本發(fā)明涉及藍(lán)莓的胚性愈傷組織的高頻誘導(dǎo)、增殖及體細(xì)胞胚分化成苗方法，屬于植物的組織培養(yǎng)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

愈傷組織是一團(tuán)脫分化后的細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞分裂，產(chǎn)生無組織結(jié)構(gòu)，無明顯極性的、松散的細(xì)胞團(tuán)。根據(jù)組織學(xué)觀察、外觀特征及其再生性、再生方式等，愈傷組織分成兩大類:胚性愈傷組織(embryonic callus，EC)和非胚性愈傷組織(non-embryonic callus，NEC，如圖1)。一般胚性愈傷組織質(zhì)地較堅(jiān)實(shí)，顏色有乳白色或黃色，表面具球形顆粒，其生長緩慢；從細(xì)胞學(xué)來看，胚性愈傷組織由等直徑細(xì)胞組成，細(xì)胞較小，原生質(zhì)濃厚，無液泡，常富含淀粉粒，核大，分裂活性強(qiáng)。胚性愈傷組織又可分為致密型胚性愈傷組織和易碎型胚性愈傷組織(如圖4)。胚性愈傷組織具有以下特性：高度的胚性或再分化能力，能再生植株；分散性好，容易散碎，便于建立優(yōu)良的懸浮系或分離原生質(zhì)體；旺盛的自我增殖能力，可以制作人工種子作為種苗快繁的新途徑；經(jīng)過長期繼代保存而不喪失胚性，可進(jìn)行各種遺傳操作。

植物組織培養(yǎng)技術(shù)中植物體細(xì)胞的再生分為直接再生和間接再生，直接再生一般經(jīng)由外植體直接誘導(dǎo)胚狀體再成苗的方法，胚狀體保持時(shí)間短，不可以進(jìn)行繼代和增殖，無法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化、輻射誘變等操作。間接再生一般經(jīng)歷外植體(或種子、胚)---愈傷組織---胚性愈傷組織---體細(xì)胞胚---分化成苗等階段。間接再生的胚性愈傷組織可進(jìn)行繼代增殖，在合適培養(yǎng)基和繼代條件下可一直保持其愈傷組織狀態(tài)，是進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化、細(xì)胞培養(yǎng)、輻射誘變及制作人工種子等操作必須的試驗(yàn)材料。果樹作為木本植物現(xiàn)有技術(shù)大多采用胚性預(yù)決定的組織(如種子、胚乳、花粉等)誘導(dǎo)胚性愈傷組織的產(chǎn)生，而利用胚性重決定的組織(如葉片、莖段、根等)誘導(dǎo)胚性愈傷組織較難實(shí)現(xiàn)，但胚性重決定的組織材料易取得，可選擇具有優(yōu)良品種特性的材料，因此育種上更具有意義。

藍(lán)莓果實(shí)的保健價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值在水果中屬于佼佼者，其花青苷含量是其他水果的很多倍，因此是一種世界公認(rèn)的具有很強(qiáng)保健功能的珍貴果品資源。最新資料顯示，目前藍(lán)莓已躍居全世界漿果栽培面積和產(chǎn)量第二位，因此發(fā)展藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和開發(fā)前景。我國藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)化栽培始于本世紀(jì)初，現(xiàn)有的品種資源均引自國外，多數(shù)品種國內(nèi)栽培在適應(yīng)性、豐產(chǎn)性、品質(zhì)等方面表現(xiàn)較差，開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的新品種，對我國藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

中國專利申請《一種藍(lán)莓胚狀體的誘導(dǎo)方法》(公開號CN103598093A)中公開了一種培養(yǎng)基：WPM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加吲哚乙酸IAA0.5-1mg、吲哚丁酸IBA0.5～1mg、玉米素ZT0.1～0.5mg、蔗糖30g和瓊脂7g，pH為5.2～5.4；。該申請成功之處在于建立了藍(lán)莓莖尖直接誘導(dǎo)胚狀體的方法；但不足之處體現(xiàn)在：未經(jīng)過愈傷組織脫分化成苗的過程，未能獲得可增殖的胚性愈傷組織、未有芽生根的培養(yǎng)基配方，因此在分子育種特別是后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)和原生質(zhì)體培養(yǎng)方面無明顯的應(yīng)用價(jià)值。

崔廣榮等“藍(lán)莓離體葉片胚狀體高效發(fā)生及其組織學(xué)觀察”(《激光生物學(xué)報(bào)》，2008第17卷，第5期)同樣公開了一種培養(yǎng)基：高灌藍(lán)莓葉片胚狀體發(fā)生及成苗的培養(yǎng)基為WPM+TDZ 0.04mg/L+ZT 0.25～2.0mg/L+蔗糖20～40g/L,而培養(yǎng)基WPM+ZT0.5～1.0mg/L+蔗糖20g/L適合于叢芽繼代生長。此配方為藍(lán)莓葉片胚狀體的直接發(fā)生，而非間接再生，如何利用葉片、莖段等胚性重決定外植體誘導(dǎo)可繼代增殖的胚性愈傷組織，有利于進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化等轉(zhuǎn)基因遺傳操作，從細(xì)胞層面來說具有更加重要的意義。

因此，解決藍(lán)莓的胚性愈傷組織高頻再生的難題，對藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展而言具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中藍(lán)莓的胚性愈傷組織高頻再生的難題，提供一種用于高叢藍(lán)莓體細(xì)胞胚間接再生的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。

為解決技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為：

提供一種用于高叢藍(lán)莓體細(xì)胞胚間接再生的培養(yǎng)基，包括用于高叢藍(lán)莓體細(xì)胞胚間接再生中不同培養(yǎng)階段的下述四種培養(yǎng)基：

(1)高叢藍(lán)莓愈傷組織碳饑餓液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在改良1/2MS基本培養(yǎng)基中添加ZT 0.5-1.0mg/L、TDZ0.1-0.25mg/L、2-ip 0.25mg/L和CPPU 0.75mg/L，繼續(xù)添加蔗糖5-10g/L，不加瓊脂，調(diào)節(jié)pH為5.0；

(2)高叢藍(lán)莓胚性愈傷組織誘導(dǎo)及增殖半凝固培養(yǎng)基：在改良1/2MS基本培養(yǎng)基中添加ZT 1mg/L、TDZ0.2mg/L、2-ip 0.5mg/L和CPPU 1.5mg/L，繼續(xù)添加蔗糖30g/L，瓊脂3-5g/L，調(diào)節(jié)pH為5.0；

(3)高叢藍(lán)莓體細(xì)胞胚的成熟分化、成苗再生的有機(jī)物培養(yǎng)基：在改良1/2MS基本培養(yǎng)基中添加ZT 1-2.0mg/L和IBA 0.1mg/L，繼續(xù)附加蔗糖20g/L、椰乳100mg/L、AC 0.5g/L、瓊脂5-7g/L，調(diào)節(jié)pH為5.0；

(4)高叢藍(lán)莓分化苗的生根培養(yǎng)基：在改良1/6MS基本培養(yǎng)基中添加IBA 1.0mg/L、蔗糖3.5g/L、AC 0.5g/L，不加瓊脂，調(diào)節(jié)pH為5.0；

所述ZT、TDZ、2-ip、CPPU、IBA、AC分別指：玉米素、噻苯隆、N6-異戊烯基腺嘌呤、氯吡苯脲、吲哚丁酸、活性炭。

所述改良1/2MS基本培養(yǎng)基是對MS培養(yǎng)基的配方進(jìn)行了調(diào)整，其中大量元素減半，微量元素和有機(jī)物不變；調(diào)整后的具體配方為：

大量元素：NH₄NO₃ 825mg/L，KNO₃ 950mg/L，CaCl₂·2H₂O 220mg/L，MgSO₄·7H₂O 185mg/L，KH₂PO₄ 85mg/L；

微量元素：KI 0.83mg/L，H₃BO₃ 6.2mg/L，MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，Na₂MnO₄·2H₂O 0.25mg/L CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg/L；

有機(jī)成分：肌醇100mg/L，煙酸0.5mg/L，鹽酸吡哆醇0.5mg/L，鹽酸硫胺素0.5mg/L，甘氨酸2mg/L；

所述改良1/6MS基本培養(yǎng)基是對MS培養(yǎng)基的配方中大量元素進(jìn)行了調(diào)整，其中大量元素減至原配方的1/6，微量元素不變，有機(jī)物調(diào)整為原配方的1/5；具體配方為：

大量元素：NH₄NO₃ 275mg/L，KNO₃ 317mg/L，CaCl₂·2H₂O 73mg/L，MgSO₄·7H2O 62mg/L，KH₂PO₄ 28.3mg/L；

微量元素：KI 0.83mg/L，H₃BO₃ 6.2mg/L，MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，Na₂MnO₄·2H₂O 0.25mg/L CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H2O 27.8mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg/L；

有機(jī)成分：肌醇20mg/L，煙酸0.1mg/L，鹽酸吡哆醇0.1mg/L，鹽酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸0.4mg/L。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了前述培養(yǎng)基進(jìn)行高叢藍(lán)莓體細(xì)胞胚間接再生的培養(yǎng)方法，包括下述步驟：

(1)按所述配方配制四種培養(yǎng)基；

(2)選材與處理：

在無菌操作條件下，取增殖旺盛的高叢藍(lán)莓無菌試管苗，將其上部幼嫩部分剪切成長度為1cm、帶葉柄的莖段；

(3)愈傷組織低溫弱光液體淺層培養(yǎng)：

將所述高叢藍(lán)莓愈傷組織碳饑餓液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基分裝到200ml的三角瓶中，每瓶10ml，以塑料透氣膜扎口，作為液體淺層培養(yǎng)基；在無菌操作條件下，將10株幼嫩部分的莖段接入液體淺層培養(yǎng)基，在溫度18±2℃、光照強(qiáng)度1000±100lx，光照時(shí)間12h/d的條件下連續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月；培養(yǎng)材料不進(jìn)行繼代轉(zhuǎn)接，經(jīng)培養(yǎng)生成愈傷組織材料；

(4)藍(lán)莓胚性愈傷組織半凝固培養(yǎng)基低溫、黑暗分化增殖培養(yǎng)：

將所述高叢藍(lán)莓胚性愈傷組織誘導(dǎo)及增殖半凝固培養(yǎng)基分裝到9×9cm的培養(yǎng)皿中，在無菌操作條件下，將步驟(3)中獲得的愈傷組織材料切割分離，并挑選呈現(xiàn)黃綠色的愈傷組織；剔除殘存的莖段、出芽以及褐變的部分，接種于高叢藍(lán)莓胚性愈傷組織誘導(dǎo)及增殖半凝固培養(yǎng)基；繼續(xù)在溫度18±2℃，全黑暗條件下培養(yǎng)3個(gè)月，每3周繼代一次，每次繼代繼續(xù)挑選呈現(xiàn)黃綠色、松散、易碎的愈傷組織繼續(xù)繼代培養(yǎng)，獲得胚性愈傷組織，用于繼續(xù)繼代增殖；

(5)藍(lán)莓胚狀體固體培養(yǎng)基全光、常溫分化成苗培養(yǎng)：

將所述高叢藍(lán)莓體細(xì)胞胚的成熟分化、成苗再生的有機(jī)物培養(yǎng)基分裝于容量為200ml以上的三角瓶中，挑選步驟(4)中獲得的增殖旺盛、組織質(zhì)地松散且未褐變的胚性愈傷組織，接種于有機(jī)物培養(yǎng)基中；在溫度25±1℃、光照強(qiáng)度2000±100lx的條件下培養(yǎng)3個(gè)月，每4周繼代一次，每次挑選分化出芽部分與愈傷分開繼代接種，逐漸獲得符合預(yù)期的具有一定長度和粗度的藍(lán)莓芽苗；

(6)藍(lán)莓生根苗培養(yǎng)：

取12×12cm培養(yǎng)皿，在底部先墊入脫脂棉，然后覆蓋大小相近的濾紙；將高叢藍(lán)莓分化芽苗的生根培養(yǎng)基分裝于培養(yǎng)皿中，分裝量以浸濕脫脂棉和濾紙為準(zhǔn)；剪取健壯的藍(lán)莓芽苗置于培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿接種15株；在溫度25±1℃的條件下，黑暗培養(yǎng)7天；再置于光照強(qiáng)度2000±100lx條件下，培養(yǎng)21天，獲得藍(lán)莓生根苗。

本技術(shù)方案采用的愈傷組織初期低溫低光照液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)、胚性愈傷低溫全黑暗半凝固培養(yǎng)基分化和增殖、胚狀體常溫高光照固體培養(yǎng)基分化成苗、分化苗棉花濾紙橋生根等方法，成功獲得了可持續(xù)增殖培養(yǎng)的藍(lán)莓胚性愈傷組織，目前繼續(xù)繼代20次以上仍然保持旺盛的增殖能力，系統(tǒng)解決了藍(lán)莓體細(xì)胞培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化所需的穩(wěn)定中間體及其增殖問題，同時(shí)建立了藍(lán)莓體細(xì)胞胚的間接再生完整技術(shù)體系。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

(1)藍(lán)莓愈傷組織誘導(dǎo)階段和增殖培養(yǎng)階段均采用低溫培養(yǎng)，降低了愈傷組織誘導(dǎo)過程中的非胚性愈傷組織的增殖速度，減少了高溫和長期不繼代引起的褐變風(fēng)險(xiǎn)。低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)有利于胚性細(xì)胞的增殖和發(fā)育在藍(lán)莓這一樹種上得到驗(yàn)證，也值得其他植物材料在誘導(dǎo)胚性愈傷組織時(shí)借鑒。

(2)采用1000±100lx低光照和延長繼代培養(yǎng)時(shí)間，愈傷組織在低光照和液體培養(yǎng)基水分減少引起的緩慢脫水條件下促使其向胚性愈傷組織轉(zhuǎn)變，又不至于誘導(dǎo)成苗，同時(shí)液體培養(yǎng)基減少了長期不繼代時(shí)有害物質(zhì)的積累，又保證了養(yǎng)分的供應(yīng)；

(3)激素配比是胚性愈傷組織誘導(dǎo)和增殖的關(guān)鍵，采用的四種細(xì)胞分裂素低濃度配合使用，發(fā)揮各自作用，較好的維持了胚性愈傷組織的愈傷組織狀態(tài)，不至于分化成苗，增殖階段將其濃度適當(dāng)提高(加倍)，更加有利于其在誘導(dǎo)成功后的增殖；

(4)以適當(dāng)?shù)募?xì)胞分裂素與生長素的配比，改變培養(yǎng)條件為固體培養(yǎng)基、常溫、組培全光照條件，接下來順理成章的誘導(dǎo)胚狀體分化成苗。

(5)生根采用棉花濾紙橋作為支持物的室內(nèi)瓶外生根方法，使用了添加含有低濃度生長素IBA的生根營養(yǎng)液，生根率高，保持了濕度無需每天加水操作方便，生根苗不粘有培養(yǎng)基和其他基質(zhì)，移栽效率較高，顯著降低了人工成本。

附圖說明

圖1為非胚性愈傷組織；

圖2為質(zhì)地堅(jiān)實(shí)的愈傷組織(瘤狀愈傷組織)；

圖3為松散型胚性愈傷組織形成期；

圖4為松散胚性愈傷組織；

圖5為胚性愈傷組織誘導(dǎo)出苗；

圖6為愈傷組織誘導(dǎo)；

圖7為瘤狀愈傷組織培養(yǎng)；

圖8為松散型胚性愈傷組織培養(yǎng)；

圖9為成苗培養(yǎng)；

圖10為胚性愈傷組織切片。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例子，對本發(fā)明的實(shí)現(xiàn)方法進(jìn)行詳細(xì)描述。

一、四種培養(yǎng)基的制備

本發(fā)明所述用于高叢藍(lán)莓體細(xì)胞胚間接再生的培養(yǎng)基，包括用于高叢藍(lán)莓體細(xì)胞胚間接再生中不同培養(yǎng)階段的四種培養(yǎng)基，分別是：(1)高叢藍(lán)莓愈傷組織碳饑餓液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基、(2)高叢藍(lán)莓胚性愈傷組織誘導(dǎo)及增殖半凝固培養(yǎng)基、(3)高叢藍(lán)莓體細(xì)胞胚的成熟分化、成苗再生的有機(jī)物培養(yǎng)基、(4)高叢藍(lán)莓分化苗的生根培養(yǎng)基。

四種培養(yǎng)基的配制示例如下：

實(shí)施例1

(1)高叢藍(lán)莓愈傷組織碳饑餓液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基：在改良1/2MS基本培養(yǎng)基中添加ZT 0.5mg/L、TDZ0.1mg/L、2-ip 0.25mg/L和CPPU 0.75mg/L，繼續(xù)添加蔗糖5g/L，不加瓊脂，調(diào)節(jié)pH為5.0；

(2)高叢藍(lán)莓胚性愈傷組織誘導(dǎo)及增殖半凝固培養(yǎng)基：在改良1/2MS基本培養(yǎng)基中添加ZT 1mg/L、TDZ0.2mg/L、2-ip 0.5mg/L和CPPU 1.5mg/L，繼續(xù)添加蔗糖30g/L，瓊脂3g/L，調(diào)節(jié)pH為5.0；

(3)高叢藍(lán)莓體細(xì)胞胚的成熟分化、成苗再生的有機(jī)物培養(yǎng)基：在改良1/2MS基本培養(yǎng)基中添加ZT 1mg/L和IBA 0.1mg/L，繼續(xù)附加蔗糖20g/L、椰乳100mg/L、AC 0.5g/L、瓊脂5g/L，調(diào)節(jié)pH為5.0；

(4)高叢藍(lán)莓分化苗的生根培養(yǎng)基：在改良1/6MS基本培養(yǎng)基中添加IBA 1.0mg/L、蔗糖3.5g/L、AC 0.5g/L，不加瓊脂，調(diào)節(jié)pH為5.0；

實(shí)施例2

(1)高叢藍(lán)莓愈傷組織碳饑餓液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基：添加ZT 0.7mg/L、TDZ0.15mg/L、蔗糖8g/L，其余與實(shí)施例1相同；

(2)高叢藍(lán)莓胚性愈傷組織誘導(dǎo)及增殖半凝固培養(yǎng)基：添加瓊脂4g/L，其余與實(shí)施例1相同；

(3)高叢藍(lán)莓體細(xì)胞胚的成熟分化、成苗再生的有機(jī)物培養(yǎng)基：添加ZT 1.6mg/L瓊脂6g/L，其余與實(shí)施例1相同；

(4)高叢藍(lán)莓分化苗的生根培養(yǎng)基：與實(shí)施例1相同；

實(shí)施例3

(1)高叢藍(lán)莓愈傷組織碳饑餓液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基：添加ZT 1.0mg/L、TDZ0.25mg/L、蔗糖10g/L，其余與實(shí)施例1相同；

(2)高叢藍(lán)莓胚性愈傷組織誘導(dǎo)及增殖半凝固培養(yǎng)基：添加瓊脂5g/L，其余與實(shí)施例1相同；

(3)高叢藍(lán)莓體細(xì)胞胚的成熟分化、成苗再生的有機(jī)物培養(yǎng)基：添加ZT 2.0mg/L、瓊脂7g/L，其余與實(shí)施例1相同；

(4)高叢藍(lán)莓分化苗的生根培養(yǎng)基：與實(shí)施例1相同。

上述各實(shí)施例中：

改良1/2MS基本培養(yǎng)基具體配方為：

大量元素：NH₄NO₃ 825mg/L，KNO₃ 950mg/L，CaCl₂·2H₂O 220mg/L，MgSO₄·7H₂O 185mg/L，KH₂PO₄ 85mg/L；

微量元素：KI 0.83mg/L，H₃BO₃ 6.2mg/L，MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，Na₂MnO₄·2H₂O 0.25mg/L CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O 27.8mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg/L；

有機(jī)成分：肌醇100mg/L，煙酸0.5mg/L，鹽酸吡哆醇0.5mg/L，鹽酸硫胺素0.5mg/L，甘氨酸2mg/L；

改良1/6MS基本培養(yǎng)基是對MS培養(yǎng)基的配方中大量元素進(jìn)行了調(diào)整，其中大量元素減至原配方的1/6，微量元素不變，有機(jī)物調(diào)整為原配方的1/5；具體配方為：

大量元素：NH₄NO₃ 275mg/L，KNO₃ 317mg/L，CaCl₂·2H₂O 73mg/L，MgSO₄·7H2O 62mg/L，KH₂PO₄ 28.3mg/L；

微量元素：KI 0.83mg/L，H₃BO₃ 6.2mg/L，MnSO₄·4H₂O 22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg/L，Na₂MnO₄·2H₂O 0.25mg/L CuSO₄·5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.025mg/L，F(xiàn)eSO₄·7H2O 27.8mg/L，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg/L；

有機(jī)成分：肌醇20mg/L，煙酸0.1mg/L，鹽酸吡哆醇0.1mg/L，鹽酸硫胺素0.1mg/L，甘氨酸0.4mg/L。

二、高叢藍(lán)莓體細(xì)胞胚間接再生的培養(yǎng)方法

利用本發(fā)明所述培養(yǎng)基進(jìn)行高叢藍(lán)莓體細(xì)胞胚間接再生的培養(yǎng)方法，包括下述步驟：

(1)按實(shí)施例2中所述配方配制四種培養(yǎng)基；

(2)選材與處理：

在無菌操作條件下，取增殖旺盛的高叢藍(lán)莓無菌試管苗，將其上部幼嫩部分剪切成長度為1cm、帶葉柄的莖段；

(3)愈傷組織低溫弱光液體淺層培養(yǎng)：

將所述高叢藍(lán)莓愈傷組織碳饑餓液體誘導(dǎo)培養(yǎng)基分裝到200ml的三角瓶中，每瓶10ml，以塑料透氣膜扎口，作為液體淺層培養(yǎng)基；在無菌操作條件下，將10株幼嫩部分的莖段接入液體淺層培養(yǎng)基，在溫度18±2℃、光照強(qiáng)度1000±100lx，光照時(shí)間12h/d的條件下連續(xù)培養(yǎng)3個(gè)月(如圖2，6)；培養(yǎng)材料不進(jìn)行繼代轉(zhuǎn)接，經(jīng)培養(yǎng)生成愈傷組織材料；

(4)藍(lán)莓胚性愈傷組織半凝固培養(yǎng)基低溫、黑暗分化增殖培養(yǎng)：

將所述高叢藍(lán)莓胚性愈傷組織誘導(dǎo)及增殖半凝固培養(yǎng)基分裝到9×9cm的培養(yǎng)皿中，在無菌操作條件下，將步驟(3)中獲得的愈傷組織材料(如圖3)切割分離，并挑選呈現(xiàn)黃綠色的愈傷組織(如圖4)；剔除殘存的莖段、出芽以及褐變的部分，接種于高叢藍(lán)莓胚性愈傷組織誘導(dǎo)及增殖半凝固培養(yǎng)基(如圖7)，繼續(xù)在溫度18±2℃，全黑暗條件下培養(yǎng)3個(gè)月，每3周繼代一次，每次繼代繼續(xù)挑選呈現(xiàn)黃綠色、松散、易碎的愈傷組織繼續(xù)繼代培養(yǎng)，獲得胚性愈傷組織(如圖8)；

(5)藍(lán)莓胚狀體固體培養(yǎng)基全光、高溫分化成苗培養(yǎng)：

將所述高叢藍(lán)莓體細(xì)胞胚的成熟分化、成苗再生的有機(jī)物培養(yǎng)基分裝于容量為200ml以上的罐頭瓶中，挑選步驟(4)中獲得的增殖旺盛、組織質(zhì)地松散且未褐變的胚性愈傷組織，接種于有機(jī)物培養(yǎng)基，在溫度25±1℃、光照強(qiáng)度2000±100lx的條件下培養(yǎng)3個(gè)月，每4周繼代一次，獲得藍(lán)莓芽苗(如圖5，9)；

(6)藍(lán)莓生根苗培養(yǎng)：

取12×12cm培養(yǎng)皿，在底部先墊入脫脂棉，然后覆蓋大小相近的濾紙；將高叢藍(lán)莓分化苗的生根培養(yǎng)基分裝于培養(yǎng)皿中，分裝量以浸濕脫脂棉和濾紙為準(zhǔn)；剪取健壯的藍(lán)莓芽苗置于培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿接種15株；在溫度25±1℃的條件下，黑暗培養(yǎng)7天；再置于光照強(qiáng)度2000±100lx條件下，培養(yǎng)21天，獲得藍(lán)莓生根苗。