本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術領域。更具體地說，本發(fā)明涉及一種用靈發(fā)素誘導煙草葉片再生植株的方法。
背景技術：
煙草是重要的經(jīng)濟作物，也是植物生物技術研究重要的模式植物。所以，其植株再生技術的建立和批量生產“再生植株”(試管苗)對品種性狀改良，良種快繁推廣，特別是對定向獲得性的確切驗證，都具有重要的理論意義和實踐意義。通過組織培養(yǎng)建立獲得煙草再生植株技術體系的報導已有不少，其共同的突出缺點是程序繁雜，一般都分3個階段：1、由不同的原始外植體(花粉、子房、子葉、胚軸、莖段、葉片、原生質體，等)誘導出愈傷組織；2、由愈傷組織誘導出不定芽(即無根苗)；3、由無根苗誘導出不定根，才能得到根苗齊全的完整再生植株。每一個階段，都需要分別配制組成分(多為2-4種)及其相對比例皆不相同的培養(yǎng)基(誘導芽以細胞分裂素cytokinin為主，誘導根則以生長素auxin為主)，有時在同一個階段還要連續(xù)繼代培養(yǎng)數(shù)代，才能達到目標進入下一個階段。而且在不同階段，對培養(yǎng)環(huán)境條件的要求也不盡相同。因此，建立快速、簡單、高效的煙草再生植株技術體系備受關注。
在各種不同的外植體中，以葉片最容易獲得。李勝彬等人研究發(fā)表了關于煙草葉片直接再生植株及抗生素耐受性研究，其以5cm2葉切片為外植體，用MS固體培養(yǎng)基，添加復合誘導劑6-BA(N6-芐基腺嘌呤)0.1-0.5mg/L和IAA(吲哚乙酸)0.5mg/L，培養(yǎng)20d，每個切片收獲再生植株5-10個，平均7.5個/切片。比以往技術有顯著進步。但是，仍存在以下兩個問題：①誘導劑仍需要2個成分復配；②實際收獲再生植株數(shù)量不多，每個切片平均每天僅獲得0.375個再生植株。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點。
本發(fā)明還有一個目的是提供一種用靈發(fā)素誘導煙草葉片再生植株的方法，其能夠簡化了培養(yǎng)基的配制，具有操作簡單誘導再生植株速度快、產量高、質量好的優(yōu)點。
為了實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點，提供了一種用靈發(fā)素誘導煙草葉片再生植株的方法，取煙草葉片外植體，接種至添加有靈發(fā)素的MS固體培養(yǎng)基中，調節(jié)pH至5.8-6.0，培養(yǎng)30天，獲得煙草再生植株。
優(yōu)選的是，所述的用靈發(fā)素誘導煙草葉片再生植株的方法，靈發(fā)素的濃度為3.0-5.0mg/L。
優(yōu)選的是，所述的用靈發(fā)素誘導煙草葉片再生植株的方法，靈發(fā)素的濃度為4.5mg/L。
優(yōu)選的是，所述的用靈發(fā)素誘導煙草葉片再生植株的方法，添加有靈發(fā)素的MS固體培養(yǎng)基經(jīng)過無菌處理。
優(yōu)選的是，所述的用靈發(fā)素誘導煙草葉片再生植株的方法，所述煙草葉片外植體的獲取方法為：煙草種子獲得煙草無菌植株，長至5、6片葉時，取其自上而下的第3片葉，切除葉柄以上2mm、葉尖以下2mm的葉片部分，沿主脈兩側分切成方形切片，作煙草葉片外植體。
優(yōu)選的是，所述的用靈發(fā)素誘導煙草葉片再生植株的方法，沿主脈兩側分切成5mm×5mm的切片作煙草葉片外植體。
優(yōu)選的是，所述的用靈發(fā)素誘導煙草葉片再生植株的方法，煙草葉片外植體的獲取在無菌條件下進行。
本發(fā)明至少包括以下有益效果：
第一、本發(fā)明針對雙子葉植物煙草的生物學特性，通過添加同時具有細胞分裂素和生長素生物活性的靈發(fā)素作唯一的誘導劑，激發(fā)誘導外植體內源相關活性物質的代謝方向與強度，形成一個適合葉片外植體植株再生的實時內環(huán)境，才能實現(xiàn)葉片外植體的植株再生；
第二、本發(fā)明經(jīng)過反復的試驗，確定靈發(fā)素的有效以及最適宜的濃度范圍，既能夠得到好的誘導效果，又不會在培養(yǎng)期間使培養(yǎng)材料發(fā)生褐化或玻璃化，中途無需更換新的培養(yǎng)基，同時避免多種植物生長調節(jié)劑的復配造成的步驟繁瑣和人力物力的浪費；
第三、本發(fā)明用葉片外植體收獲的再生植株，以每天、每1cm2面積計算其生產效率，可達到現(xiàn)有技術(李勝彬等2010年的方法)的1.7倍，而且質量更好(見表1)。
本發(fā)明的其它優(yōu)點、目標和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實踐而為本領域的技術人員所理解。
具體實施方式
下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據(jù)以實施。
需要說明的是，下述實施方案中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法，所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
實施例1：
一種用靈發(fā)素誘導煙草葉片再生植株的方法，包括以下步驟：
步驟一、誘導培養(yǎng)基制備：以MS為基本培養(yǎng)基，以靈發(fā)素作為唯一誘導劑，添加靈發(fā)素3.0mg/L，調整培養(yǎng)基pH為5.8-6.0，滅菌后備用；
步驟二、外植體準備：取由煙草種子獲得的無菌煙草植株，在無菌條件下，將煙草葉片切成方形切片作為外植體，備用，方形切片可切成大小約為5mm×5mm；
步驟三、接種培養(yǎng)與記錄：將步驟二獲得的煙草葉片外植體在無菌條件下接入步驟一的誘導培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)30天。
實施例2：
一種用靈發(fā)素誘導煙草葉片再生植株的方法，包括以下步驟：
步驟一、誘導培養(yǎng)基制備：以MS為基本培養(yǎng)基，以靈發(fā)素作為唯一誘導劑，添加靈發(fā)素4.5mg/L，調整培養(yǎng)基pH為5.8-6.0，滅菌后備用；
步驟二、外植體準備：按常規(guī)方法用煙草種子獲得無菌煙草植株，長至5、6片葉時，取其自上而下的第3片葉，在無菌條件下，切除葉柄以上2mm葉片部分和葉尖以下2mm葉片部分，再沿主脈兩側分切成方形切片，作煙草葉片外植體，方形切片可以切成大小約為5mm×5mm，備用，需要說明的是，前述的沿主脈切片是指棄用了葉片左右兩側的邊緣葉片部分，只要主脈兩側的葉片部分；
步驟三、接種培養(yǎng)與記錄：將步驟二獲得的煙草葉片外植體在無菌條件下接入步驟一的誘導培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)30天。
實施例3：
一種用靈發(fā)素誘導煙草葉片再生植株的方法，包括以下步驟：
步驟一、誘導培養(yǎng)基制備：以MS為基本培養(yǎng)基，以靈發(fā)素作為唯一誘導劑，添加靈發(fā)素5.0mg/L，調整培養(yǎng)基pH為5.8-6.0，滅菌后備用；
步驟二、外植體準備：按常規(guī)方法用煙草種子獲得無菌煙草植株，長至5、6片葉時，取其自上而下的第3片葉，在無菌條件下，切除葉柄以上2mm葉片部分和葉尖以下2mm葉片部分，再沿主脈兩側分切成方形切片，作煙草葉片外植體，方形切片可以切成大小約為5mm×5mm，備用，需要說明的是，前述的沿主脈切片是指棄用了葉片左右兩側的邊緣葉片部分，只要主脈兩側的葉片部分；
步驟三、接種培養(yǎng)與記錄：將步驟二獲得的煙草葉片外植體在無菌條件下接入步驟一的誘導培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)30天。
對比例1：
為了說明本發(fā)明的用靈發(fā)素誘導煙草葉片再生植株的方法的效果，本發(fā)明的發(fā)明人以實施例3的方法，將誘導培養(yǎng)基中的靈發(fā)素濃度依次設定為：3.0mg/L，3.5mg/L，4.0mg/L，4.5mg/L和5.0mg/L，并以參考李勝彬等2010年的技術配方下得到的培養(yǎng)基(其配方為：MS+IAA0.5mg/L+6-BA0.1mg/L)為對照組(CK)，培養(yǎng)基均調pH5.8-6.0，常規(guī)滅菌，在上述6組試驗中每組接種10瓶，每瓶接種2個方形切片的煙草葉片外植體(煙草葉片外植體獲取方法同實施例3)，按照實施例3的方法培養(yǎng)30天終止試驗；
對對比例1的6組試驗獲得的煙草葉片再生植株，每組隨機各取5瓶無污染者，統(tǒng)計：植株發(fā)生率＝發(fā)生再生植株切片數(shù)/接種切片數(shù)×100％；株數(shù)/切片、葉片數(shù)/株、根數(shù)/株。記錄3批次平均值。結果如表1所示。
表1.不同濃度靈發(fā)素誘導煙草葉片再生植株的效果及其與傳統(tǒng)技術(CK)的對比
表1中，序號6(CK)的配方參考李勝彬，等(2010)的研究結果擬定；葉片以展開成扇形者計數(shù)；根以肉眼可辨其長度(≥2mm)者計數(shù)。
由表1中6個案例對比得到，用靈發(fā)素單一誘導劑配制的煙草再生植株誘導培養(yǎng)基，其效果全面優(yōu)于由IAA(吲哚乙酸)和6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)復配成的傳統(tǒng)誘導培養(yǎng)基：①在有效濃度之內，再生植株發(fā)生率(％)普遍高于CK組；②每個外植體切片(0.25cm2)日均獲得株數(shù)平均是CK組的1.7倍[解釋：(0.23+0.28+0.30+0.34+0.34)/5/0.18＝1.66≈1.7]，最佳濃度4.5mg/L則達CK組的1.9倍(解釋：0.34/0.18＝1.89≈1.9)。若將切片面積換算成1.00cm2，則每1.00cm2葉片外植體每天平均收獲再生植株可達1.19個[解釋：(0.23+0.28+0.30+0.34+0.34)×4/5＝1.19]，是李勝彬，等(2010年)方法0.75個的1.6倍；③單株葉片數(shù)和根數(shù)都超過CK組，而且達到生產用苗的標準。所以，本發(fā)明所建立的技術方法是一種簡單、高效、優(yōu)質生產煙草再生植株的方法，具有實用價值。
這里說明的設備數(shù)量和處理規(guī)模是用來簡化本發(fā)明的說明的。對本發(fā)明的應用、修改和變化對本領域的技術人員來說是顯而易見的。
盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的實施例。