本發(fā)明涉及一種細(xì)胞凍存液，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：細(xì)胞凍存液是細(xì)胞凍存過程中的核心試劑，關(guān)系到細(xì)胞儲(chǔ)存質(zhì)量和復(fù)蘇后細(xì)胞數(shù)量及活性問題。細(xì)胞凍存對(duì)細(xì)胞的危害來源于：降溫過程中，電解質(zhì)的變化和細(xì)胞內(nèi)外的結(jié)晶?，F(xiàn)有的細(xì)胞凍存液，大都是異種血清、二甲基亞砜和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的混合液。因異種血清成分復(fù)雜，引入的外源蛋白會(huì)增加細(xì)胞污染和過敏的風(fēng)險(xiǎn)，不適用于臨床。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞凍存液，其不僅能夠有效減少細(xì)胞凍存對(duì)細(xì)胞的危害，而且可在臨床上安全使用。為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：一種細(xì)胞凍存液，其特征在于，以質(zhì)量百分比計(jì)，各組成成分及用量分別為：本發(fā)明的有益之處在于：(1)凍存液中含有二甲基亞砜和右旋糖酐40，其中，前者是有效的滲透保護(hù)劑，后者可以平衡細(xì)胞滲透壓，降低細(xì)胞冰點(diǎn)，有效減少結(jié)晶對(duì)細(xì)胞的傷害；(2)凍存液中含有人血白蛋白，可大大提高凍存細(xì)胞的復(fù)蘇率；(3)凍存液中不含非人源的血清和蛋白質(zhì)，避免了細(xì)胞污染和過敏的風(fēng)險(xiǎn)，提高了臨床安全性，可在臨床上安全使用；(4)適用范圍廣，可用于外周血單核細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、骨髓血干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞等多種人源細(xì)胞的凍存；(5)凍存濃度范圍比較廣，可以凍存0.5-2.5×107/ml濃度比的細(xì)胞；(6)可現(xiàn)配現(xiàn)用，也可低溫或室溫保存三個(gè)月。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作具體的介紹。一、準(zhǔn)備各相關(guān)試劑表1各組的組成成分及用量現(xiàn)有的細(xì)胞凍存液，大都是異種血清、二甲基亞砜和基礎(chǔ)培養(yǎng)基的混合液。因異種血清成分復(fù)雜，引入的外源蛋白會(huì)增加細(xì)胞污染和過敏的風(fēng)險(xiǎn)，所以不適用于臨床。而在本發(fā)明的凍存液中，我們未使用非人源的血清和蛋白質(zhì)，所以避免了細(xì)胞污染和過敏的風(fēng)險(xiǎn)，提高了臨床安全性，可在臨床上安全使用。本發(fā)明的凍存液中含有二甲基亞砜和右旋糖酐40，其中，前者是有效的滲透保護(hù)劑，后者可以平衡細(xì)胞滲透壓，降低細(xì)胞冰點(diǎn)，有效減少結(jié)晶對(duì)細(xì)胞的傷害。此外，本發(fā)明的凍存液中還含有人血白蛋白，可大大提高凍存細(xì)胞的復(fù)蘇率。二、制備方法準(zhǔn)備基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基，購自美國Life公司)、人血白蛋白(購自武漢禾元生物)、二甲基亞砜(購自sigma)、右旋糖酐40(購自四川科倫藥業(yè))。在百級(jí)無菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行相關(guān)試劑的配制。三、使用方法細(xì)胞計(jì)數(shù)后，直接使用本發(fā)明的凍存液進(jìn)行細(xì)胞重懸，密度為0.5-2.5×107/ml。四、凍存效果選用骨髓干細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。收集足量的骨髓干細(xì)胞，用前述不同組分組合配制的凍存液(現(xiàn)配)進(jìn)行細(xì)胞重懸，將符合密度要求(1.5×107/ml)的細(xì)胞裝入凍存管。使用程序梯度降溫儀給凍存管進(jìn)行降溫，之后轉(zhuǎn)入-196℃液氮環(huán)境。凍存一段時(shí)間后，進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，觀察各組細(xì)胞的復(fù)蘇情況。1、觀察骨髓干細(xì)胞的特性凍存一周，然后復(fù)蘇，觀察骨髓干細(xì)胞的特性。觀察結(jié)果顯示：(1)骨髓干細(xì)胞保持了很高的增殖活力。(2)骨髓干細(xì)胞形態(tài)穩(wěn)定，沒有發(fā)生重大變化。2、測定骨髓干細(xì)胞的安全凍存時(shí)間凍存一周、一個(gè)月、兩年，然后復(fù)蘇，計(jì)算各組細(xì)胞的復(fù)蘇率。計(jì)算結(jié)果見表2。表2各組細(xì)胞的復(fù)蘇率一周后細(xì)胞復(fù)蘇率一個(gè)月后細(xì)胞復(fù)蘇率兩年后細(xì)胞復(fù)蘇率第1組69％60％41％第2組70％60％42％第3組67％59％40％第4組82％79％75％第5組84％80％77％第6組80％77％75％第7組90％88％86％第8組92％90％87％第9組89％87％85％由表2可知：(1)凍存一周，第8組凍存液的凍存效果最好，細(xì)胞復(fù)蘇率高達(dá)92％，而第3組凍存液的細(xì)胞復(fù)蘇率僅為67％；(2)凍存一個(gè)月，第8組凍存液的凍存效果最好，細(xì)胞復(fù)蘇率高達(dá)90％，而第3組凍存液的細(xì)胞復(fù)蘇率僅為59％；(3)凍存兩年，第8組凍存液的凍存效果最好，細(xì)胞復(fù)蘇率高達(dá)87％，而第1組凍存液的細(xì)胞復(fù)蘇率僅為40％。以上試驗(yàn)結(jié)果說明：(1)本發(fā)明的細(xì)胞凍存液，通過添加二甲基亞砜和右旋糖酐40，可以平衡細(xì)胞滲透壓，降低細(xì)胞冰點(diǎn)，有效減少結(jié)晶對(duì)細(xì)胞的傷害，從而可以長期安全保存細(xì)胞，凍存兩年細(xì)胞復(fù)蘇率仍高達(dá)87％；(2)發(fā)明的細(xì)胞凍存液，通過添加人血白蛋白，大大提高了凍存細(xì)胞的復(fù)蘇率，凍存一周細(xì)胞復(fù)蘇率高達(dá)92％，凍存一個(gè)月細(xì)胞復(fù)蘇率高達(dá)90％。此外，經(jīng)試驗(yàn)，將本發(fā)明的細(xì)胞凍存液分別在室溫和低溫(4℃)條件下保存三個(gè)月后再用來凍存細(xì)胞，其仍可以獲得與現(xiàn)配凍存液相近的使用效果。五、適用的細(xì)胞類型選用外周血單核細(xì)胞、臍帶血干細(xì)胞、骨髓血干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞共計(jì)4種人源細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。選用凍存效果最好的第8組凍存液(現(xiàn)配)。采用與第四步相同的試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表3。表3針對(duì)不同類型的細(xì)胞凍存液的凍存效果細(xì)胞名稱一周后細(xì)胞復(fù)蘇率一個(gè)月后細(xì)胞復(fù)蘇率外周血單核細(xì)胞93％91％臍帶血干細(xì)胞91％90％骨髓血干細(xì)胞92％90％脂肪干細(xì)胞92％91％由表3可知：對(duì)于不同類型的細(xì)胞，使用本發(fā)明的細(xì)胞凍存液凍存一周，細(xì)胞復(fù)蘇率最小的也能達(dá)到91％；凍存一個(gè)月，細(xì)胞復(fù)蘇率最小的也能達(dá)到90％。以上試驗(yàn)結(jié)果說明：本發(fā)明的細(xì)胞凍存液適用的細(xì)胞類型不限。需要說明的是，上述實(shí)施例不以任何形式限制本發(fā)明，凡采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3