)MS _vit+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA+1g/L AC+40g/L蔗糖+8g/L瓊脂。

i)MS _vit+1.0mg/L IBA+1.0mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+1g/L AC+40g/L蔗糖+8g/L瓊脂。

培養(yǎng)條件為：溫度25±2℃，光照強度40μmol m^-2·s^-1，光照時間12h/d。

培養(yǎng)60天后，各小芽在各個壯苗生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)的結果具體如下：

g)培養(yǎng)15天左右開始生根，生根率為100％，繼續(xù)培養(yǎng)60天后，平均生根數(shù)達10.6條，平均根長為85.6mm，長勢較好。g)所示的培養(yǎng)基中不定芽的幼苗如圖4所示。

h)培養(yǎng)30天左右開始長根，繼續(xù)培養(yǎng)60天后，生根數(shù)量較少，但根較為粗壯。

i)培養(yǎng)60天后有少許長根，生根效果較差，芽葉片逐漸黃化。

由上述培養(yǎng)結果可知，南美星油藤壯苗生根培養(yǎng)基配方優(yōu)選為g)所示的培養(yǎng)基(MS _vit+0.1mg/L IBA+1g/L AC+40g/L蔗糖+8g/L瓊脂，pH＝5.8)，其誘導產(chǎn)生的平均生根數(shù)較多，平均根長較長，植株長勢較好。

五、煉苗移栽

將步驟四中g)所示的培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得的高約4-6cm、生長健壯、根系粗壯、葉色濃綠的生根試管苗置于大棚中，溫度保持在25℃左右，打開瓶蓋在自然光照下煉苗15天后，將試管苗從培養(yǎng)瓶中取出，洗掉根部培養(yǎng)基并用多菌靈溶液中浸泡10s，將其移栽到消毒的栽培基質(栽培基質的配比為泥炭土：椰糠：珍珠巖＝3:2:1)中培養(yǎng)得到再生植株，定期澆水，保持透光度為70-80％，相對濕度80％以上。再生植株成活率達85％以上，再生植株如圖5所示。