本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體指一種鐵皮石斛類原球莖培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛(dendrobiumcandidumwall.exlindl.)為蘭科(orchidaceae)石斛屬(dendrobium)多年生附生草本植物，因老莖莖節(jié)處呈褐色，又名黑節(jié)草，是一種集觀賞和藥用于一身的名貴珍稀草本植物，具有獨特的藥用價值，為石斛之極品。石斛是我國古文獻中最早記載的蘭科植物之一，其性味甘淡、微咸，性屬清潤，清中有補，補中有清。早在東漢時期的《神農(nóng)本草經(jīng)》中已記載石斛“主傷中、除痹、下氣、補五臟虛勞羸瘦、強陰、久服厚腸胃”。成書于一千多年前的道家醫(yī)學(xué)經(jīng)典《道藏》將鐵皮石斛列為“中華九大仙草”之首，為歷代帝王夢寐以求的寶物，素有“千金草”之稱，馳名中外，被國際藥用植物界稱為“藥界大熊貓”，民間稱其為“救命仙草”?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，石斛多糖具有增強t細胞及巨噬細胞免疫活性的作用，是一種前景可喜的中藥免疫增強劑，并具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化、抗誘變等作用，受到國內(nèi)外學(xué)者的高度重視。
鐵皮石斛常附生于樹木或巖石上，植株比較矮小，生長發(fā)育緩慢，葉片面積小、光合面積小、強度低，尤其是種子極小，胚具后熟現(xiàn)象，因此自然條件下種子難以萌發(fā)(萌發(fā)率低于5％)。在通常的栽培條件下，鐵皮石斛由種子到開花需要3～4年，常需與某些真菌共生才能萌發(fā)，很難有實生苗栽培。而傳統(tǒng)的分株扦插等無性繁殖方式的成活率低、生長速度慢、繁殖率低，加之近年來人們對野生鐵皮石斛資源的掠奪式采挖，其生境被嚴(yán)重破壞，致使野生鐵皮石斛瀕臨滅絕。
國內(nèi)外學(xué)者開展了對野生鐵皮石斛全面的研究，包括化學(xué)成分，藥理活性，人工種植等方面的研究。而鐵皮石斛的培養(yǎng)主要集中在愈傷組織誘導(dǎo)、基本培養(yǎng)條件篩選和理化因子的考查等方面。鐵皮石斛試管苗的繁殖一般要經(jīng)過類原球莖(protocorm-likebodies，即plbs)階段，而類原球莖實質(zhì)上是正在生長分化的體細胞胚胎，具有與原植株相同的物質(zhì)代謝和形態(tài)發(fā)育潛能。鑒于此，人們提出用類原球莖代替原植株成為新藥源的可能性。然而，已有的研究結(jié)果表明，從鐵皮石斛不同部位誘導(dǎo)出類原球莖的研究還存在誘導(dǎo)率低、分化快和褐變等問題尚沒有解決，目前還沒有找到一個切實有效地培養(yǎng)技術(shù)用以解決鐵皮石斛類原球莖誘導(dǎo)和增殖以及代謝產(chǎn)物控制中存在的疑點和難點，從而影響了鐵皮石斛的深入研究和開發(fā)。
天然鐵皮石斛已作為瀕臨滅絕的植物種受到世界以及我國政府的重點保護，嚴(yán)禁采摘。為此研究鐵皮石斛類原球莖的培養(yǎng)，實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化顯得十分重要。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提出一種鐵皮石斛類原球莖培養(yǎng)方法，繁殖速度快，石斛多糖含量高。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
一種鐵皮石斛類原球莖培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)制作培養(yǎng)液
以ms為基本培養(yǎng)基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值為5.6；
(2)培養(yǎng)液無菌處理
將培養(yǎng)液放入110～130℃高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌持續(xù)20min滅菌；
(3)鐵皮石斛plbs培養(yǎng)
在5l的反應(yīng)器中加入1l培養(yǎng)液，并處于25±2℃的溫度環(huán)境下，接入40～100g鐵皮石斛plbs，培養(yǎng)時間為36d；
(4)獲取鐵皮石斛plbs
培養(yǎng)36d后取出plbs稱取鮮重，隨后，將新鮮plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重復(fù)處理步驟(1)-(4)3次。
作為優(yōu)選，所述步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，向培養(yǎng)液通氣，通氣量為0.5cc/min～2.0cc/min。
作為優(yōu)選，所述步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，每18d取出原培養(yǎng)液，并添加新鮮的培養(yǎng)液。
作為優(yōu)選，所述步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，每18d向反應(yīng)器內(nèi)添加新鮮的培養(yǎng)液。
作為優(yōu)選，所述步驟(3)包括叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)期和大規(guī)模培養(yǎng)期，所述的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時間：8～20小時/天，光照強度：50～80μmol/m2·s；所述的大規(guī)模培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時間：8～20小時/天，光照強度：50～80μmol/m2·s。
本發(fā)明具有以下的特點和有益效果：
采用上述技術(shù)方案，該方法容易操作，生產(chǎn)成本低，不污染環(huán)境，可以實現(xiàn)批量生產(chǎn)。通過在反應(yīng)器內(nèi)接入合適的鐵皮石斛plbs、向培養(yǎng)液通入合適的通氣量、以及增加新鮮培養(yǎng)液，和野生鐵皮石斛比較石斛多糖含量提高大大提高。通過本發(fā)明方法生產(chǎn)鐵皮石斛類原球莖，不變性，產(chǎn)量大，成本低，周期短，極具市場競爭力。
具體實施方式
下面結(jié)合對本發(fā)明的具體實施方式作進一步說明。在此需要說明的是，對于這些實施方式的說明用于幫助理解本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限定。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實施方式中所涉及的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。
實施例1
本發(fā)明提供了一種鐵皮石斛類原球莖培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)制作培養(yǎng)液
以ms為基本培養(yǎng)基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值為5.6；
(2)培養(yǎng)液無菌處理
將培養(yǎng)液放入110～130℃高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌持續(xù)20min滅菌；
(3)鐵皮石斛plbs培養(yǎng)
在5l的反應(yīng)器中加入1l培養(yǎng)液，并處于25±2℃的溫度環(huán)境下，接入40g鐵皮石斛plbs，培養(yǎng)時間為36d；
(4)獲取鐵皮石斛plbs
培養(yǎng)36d后取出plbs稱取鮮重，隨后，將新鮮plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重復(fù)處理步驟(1)-(4)3次。
進一步的，步驟(3)包括叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)期和大規(guī)模培養(yǎng)期，的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時間：8～20小時/天，光照強度：50～80μmol/m2·s；的大規(guī)模培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時間：8～20小時/天，光照強度：50～80μmol/m2·s。
實施例2
本實施例與實施例1的區(qū)別在于，包括以下步驟：
(1)制作培養(yǎng)液
以ms為基本培養(yǎng)基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值為5.6；
(2)培養(yǎng)液無菌處理
將培養(yǎng)液放入110～130℃高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌持續(xù)20min滅菌；
(3)鐵皮石斛plbs培養(yǎng)
在5l的反應(yīng)器中加入1l培養(yǎng)液，并處于25±2℃的溫度環(huán)境下，接入80g鐵皮石斛plbs，培養(yǎng)時間為36d；
(4)獲取鐵皮石斛plbs
培養(yǎng)36d后取出plbs稱取鮮重，隨后，將新鮮plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重復(fù)處理步驟(1)-(4)3次。
步驟(3)包括叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)期和大規(guī)模培養(yǎng)期，的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時間：8～20小時/天，光照強度：50～80μmol/m2·s；的大規(guī)模培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時間：8～20小時/天，光照強度：50～80μmol/m2·s。
實施例3
本發(fā)明提供了一種鐵皮石斛類原球莖培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)制作培養(yǎng)液
以ms為基本培養(yǎng)基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值為5.6；
(2)培養(yǎng)液無菌處理
將培養(yǎng)液放入110～130℃高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌持續(xù)20min滅菌；
(3)鐵皮石斛plbs培養(yǎng)
在5l的反應(yīng)器中加入1l培養(yǎng)液，并處于25±2℃的溫度環(huán)境下，接入100g鐵皮石斛plbs，培養(yǎng)時間為36d；
(4)獲取鐵皮石斛plbs
培養(yǎng)36d后取出plbs稱取鮮重，隨后，將新鮮plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重復(fù)處理步驟(1)-(4)3次。
步驟(3)包括叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)期和大規(guī)模培養(yǎng)期，的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時間：8～20小時/天，光照強度：50～80μmol/m2·s；的大規(guī)模培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時間：8～20小時/天，光照強度：50～80μmol/m2·s。
綜合實施例1至實施例3，
試驗結(jié)果證實：相同的條件下，接種量為80g/l時多糖含量最高。
實施例4
本實施例與實施例2的區(qū)別在于，包括以下步驟：
(1)制作培養(yǎng)液
以ms為基本培養(yǎng)基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值為5.6；
(2)培養(yǎng)液無菌處理
將培養(yǎng)液放入110～130℃高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌持續(xù)20min滅菌；
(3)鐵皮石斛plbs培養(yǎng)
在5l的反應(yīng)器中加入1l培養(yǎng)液，并處于25±2℃的溫度環(huán)境下，接入80g鐵皮石斛plbs，培養(yǎng)時間為36d；
(4)獲取鐵皮石斛plbs
培養(yǎng)36d后取出plbs稱取鮮重，隨后，將新鮮plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重復(fù)處理步驟(1)-(4)3次。
步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，向培養(yǎng)液通氣，通氣量為0.5cc/min。
步驟(3)包括叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)期和大規(guī)模培養(yǎng)期，的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時間：8～20小時/天，光照強度：50～80μmol/m2·s；的大規(guī)模培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時間：8～20小時/天，光照強度：50～80μmol/m2·s。
實施例5
本發(fā)明提供了一種鐵皮石斛類原球莖培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)制作培養(yǎng)液
以ms為基本培養(yǎng)基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值為5.6；
(2)培養(yǎng)液無菌處理
將培養(yǎng)液放入110～130℃高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌持續(xù)20min滅菌；
(3)鐵皮石斛plbs培養(yǎng)
在5l的反應(yīng)器中加入1l培養(yǎng)液，并處于25±2℃的溫度環(huán)境下，接入80g鐵皮石斛plbs，培養(yǎng)時間為36d；
(4)獲取鐵皮石斛plbs
培養(yǎng)36d后取出plbs稱取鮮重，隨后，將新鮮plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重復(fù)處理步驟(1)-(4)3次。
步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，向培養(yǎng)液通氣，通氣量為1.0cc/min。
步驟(3)包括叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)期和大規(guī)模培養(yǎng)期，的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時間：8～20小時/天，光照強度：50～80μmol/m2·s；的大規(guī)模培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時間：8～20小時/天，光照強度：50～80μmol/m2·s。
實施例6
本發(fā)明提供了一種鐵皮石斛類原球莖培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)制作培養(yǎng)液
以ms為基本培養(yǎng)基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值為5.6；
(2)培養(yǎng)液無菌處理
將培養(yǎng)液放入110～130℃高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌持續(xù)20min滅菌；
(3)鐵皮石斛plbs培養(yǎng)
在5l的反應(yīng)器中加入1l培養(yǎng)液，并處于25±2℃的溫度環(huán)境下，接入80g鐵皮石斛plbs，培養(yǎng)時間為36d；
(4)獲取鐵皮石斛plbs
培養(yǎng)36d后取出plbs稱取鮮重，隨后，將新鮮plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重復(fù)處理步驟(1)-(4)3次。
步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，向培養(yǎng)液通氣，通氣量為2.0cc/min。
步驟(3)包括叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)期和大規(guī)模培養(yǎng)期，的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時間：8～20小時/天，光照強度：50～80μmol/m2·s；的大規(guī)模培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時間：8～20小時/天，光照強度：50～80μmol/m2·s。
綜合實施例4至實施例6，
試驗結(jié)果證實：相同的條件下，培養(yǎng)期間，通氣量保持在2.0cc/min時多糖含量最高。
實施例7
本發(fā)明提供了一種鐵皮石斛類原球莖培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)制作培養(yǎng)液
以ms為基本培養(yǎng)基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值為5.6；
(2)培養(yǎng)液無菌處理
將培養(yǎng)液放入110～130℃高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌持續(xù)20min滅菌；
(3)鐵皮石斛plbs培養(yǎng)
在5l的反應(yīng)器中加入1l培養(yǎng)液，并處于25±2℃的溫度環(huán)境下，接入80g鐵皮石斛plbs，培養(yǎng)時間為36d；
(4)獲取鐵皮石斛plbs
培養(yǎng)36d后取出plbs稱取鮮重，隨后，將新鮮plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重復(fù)處理步驟(1)-(4)3次。
步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，向培養(yǎng)液通氣，通氣量為2.0cc/min。
步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，每18d取出原培養(yǎng)液，并添加新鮮的培養(yǎng)液。
步驟(3)包括叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)期和大規(guī)模培養(yǎng)期，的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時間：8～20小時/天，光照強度：50～80μmol/m2·s；的大規(guī)模培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時間：8～20小時/天，光照強度：50～80μmol/m2·s。
實施例8
本發(fā)明提供了一種鐵皮石斛類原球莖培養(yǎng)方法，包括以下步驟：
(1)制作培養(yǎng)液
以ms為基本培養(yǎng)基，附加naa1.0mg/l，蔗糖30g/l，椰乳5％，ph值為5.6；
(2)培養(yǎng)液無菌處理
將培養(yǎng)液放入110～130℃高溫高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌持續(xù)20min滅菌；
(3)鐵皮石斛plbs培養(yǎng)
在5l的反應(yīng)器中加入1l培養(yǎng)液，并處于25±2℃的溫度環(huán)境下，接入80g鐵皮石斛plbs，培養(yǎng)時間為36d；
(4)獲取鐵皮石斛plbs
培養(yǎng)36d后取出plbs稱取鮮重，隨后，將新鮮plbs在烘箱中用90℃烘30min，60℃烘干至恒重，即干重；
(5)重復(fù)處理步驟(1)-(4)3次。
步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，向培養(yǎng)液通氣，通氣量為2.0cc/min。
步驟(3)中，在鐵皮石斛plbs培養(yǎng)期間，每18d向反應(yīng)器內(nèi)添加新鮮的培養(yǎng)液。
步驟(3)包括叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)期和大規(guī)模培養(yǎng)期，的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時間：8～20小時/天，光照強度：50～80μmol/m2·s；的大規(guī)模培養(yǎng)：培養(yǎng)周期：15～20天，培養(yǎng)溫度：20～25℃，光照時間：8～20小時/天，光照強度：50～80μmol/m2·s。
綜合實施例4至實施例6，
試驗結(jié)果證實：相同的條件下，培養(yǎng)期間，每18d加1l培養(yǎng)液時多糖含量最高。
以上結(jié)合本發(fā)明的實施方式作了詳細說明，但本發(fā)明不限于所描述的實施方式。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理和精神的情況下，對這些實施方式進行多種變化、修改、替換和變型，仍落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。