本發(fā)明屬于綿羊冷凍精液
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種通過添加谷胱甘肽(GSH)和過氧化氫酶(CAT)，有效保護(hù)綿羊精子在冷凍、解凍過程中受到氧化損傷，提高精子解凍后活力與延長精子存活時間，從而達(dá)到受精受胎的目的的一種含谷胱甘肽和過氧化氫酶的綿羊冷凍精液制備方法。
背景技術(shù)：
：在過去的50年中冷凍精液技術(shù)迅猛發(fā)展，不同動物的精液冷凍都獲得了較快的進(jìn)展，牛的冷凍精液已經(jīng)進(jìn)入了產(chǎn)業(yè)化。綿羊的精子與其他家畜相比具有一定生理特性，冷凍后活力低、受胎率低，且不穩(wěn)定，成為制約綿羊冷凍精子發(fā)展的桎梏。為了提高綿羊冷凍精液解凍后活力以及存活時間，提升綿羊冷凍精液品質(zhì)，研究開發(fā)了添加抗氧化劑GSH和CAT的綿羊冷凍精液的制備方法。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種含谷胱甘肽和過氧化氫酶的綿羊冷凍精液制備方法，該技術(shù)原理是利用抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)和過氧化氫酶(CAT)能夠抵抗攜帶有自由基的活性氧族(ROS)特點，在綿羊精子冷凍的過程中添加GSH和CAT，降低活性氧族對綿羊精子造成的過氧化損傷的作用，從而提高解凍后精子活力和延長精子存活時間，達(dá)到受精受胎的目的。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種含谷胱甘肽和過氧化氫酶的綿羊冷凍精液制備方法，其特征在于：它包括以下步驟：(1)、谷胱甘肽GSH液和過氧化氫酶CAT液的配置：稱取30.73mg的谷胱甘肽GSH加入1ml的蒸餾水，室溫溶解；稱取4.2mg的過氧化氫酶CAT加入1ml的蒸餾水，室溫溶解；(2)、谷胱甘肽GSH液和過氧化氫酶CAT液的保存：谷胱甘肽GSH完全溶解后避光保存在-20℃，保存期限為一月；過氧化氫酶CAT完全溶解后避光保存在-20℃，保存期限為一周；(3)、花生凝集素FITC-PNA染液的配置：將1mg花生凝集素FITC-PNA溶于10mlPBS緩沖液中，然后分裝避光保存在-20℃；(4)、PVP液的配置：3gPVP溶于100mlPBS緩沖液中；(5)、PBS緩沖液：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.15g，KH2PO40.2g，用超純水溶解，定容到1L，將溶液的酸堿度調(diào)到pH＝7.4；0.22μm濾器過濾分裝，4℃保存?zhèn)溆茫?6)、Tris-A、Tris-B的配置：超純水超純水(7)、精液檢查：①外觀評定1)射精量：采精后，將綿羊精液倒入有刻度的離心管中觀察即可；2)云霧運動：用肉眼觀察新采的公綿羊精液，可以看到由精子活動所引起的翻騰滾動極似云霧狀；精子的密度越大，活力越強者，其云霧狀越明顯；3)色澤：綿羊的正常精液呈乳白色或乳黃色；②活力檢測用移液器從1)的離心管中取適量綿羊精液滴在載玻片上，壓片后置于顯微鏡下鏡檢，活力≥0.6進(jìn)行冷凍；(8)、綿羊精液的抗生素添加與濃度測定①綿羊精液經(jīng)過上述步驟(7)檢查完后，1ml綿羊精液添加0.3mg林可-奇霉素、0.8mg慶大霉素；②將添加好抗生素的綿羊精液用50μm精液過濾器過濾至新的離心管中，過濾后使用密度儀檢測原精實際濃度；(9)、添加抗氧化劑冷凍精液的制備：①在TrisA、TrisB中添加抗氧化劑，添加比例為：1mlTrisA分別添加10μlGSH、5μlCAT，1mlTrisB分別添加10μlGSH、5μlCAT，添加完抗氧化劑后，將TrisA、TrisB各自混合均勻，放在4℃平衡90分鐘；②取步驟(8)測完濃度的綿羊精液，按照精子終濃度計算所需總體積的一半加入等溫的TrisA進(jìn)行稀釋，然后用8-10層紗布包裹放到4℃平衡；③精子4℃平衡，2h后，加入與Tris-A等量的Tris-B，Tris-B分2次間隔15分鐘等量加入離心管中，每次添加后顛倒輕輕搖勻；④裝管和冷凍保存：精子搖勻，按每支250μl，500萬精子裝管，將冷凍精液擺放到冷凍搓板上，然后放入冷凍儀中，按照冷凍儀操作規(guī)程進(jìn)行凍精操作，最后將凍精投入液氮保存；(10)、冷凍精液各項質(zhì)量指標(biāo)檢測：①凍后活力檢測：取一支上述步驟(9)制備的綿羊凍精，在35℃溫水浴中解凍后進(jìn)行檢測，預(yù)先把載玻片和蓋玻片放在37℃加熱板上預(yù)熱10分鐘，用移液器離心管取15μl樣品滴在載玻片上，壓片后置于顯微鏡下鏡檢，選擇壓片均勻的樣品區(qū)域，一個壓片取5個視野，中間1個，四周各取1個，分別計數(shù)活精子數(shù)和死精子數(shù)，并計算活力；活力＝活精子數(shù)/活精子數(shù)與死精子數(shù)的和②凍后存活時間：取一支性控凍精上述步驟(9)制備的綿羊凍精，解凍方法同上，解凍后的樣品在37℃環(huán)境下避光保存，4小時后將細(xì)管中精液轉(zhuǎn)置于1.5ml離心管，用移液器從離心管取15μl樣品滴在準(zhǔn)備好的載玻片上，在顯微鏡自然下光觀察精子存活情況，計數(shù)方法同上；③凍后精子頂體完整性檢測：取一支上述步驟(9)制備的綿羊凍精，解凍方法同上，放到含3％等溫PVP液的離心管內(nèi)，800×g離心6min，棄上清液；沉淀精子用37℃按照步驟(5)配置的PBS緩沖液重懸，調(diào)整精子密度為1～2×106/mL，移液槍吸取30μL精子懸液，涂片，空氣中自然干燥后，用純甲醇固定10min，再加入30μLFITC-PNA染液，37℃黑暗潮濕環(huán)境下孵育30min，之后再用PBS緩沖液沖洗，空氣中自然干燥后加少許增光劑混勻，蓋上蓋玻片，無色指甲油封片后，用400×熒光顯微鏡觀察。本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果是：利用GSH和CAT能夠抵抗攜帶有自由基的活性氧族(ROS)特點，在綿羊精子冷凍、解凍的過程中添加GSH和CAT，降低活性氧族對綿羊精子造成的過氧化損傷的作用，有效保護(hù)綿羊精子冷凍、解凍過程中精子生理機能，從而提高解凍后綿羊精子活力和延長精子存活時間，達(dá)到提高受胎率的目的。具體實施方式實施例：一種含谷胱甘肽和過氧化氫酶的綿羊冷凍精液制備方法，以綿羊冷凍精液為例，它包括以下步驟：1、谷胱甘肽GSH液和過氧化氫酶CAT液的配置：稱取30.73mg的谷胱甘肽GSH加入1ml的蒸餾水，室溫溶解；稱取4.2mg的過氧化氫酶CAT加入1ml的蒸餾水，室溫溶解；2、谷胱甘肽GSH液和過氧化氫酶CAT液的保存：谷胱甘肽GSH完全溶解后避光保存在-20℃，保存期限為一月；過氧化氫酶CAT完全溶解后避光保存在-20℃，保存期限為一周；3、花生凝集素FITC-PNA染液的配置將1mg花生凝集素FITC-PNA溶于10mlPBS緩沖液中，然后分裝避光保存在-20℃；4、PVP液的配置3gPVP溶于100mlPBS緩沖液中；5、PBS緩沖液：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.15g，KH2PO40.2g，用超純水溶解，定容到1L，將溶液的酸堿度調(diào)到pH＝7.4；0.22μm濾器過濾分裝，4℃保存?zhèn)溆茫?、Tris-A、Tris-B的配置超純水超純水7、精液檢查(1)外觀評定1)射精量：采精后，將綿羊精液倒入有刻度的離心管中觀察即可；2)云霧運動：用肉眼觀察新采的公綿羊精液，可以看到由精子活動所引起的翻騰滾動極似云霧狀；精子的密度越大，活力越強者，其云霧狀越明顯；3)色澤：綿羊的正常精液呈乳白色或乳黃色；(2)活力檢測用移液器從上述步驟(1)的離心管中取綿羊精液滴在載玻片上，壓片后置于顯微鏡下鏡檢，活力≥0.6進(jìn)行冷凍；8、綿羊精液的抗生素添加與濃度測定①綿羊精液經(jīng)過上述步驟(7)檢查完后，1ml綿羊精液添加0.3mg林可-奇霉素、0.8mg慶大霉素；②將添加好抗生素的綿羊精液用50μm精液過濾器過濾至新的離心管中，過濾后使用密度儀檢測原精實際濃度，羊1濃度為7.2億/ml，羊2濃度為10.95億/ml；9、添加抗氧化劑冷凍精液的制備(1)在TrisA、TrisB中添加抗氧化劑，添加比例為：1mlTrisA分別添加10μlGSH、5μlCAT,1mlTrisB分別添加10μlGSH、5μlCAT，添加完抗氧化劑后，將TrisA，TrisB各自混合均勻，放在4℃平衡90分鐘；(2)取步驟8測完濃度的羊1、羊2鮮精各1ml，按照精子終濃度2千萬/ml計算所需總體積，羊1體積為7.2÷0.2＝36ml，羊2體積為10.95÷0.2＝54.75ml，羊1加入(36ml-1ml)÷2＝17.5ml，羊2(54.75ml-1ml)÷0.2＝26.875ml等溫的TrisA進(jìn)行稀釋，然后用8-10層紗布包裹放到4℃平衡；(3)精子4℃平衡2h后，加入與Tris-A等量的Tris-B，Tris-B分2次加入，羊1每次加入17.5÷2＝8.75ml，羊2每次加入26.875÷0.2＝13.437ml，兩次間隔15分鐘等量加入離心管中，每次添加后顛倒輕輕搖勻；(4)裝管和冷凍保存：精子搖勻，按每支250μl，500萬精子裝管，將冷凍精液擺放到冷凍搓板上，然后放入冷凍儀中，按照冷凍儀操作規(guī)程進(jìn)行凍精操作，最后將凍精投入液氮保存；10、冷凍精液各項質(zhì)量指標(biāo)檢測：取1支按照上述方法添加抗氧化劑GSH和CAT生產(chǎn)的綿羊冷凍精液，解凍后進(jìn)行各項質(zhì)量指標(biāo)檢測，與此同時，取同一羊號按照常規(guī)方法不添加抗氧化劑GSH和CAT生產(chǎn)的綿羊冷凍精液作為質(zhì)量指標(biāo)對照，綿羊凍精的產(chǎn)品規(guī)格均為0.25ml；鏡檢：各質(zhì)檢指標(biāo)計算方法如下：(1)凍后活力檢測：取一支按以上方法制備的綿羊凍精，在35℃溫水浴中解凍后進(jìn)行檢測，預(yù)先把載玻片和蓋玻片放在37℃加熱板上預(yù)熱10分鐘，用移液器離心管取10μl樣品滴在載玻片上，壓片后置于顯微鏡下鏡檢，選擇壓片均勻的樣品區(qū)域，一個壓片取5個視野，中間1個，四周各取1個，分別計數(shù)活精子數(shù)和死精子數(shù)，并計算活力；活力＝活精子數(shù)/活精子數(shù)與死精子數(shù)的和(2)凍后存活時間：取一支按以上方法制備的綿羊凍精，解凍方法同上，解凍后的樣品在37℃環(huán)境下避光保存，4小時后將細(xì)管中精液轉(zhuǎn)置于1.5ml離心管，用移液器從離心管取10μl樣品滴在準(zhǔn)備好的載玻片上，在顯微鏡自然下光觀察精子存活情況，計數(shù)方法同上；綿羊1精子活力與存活時間分組0h6h12h對照組40.7％(665/1633)17.2％(163/950)0(0/1022))添加組41％(734/1786)28.8％(262/978)9.5％(144/1515)綿羊2精子活力與存活時間分組0h6h12h對照組54％(713/1318)32％(290/899)4.7％(36/760)添加組55％(756/1373)46％(354/765)17.7％(214/1205)(3)凍后精子頂體完整性檢測：取一支按以上方法制備的綿羊凍精，解凍后精液放到含3％等溫PVP液的離心管內(nèi)，800×g離心6min，棄上清液；沉淀精子用37℃的PBS緩沖液重懸，調(diào)整精子密度為1～2×106/mL；移液槍吸取30μL精子懸液，涂片，空氣中自然干燥后，用純甲醇固定10min，再加入30μLFITC-PNA染液，37℃黑暗潮濕環(huán)境下孵育30min；之后再用PBS緩沖液沖洗，空氣中自然干燥后加少許增光劑混勻，蓋上蓋玻片，無色指甲油封片后，用400×熒光顯微鏡觀察。羊1、羊2精子解凍后0h的精子頂體完整率分組羊1頂體完整率羊1頂體完整率對照組64％77％添加組66％73％當(dāng)前第1頁1 2 3