本發(fā)明涉及一種細(xì)胞凍存試劑，具體涉及一種新型的細(xì)胞凍存試劑，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：細(xì)胞凍存使用的凍存試劑有含血清和無血清兩類，由于血清具有成分復(fù)雜、質(zhì)量不穩(wěn)定、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，所以無血清凍存技術(shù)成為發(fā)展的趨勢。本發(fā)明主要是針對無血清凍存技術(shù)進(jìn)行的研究。現(xiàn)有的細(xì)胞凍存試劑，其主要存在以下兩方面的問題：一、含有動物成分，使用不安全；二、使用時(shí)，需要現(xiàn)用現(xiàn)配，操作不方便，并且容易污染。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種新型的細(xì)胞凍存試劑，其不僅不含動物成分，而且是即用型，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，即可直接使用本試劑進(jìn)行細(xì)胞重懸。為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：一種新型的細(xì)胞凍存試劑，其特征在于，各組成成分及用量分別為：本發(fā)明的有益之處在于：(1)不含動物成分，使用安全可靠；(2)成分完全明確，便于質(zhì)量控制；(3)即用型，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，即可直接使用本試劑進(jìn)行細(xì)胞重懸，操作更加方便，無需額外配制；(4)適用的細(xì)胞類型不限；(5)可以維持細(xì)胞在-196℃液氮環(huán)境下長期安全保存。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作具體的介紹。一、準(zhǔn)備各相關(guān)試劑表1各組的組成成分及用量現(xiàn)有的細(xì)胞凍存試劑，其配方一般為胎牛血清搭配DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)添加一定量的DMSO，這種配方的凍存試劑含有動物成分，而且需要現(xiàn)用現(xiàn)配，給實(shí)際使用帶來了很多問題。而在本發(fā)明中，我們選用重組人血白蛋白來代替胎牛血清，并將重組人血白蛋白與DMEM培養(yǎng)基按照2:8的體積比混合，此外，為了更好的保持凍存細(xì)胞的活性，我們經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證，最后選定了重組人表皮生長因子、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子和人肝細(xì)胞生長因子作為補(bǔ)充成分，為驗(yàn)證最合適的因子濃度，我們進(jìn)行了上述組分的不同組合，以便驗(yàn)證具體的凍存效果。二、制備方法準(zhǔn)備DMEM培養(yǎng)基(購自美國Life公司)、重組人血白蛋白(購自武漢禾元生物)、DMSO(購自美國Sigma公司)、重組人表皮生長因子(購自美國Peprotech公司)、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子(購自美國Peprotech公司)、重組人肝細(xì)胞生長因子(購自美國Peprotech公司)。在百級的無菌操作臺里進(jìn)行相關(guān)試劑的配制。重組人表皮生長因子、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子、重組人肝細(xì)胞生長因子的配制按照廠家的說明書進(jìn)行操作。三、使用方法細(xì)胞計(jì)數(shù)后，直接使用本試劑進(jìn)行細(xì)胞重懸，密度為2×106-5×106/ml，即1.8ml的凍存管中裝入1ml細(xì)胞懸液。四、凍存效果選用人Hela細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。收集足量的人Hela細(xì)胞，用前述不同組分組合配制的凍存試劑進(jìn)行細(xì)胞重懸，將符合密度要求(3×106/ml)的細(xì)胞裝入凍存管。使用程序梯度降溫儀給凍存管進(jìn)行降溫，之后轉(zhuǎn)入-196℃液氮環(huán)境。凍存一段時(shí)間后，進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，觀察各組細(xì)胞的復(fù)蘇情況，并計(jì)算各組細(xì)胞的復(fù)蘇成活率(簡稱復(fù)蘇率)。1、人Hela細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察凍存一周，然后復(fù)蘇，應(yīng)用相差顯微鏡來觀察復(fù)蘇后各組細(xì)胞的存活及分化情況，培養(yǎng)3天后計(jì)算克隆形成率。經(jīng)觀察，各組細(xì)胞的存活及分化情況見表2。表2各組細(xì)胞的存活及分化情況存活情況分化情況第1組差出現(xiàn)分化第2組良好未出現(xiàn)分化第3組良好未出現(xiàn)分化第4組良好未出現(xiàn)分化第5組良好未出現(xiàn)分化第6組良好未出現(xiàn)分化第7組良好未出現(xiàn)分化第8組良好未出現(xiàn)分化第9組良好未出現(xiàn)分化經(jīng)計(jì)算，各組細(xì)胞的克隆形成率見表3。表3各組細(xì)胞的克隆形成率2、人Hela細(xì)胞的特性測定凍存一周，然后復(fù)蘇，測定人Hela細(xì)胞的特性。測定結(jié)果顯示：(1)人Hela細(xì)胞保持了很高的增殖活力。(2)人Hela細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，沒有發(fā)生重大變化。3、人Hela細(xì)胞的安全凍存時(shí)間測定凍存一周、一個月、兩年，然后復(fù)蘇，計(jì)算各組細(xì)胞的復(fù)蘇率。計(jì)算結(jié)果見表4。表4各組細(xì)胞的復(fù)蘇率由表4可知：(1)凍存一周，第3組凍存試劑的凍存效果最好，細(xì)胞復(fù)蘇率高達(dá)95％，而第1組凍存試劑的細(xì)胞復(fù)蘇率僅為50％；(2)凍存一個月，還是第3組凍存試劑的凍存效果最好，細(xì)胞復(fù)蘇率高達(dá)95％，而第1組凍存試劑的細(xì)胞復(fù)蘇率僅為40％；(3)凍存兩年，還是第3組凍存試劑的凍存效果最好，細(xì)胞復(fù)蘇率高達(dá)93％，而第1組凍存試劑的細(xì)胞復(fù)蘇率僅為30％。以上試驗(yàn)結(jié)果說明：本發(fā)明的細(xì)胞凍存試劑可以維持細(xì)胞在-196℃液氮環(huán)境下長期安全保存。本發(fā)明的細(xì)胞凍存試劑，通過添加三種重組生長因子(重組人表皮生長因子、重組人堿性成纖維細(xì)胞生長因子、重組人肝細(xì)胞生長因子)以及重組人血白蛋白，可以擺脫使用牛血清來進(jìn)行細(xì)胞凍存，添加的三種重組生長因子很好的彌補(bǔ)了單純用重組人血白蛋白取代牛血清帶來的相關(guān)問題。五、適用的細(xì)胞類型選用PBMC細(xì)胞、MSC細(xì)胞、CIK細(xì)胞、NK細(xì)胞、293細(xì)胞、HUVEC細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、人ES細(xì)胞、人iPS細(xì)胞共計(jì)9種不同類型的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。選用凍存效果最好的第3組凍存試劑。采用與第四步相同的試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表5。表5針對不同類型的細(xì)胞凍存試劑的凍存效果細(xì)胞名稱一周后細(xì)胞復(fù)蘇率PBMC細(xì)胞90％MSC細(xì)胞98％CIK細(xì)胞96％NK細(xì)胞90％293細(xì)胞97％HUVEC細(xì)胞89％成纖維細(xì)胞96％人ES細(xì)胞85％人iPS細(xì)胞87％由表5可知：對于不同類型的細(xì)胞，使用本發(fā)明的細(xì)胞凍存試劑凍存一周，細(xì)胞復(fù)蘇率最小的也能達(dá)到85％。以上試驗(yàn)結(jié)果說明：本發(fā)明的細(xì)胞凍存試劑適用的細(xì)胞類型不限。需要說明的是，上述實(shí)施例不以任何形式限制本發(fā)明，凡采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3