本發(fā)明涉及作物遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種創(chuàng)建金線蓮多倍體資源的方法。

背景技術(shù)：

金線蓮(Anoectochilusroxburghii)即花葉開唇蘭，是蘭科開唇蘭屬的一種多年生草本植物，主要分布于福建、浙江、廣西、江西和臺(tái)灣等地，以福建、臺(tái)灣為主產(chǎn)地。金線蓮是我國(guó)傳統(tǒng)珍貴藥材，有清涼解毒，滋陰降火，消炎止痛等功效，常被用于糖尿病、高血脂、肝炎等慢性疾病的治療，有“藥王”、“金草”等美譽(yù)。此外，金線蓮株型小巧，葉型優(yōu)美，葉脈金黃色或白色呈網(wǎng)狀排列，具有極高的觀賞價(jià)值。近年來，由于市場(chǎng)供不應(yīng)求，人們過度采挖，環(huán)境惡化，金線蓮自然資源日趨枯竭。目前，現(xiàn)有的金線蓮均為二倍體，生長(zhǎng)緩慢，株高僅5～10cm,產(chǎn)量很低，藥效成分更低。植物多倍體化后根、莖、葉等營(yíng)養(yǎng)器官變大，次生代謝物含量提高，因此培育多倍體金線蓮是提高金線蓮藥材產(chǎn)量的途徑之一。

植物多倍體的獲得可通過物理、化學(xué)和生物學(xué)的方法創(chuàng)建。與傳統(tǒng)的物理和化學(xué)法相比，利用生物學(xué)的2n配子途徑創(chuàng)建多倍體具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，不僅可直接獲得三倍體、四倍體等多倍體資源，還可傳遞親本更高的雜合性并能克服雜種不育。2n配子的發(fā)生即可自然發(fā)生，也可人工誘導(dǎo)。目前，人工誘導(dǎo)2n配子發(fā)生的方法主要有溫度激變、氣體誘變、電離輻射等物理法以及秋水仙素、安磺靈、氟樂靈、咖啡堿等化學(xué)誘變法。由于物理、化學(xué)誘導(dǎo)2n配子發(fā)生存在2n配子親和力低下、誘導(dǎo)率低，效率不穩(wěn)定等問題，物理、化學(xué)法誘導(dǎo)2n配子并未能有效地應(yīng)用于育種實(shí)踐。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種創(chuàng)建金線蓮多倍體資源的方法，該方法采用金線蓮為母本，血葉蘭為父本進(jìn)行雜交可以獲得在較短的周期內(nèi)獲得金線蓮多倍體資源，其操作性強(qiáng)、效率離、成本低等特點(diǎn)。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種創(chuàng)建金線蓮多倍體資源的方法，所述的方法具體為：以金線蓮為母本，血葉蘭為父本，通過屬間遠(yuǎn)緣雜交、雜種群體構(gòu)建、2n配子雜種后代的鑒定、2n配子雜種后代的篩選以及2n配子雜種后代的自交后獲得金線蓮多倍體植株。

在上述的創(chuàng)建金線蓮多倍體資源的方法中，所述的屬間遠(yuǎn)緣雜交的具體步驟為：

待母本和父本開花后，取出金線蓮花朵中的花粉塊，將血葉蘭的花粉塊授于金線蓮的蕊腔中。

在上述的創(chuàng)建金線蓮多倍體資源的方法中，雜種群體構(gòu)建的具體方法為：采收經(jīng)過屬間遠(yuǎn)緣雜交獲得的成熟果實(shí)的種子進(jìn)行培養(yǎng)，獲得第一試管苗，將第一試管苗移栽后栽培至植株開花。

在上述的創(chuàng)建金線蓮多倍體資源的方法中，所述的經(jīng)過屬間遠(yuǎn)緣雜交獲得的成熟果實(shí)的種子進(jìn)行培養(yǎng)獲得第一試管苗的具體方法為：將種子均勻撒于種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，在25～28℃條件進(jìn)行暗培養(yǎng)直至種子萌發(fā)。當(dāng)種子苗長(zhǎng)至1～2cm高時(shí)轉(zhuǎn)接至壯苗培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25～28℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx條件下進(jìn)行生根壯苗培養(yǎng)，獲得1～2cm高的第一試管苗。

在上述的創(chuàng)建金線蓮多倍體資源的方法中，2n配子雜種后代的鑒定的具體方法為：鑒定經(jīng)過雜種群體構(gòu)建得到的植株的花朵的成熟花粉，統(tǒng)計(jì)2n花粉的發(fā)生頻率。

在上述的創(chuàng)建金線蓮多倍體資源的方法中，2n配子雜種后代的篩選的具體方法為：對(duì)于2n花粉發(fā)生率大于1％的植株分盆栽培獲得2n花粉發(fā)生率持續(xù)至少2年大于1％的植株確定為2n配子雜種后代。

在上述的創(chuàng)建金線蓮多倍體資源的方法中，2n配子雜種后代自交后還包括將2n配子雜種后代自交后得到的成熟果實(shí)中的種子進(jìn)行培養(yǎng)獲得第二試管苗，篩選獲得金線蓮多倍體植株。

在上述的創(chuàng)建金線蓮多倍體資源的方法中，所述的將2n配子雜種后代自交后得到的成熟果實(shí)中的種子進(jìn)行培養(yǎng)獲得第二試管苗的具體方法為：將2n配子雜種后代自交后得到的成熟果實(shí)中的種子撒于種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，在25～28℃條件進(jìn)行暗培養(yǎng)直至種子萌發(fā)，當(dāng)種子苗長(zhǎng)至1～2cm高時(shí)轉(zhuǎn)接至壯苗培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25～28℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx條件下進(jìn)行生根壯苗培養(yǎng)，待第二試管苗長(zhǎng)至5～8cm并具有2條以上根時(shí)，將培養(yǎng)瓶蓋子打開在室外無直射光的地方放置3～5天后取出第二試管苗。

在上述的創(chuàng)建金線蓮多倍體資源的方法中，從成熟果實(shí)中獲取種子的過程中，包括對(duì)對(duì)成熟果實(shí)進(jìn)行消毒處理，所述的消毒處理的方法具體為：成熟果實(shí)先用自來水沖洗10～20min后，用75％的乙醇浸泡20～40s后置于0.1vol％的升汞溶液中消毒15～30min，無菌水沖洗3～5次晾干后備用。

在上述的創(chuàng)建金線蓮多倍體資源的方法中，所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基為：1/2MS、0.1～1.0mg/LNAA、20～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L瓊脂、50～100ml/L椰子汁，pH為5.4～5.8；

所述的壯苗培養(yǎng)基為：0.5～2.0g/L花寶1號(hào)、0.1～1.0mg/LNAA、20～30g/L蔗糖、3.5～6.0g/L瓊脂、50～100g/L香蕉汁、0.2～0.5g/L活性炭，pH為5.4～5.8。

需要說明的是：50～100g/L香蕉汁是指在1L培養(yǎng)基中，含有50-100g去皮香蕉。

50～100ml/L椰子汁是指1L培養(yǎng)基中，含有50-100ml天然椰汁或與天然椰汁濃度相同或相近的椰汁。

本發(fā)明的有益效果如下：

本發(fā)明利用金線蓮(Anoectochilusroxburghii)×血葉蘭(Ludisiadiscolor)進(jìn)行屬間遠(yuǎn)緣雜交產(chǎn)生2n配子雜種后代的方法，通過親本選配、遠(yuǎn)緣雜交、雜種群體構(gòu)建、2n配子雜種后代的鑒定等步驟，實(shí)現(xiàn)了金線蓮多倍體資源的創(chuàng)建，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。

本發(fā)明的創(chuàng)建金線蓮多倍體資源的方法，包括以下的工藝步驟：

(1)親本選配：在溫室中選取生長(zhǎng)健壯的金線蓮(Anoectochilusroxburghii)作母本，血葉蘭(Ludisiadiscolor)作為父本。

(2)遠(yuǎn)緣雜交：將步驟(1)的親本進(jìn)行精心栽培管理，待親本開花時(shí)用鑷子取出金線蓮當(dāng)天開花花朵中的花粉塊，將血葉蘭的花粉塊授于金線蓮的蕊腔中。

(3)雜種群體構(gòu)建：采收步驟(2)遠(yuǎn)緣雜交獲得的成熟果實(shí)經(jīng)消毒后用解剖刀縱向切開果實(shí)，將種子均勻撒于種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，在25～28℃條件進(jìn)行暗培養(yǎng)直至種子萌發(fā)。當(dāng)種子苗長(zhǎng)至1～2cm高時(shí)轉(zhuǎn)接至壯苗培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25～28℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx條件下進(jìn)行生根壯苗培養(yǎng)。待試管苗長(zhǎng)至5～8cm并具有2條以上根時(shí)，將培養(yǎng)瓶蓋子打開在室外無直射光的地方放置3～5天后取出試管苗移栽于體積比為2:2:1的樹皮、蘭石、泥巖的混合基質(zhì)中，試管苗移栽后精心管理直至植株開花。

(4)2n配子的鑒定：待步驟(3)的植株開花后，采集植株新鮮成熟的花粉，采用直接壓片法制片后于光學(xué)顯微鏡下觀察2n花粉，統(tǒng)計(jì)2n花粉的發(fā)生頻率。

(5)2n配子雜種后代的篩選：對(duì)經(jīng)步驟(4)鑒定的2n花粉發(fā)生率大于1％的植株進(jìn)行分盆栽培，并經(jīng)兩年以上重復(fù)鑒定，篩選出發(fā)生率高且穩(wěn)定的植株即為2n配子雜種后代。

(6)2n配子雜種后代自交：對(duì)步驟(5)獲得的2n配子雜種后代進(jìn)行精心栽培管理，待植株開花后使其自然授粉。

(7)多倍體資源的獲得：采收步驟(6)自交獲得的成熟果實(shí)經(jīng)消毒后用解剖刀縱向切開果實(shí)，將種子均勻撒于種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，在25～28℃條件進(jìn)行暗培養(yǎng)直至種子萌發(fā)。當(dāng)種子苗長(zhǎng)至1～2cm高時(shí)轉(zhuǎn)接至壯苗培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25～28℃，光照強(qiáng)度為1500～2000lx條件下進(jìn)行生根壯苗培養(yǎng)。待試管苗長(zhǎng)至5～8cm并具有2條以上根時(shí)，將培養(yǎng)瓶蓋子打開在室外無直射光的地方放置3～5天后取出試管苗，對(duì)試管苗采用根尖直接壓片法制片后于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，篩選多倍體植株。將篩選得到的多倍體植株移栽于體積比為2:2:1的樹皮、蘭石、泥巖的混合基質(zhì)中栽培成苗即得金線蓮多倍體資源。

步驟(3)和(7)所采用的果實(shí)消毒處理為：采集回實(shí)驗(yàn)室的果實(shí)先自來水沖洗10～20min后，用75％的乙醇浸泡20～40s后置于0.1％的升汞溶液中消毒15～30min，無菌水沖洗3～5次晾干后備用；

步驟(3)和(7)所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基為：1/2MS+0.1～0.5mg/LNAA+20～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L瓊脂+50～100ml/L椰子汁，pH為5.4～5.8；

步驟(3)和(7)所述的壯苗培養(yǎng)基為：0.5～2.0g/L花寶1號(hào)(HYPONeX1)+0.1～1.0mg/LNAA+20～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L瓊脂+50～100g/L香蕉汁+0.2～0.5g/L活性炭，pH為5.4～5.8。

為了進(jìn)一步的對(duì)本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)進(jìn)行說明，本發(fā)明提供以下實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的論證。

實(shí)施例一

(1)親本選配：在溫室中選取生長(zhǎng)健壯的福建產(chǎn)金線蓮(Anoectochilusroxburghii)作母本，廣西產(chǎn)血葉蘭(Ludisiadiscolor)作為父本。

(2)遠(yuǎn)緣雜交：將步驟(1)的親本進(jìn)行精心栽培管理，待親本開花時(shí)用鑷子取出金線蓮當(dāng)天開花花朵中的花粉塊，將血葉蘭的花粉塊授于金線蓮的蕊腔中。授粉3～4個(gè)月后，結(jié)實(shí)率為43.6％。

(3)雜種群體構(gòu)建：采收步驟(2)遠(yuǎn)緣雜交獲得的成熟果實(shí)于自來水沖洗10min后，用75％的乙醇浸泡20s后置于0.1％的升汞溶液中消毒15min，無菌水沖洗3次晾干后用解剖刀縱向切開果實(shí)，將種子均勻撒于種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，在25℃條件進(jìn)行暗培養(yǎng)120天后種子開始萌發(fā)，萌發(fā)率為56.3％。當(dāng)種子苗長(zhǎng)至1～2cm高時(shí)轉(zhuǎn)接至壯苗培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為1500lx條件下進(jìn)行生根壯苗培養(yǎng)。待試管苗長(zhǎng)至5～8cm并具有2條以上根時(shí)，將培養(yǎng)瓶蓋子打開在室外無直射光的地方放置3天后取出試管苗移栽于體積比為2:2:1的樹皮、蘭石、泥巖的混合基質(zhì)中，試管苗移栽后精心管理直至植株開花。

(4)2n配子的鑒定：待步驟(3)的植株開花后，采集植株新鮮成熟的花粉，采用直接壓片法制片后于光學(xué)顯微鏡下觀察2n花粉，統(tǒng)計(jì)2n花粉的發(fā)生頻率。雜交后代的2n配子發(fā)生率最高達(dá)到2.13％。

(5)2n配子雜種后代的篩選：對(duì)經(jīng)步驟(4)鑒定的2n花粉發(fā)生率大于1％的植株進(jìn)行分盆栽培，并經(jīng)兩年以上重復(fù)鑒定，篩選出發(fā)生率高且穩(wěn)定的植株即為2n配子雜種后代。

(6)2n配子雜種后代自交：對(duì)步驟(5)獲得的2n配子雜種后代進(jìn)行精心栽培管理，待植株開花后使其自然授粉。授粉3～4個(gè)月后，結(jié)實(shí)率為56.4％。

(7)多倍體資源的獲得：采收步驟(6)自交獲得的成熟果實(shí)于自來水沖洗10min后，用75％的乙醇浸泡20s后置于0.1％的升汞溶液中消毒15min，無菌水沖洗3次晾干后用解剖刀縱向切開果實(shí)，將種子均勻撒于種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，在25℃條件進(jìn)行暗培養(yǎng)120天后種子開始萌發(fā)，萌發(fā)率為71.6％。當(dāng)種子苗長(zhǎng)至1～2cm高時(shí)轉(zhuǎn)接至壯苗培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為25℃，光照強(qiáng)度為1500lx條件下進(jìn)行生根壯苗培養(yǎng)。待試管苗長(zhǎng)至5～8cm并具有2條以上根時(shí)，將培養(yǎng)瓶蓋子打開在室外無直射光的地方放置3天后取出試管苗，對(duì)試管苗采用根尖直接壓片法制片后于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，篩選多倍體植株，多倍體發(fā)生率為2.98％，其中以三倍體和四倍體為主。將篩選得到的多倍體植株移栽于體積比為2:2:1的樹皮、蘭石、泥巖的混合基質(zhì)中栽培成苗即得金線蓮多倍體資源。

步驟(3)和(7)所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基為：1/2MS+0.2mg/LNAA+20g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+50ml/L椰子汁，pH為5.4；

步驟(3)和(7)所述的壯苗培養(yǎng)基為：1.0g/L花寶1號(hào)(HYPONeX1)+0.3mg/LNAA+25g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+50g/L香蕉汁+0.2g/L活性炭，pH為5.4。

實(shí)施例二

(1)親本選配：在溫室中選取生長(zhǎng)健壯的臺(tái)灣產(chǎn)金線蓮(Anoectochilusroxburghii)作母本，廣東產(chǎn)血葉蘭(Ludisiadiscolor)作為父本。

(2)遠(yuǎn)緣雜交：將步驟(1)的親本進(jìn)行精心栽培管理，待親本開花時(shí)用鑷子取出金線蓮當(dāng)天開花花朵中的花粉塊，將血葉蘭的花粉塊授于金線蓮的蕊腔中。授粉3～4個(gè)月后，結(jié)實(shí)率為38.9％。

(3)雜種群體構(gòu)建：采收步驟(2)遠(yuǎn)緣雜交獲得的成熟果實(shí)于自來水沖洗15min后，用75％的乙醇浸泡25s后置于0.1％的升汞溶液中消毒18min，無菌水沖洗4次晾干后用解剖刀縱向切開果實(shí)，將種子均勻撒于種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，在26℃條件進(jìn)行暗培養(yǎng)120天后種子開始萌發(fā)，萌發(fā)率為39.6％。當(dāng)種子苗長(zhǎng)至1～2cm高時(shí)轉(zhuǎn)接至壯苗培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為26℃，光照強(qiáng)度為1800lx條件下進(jìn)行生根壯苗培養(yǎng)。待試管苗長(zhǎng)至5～8cm并具有2條以上根時(shí)，將培養(yǎng)瓶蓋子打開在室外無直射光的地方放置4天后取出試管苗移栽于體積比為2:2:1的樹皮、蘭石、泥巖的混合基質(zhì)中，試管苗移栽后精心管理直至植株開花。

(4)2n配子的鑒定：待步驟(3)的植株開花后，采集植株新鮮成熟的花粉，采用直接壓片法制片后于光學(xué)顯微鏡下觀察2n花粉，統(tǒng)計(jì)2n花粉的發(fā)生頻率。雜交后代的2n配子發(fā)生率最高達(dá)到1.56％。

(5)2n配子雜種后代的篩選：對(duì)經(jīng)步驟(4)鑒定的2n花粉發(fā)生率大于1％的植株進(jìn)行分盆栽培，并經(jīng)兩年以上重復(fù)鑒定，篩選出發(fā)生率高且穩(wěn)定的植株即為2n配子雜種后代。

(6)2n配子雜種后代自交：對(duì)步驟(5)獲得的2n配子雜種后代進(jìn)行精心栽培管理，待植株開花后使其自然授粉。授粉3～4個(gè)月后，結(jié)實(shí)率為43.9％。

(7)多倍體資源的獲得：采收步驟(6)自交獲得的成熟果實(shí)于自來水沖洗15min后，用75％的乙醇浸泡30s后置于0.1％的升汞溶液中消毒20min，無菌水沖洗5次晾干后用解剖刀縱向切開果實(shí)，將種子均勻撒于種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，在25℃條件進(jìn)行暗培養(yǎng)120天后種子開始萌發(fā)，萌發(fā)率為57.1％。當(dāng)種子苗長(zhǎng)至1～2cm高時(shí)轉(zhuǎn)接至壯苗培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為26℃，光照強(qiáng)度為1800lx條件下進(jìn)行生根壯苗培養(yǎng)。待試管苗長(zhǎng)至5～8cm并具有2條以上根時(shí)，將培養(yǎng)瓶蓋子打開在室外無直射光的地方放置5天后取出試管苗，對(duì)試管苗采用根尖直接壓片法制片后于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，篩選多倍體植株，多倍體發(fā)生率為1.38％，其中以三倍體和四倍體為主。將篩選得到的多倍體植株移栽于體積比為2:2:1的樹皮、蘭石、泥巖的混合基質(zhì)中栽培成苗即得金線蓮多倍體資源。

步驟(3)和(7)所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基為：1/2MS+0.6mg/LNAA+25g/L蔗糖+3.5g/L瓊脂+80ml/L椰子汁，pH為5.6；

步驟(3)和(7)所述的壯苗培養(yǎng)基為：1.5g/L花寶1號(hào)(HYPONeX1)+0.5mg/LNAA+30g/L蔗糖+4.5g/L瓊脂+70g/L香蕉汁+0.3g/L活性炭，pH為5.6。

實(shí)施例三

(1)親本選配：在溫室中選取生長(zhǎng)健壯的江西產(chǎn)金線蓮(Anoectochilusroxburghii)作母本，越南產(chǎn)血葉蘭(Ludisiadiscolor)作為父本。

(2)遠(yuǎn)緣雜交：將步驟(1)的親本進(jìn)行精心栽培管理，待親本開花時(shí)用鑷子取出金線蓮當(dāng)天開花花朵中的花粉塊，將血葉蘭的花粉塊授于金線蓮的蕊腔中。授粉3～4個(gè)月后，結(jié)實(shí)率為60.7％。

(3)雜種群體構(gòu)建：采收步驟(2)遠(yuǎn)緣雜交獲得的成熟果實(shí)于自來水沖洗20min后，用75％的乙醇浸泡30s后置于0.1％的升汞溶液中消毒25min，無菌水沖洗5次晾干后用解剖刀縱向切開果實(shí)，將種子均勻撒于種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，在26℃條件進(jìn)行暗培養(yǎng)120天后種子開始萌發(fā)，萌發(fā)率為50.1％。當(dāng)種子苗長(zhǎng)至1～2cm高時(shí)轉(zhuǎn)接至壯苗培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為28℃，光照強(qiáng)度為2000lx條件下進(jìn)行生根壯苗培養(yǎng)。待試管苗長(zhǎng)至5～8cm并具有2條以上根時(shí)，將培養(yǎng)瓶蓋子打開在室外無直射光的地方放置5天后取出試管苗移栽于體積比為2:2:1的樹皮、蘭石、泥巖的混合基質(zhì)中，試管苗移栽后精心管理直至植株開花。

(4)2n配子的鑒定：待步驟(3)的植株開花后，采集植株新鮮成熟的花粉，采用直接壓片法制片后于光學(xué)顯微鏡下觀察2n花粉，統(tǒng)計(jì)2n花粉的發(fā)生頻率。雜交后代的2n配子發(fā)生率最高達(dá)到2.64％。

(5)2n配子雜種后代的篩選：對(duì)經(jīng)步驟(4)鑒定的2n花粉發(fā)生率大于1％的植株進(jìn)行分盆栽培，并經(jīng)兩年以上重復(fù)鑒定，篩選出發(fā)生率高且穩(wěn)定的植株即為2n配子雜種后代。

(6)2n配子雜種后代自交：對(duì)步驟(5)獲得的2n配子雜種后代進(jìn)行精心栽培管理，待植株開花后使其自然授粉。授粉3～4個(gè)月后，結(jié)實(shí)率為63.8％。

(7)多倍體資源的獲得：采收步驟(6)自交獲得的成熟果實(shí)于自來水沖洗20min后，用75％的乙醇浸泡30s后置于0.1％的升汞溶液中消毒30min，無菌水沖洗5次晾干后用解剖刀縱向切開果實(shí)，將種子均勻撒于種子萌發(fā)培養(yǎng)基中，在25℃條件進(jìn)行暗培養(yǎng)120天后種子開始萌發(fā)，萌發(fā)率為43.9％。當(dāng)種子苗長(zhǎng)至1～2cm高時(shí)轉(zhuǎn)接至壯苗培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)溫度為28℃，光照強(qiáng)度為1800lx條件下進(jìn)行生根壯苗培養(yǎng)。待試管苗長(zhǎng)至5～8cm并具有2條以上根時(shí)，將培養(yǎng)瓶蓋子打開在室外無直射光的地方放置5天后取出試管苗，對(duì)試管苗采用根尖直接壓片法制片后于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)，篩選多倍體植株，多倍體發(fā)生率為2.09％，其中以三倍體和四倍體為主。將篩選得到的多倍體植株移栽于體積比為2:2:1的樹皮、蘭石、泥巖的混合基質(zhì)中栽培成苗即得金線蓮多倍體資源。

步驟(3)和(7)所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基為：1/2MS+1.0mg/LNAA+30g/L蔗糖+5.0g/L瓊脂+100ml/L椰子汁，pH為5.8；

步驟(3)和(7)所述的壯苗培養(yǎng)基為：2.0g/L花寶1號(hào)(HYPONeX1)+1.0mg/LNAA+30g/L蔗糖+5.5g/L瓊脂+100g/L香蕉汁+0.3g/L活性炭，pH為5.8。

以上所述的僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡在本發(fā)明的精神和原則范圍內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。